周潤(rùn)澤，王翊豪，周玉厚，朱靈英，鄭國(guó)偉，馬曉惠，季鵬章，徐福榮

(云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen]為五加科人參屬植物，使用其根和根莖供臨床使用[1]。主產(chǎn)地為中國(guó)云南、廣西等省(區(qū))，云南文山是三七的道地產(chǎn)區(qū)，文山州的低緯高原生態(tài)環(huán)境是形成文山三七道地性的決定因素[2]。自古以來(lái)三七被普遍應(yīng)用在多種方劑中，如復(fù)方丹參丸、地奧心血康、云南白藥等。近年來(lái)，三七除應(yīng)用在醫(yī)藥行業(yè)外，也被廣泛用于化妝品和保健品，每年對(duì)三七的需求量達(dá)到8000 t[3]。當(dāng)前文山州三七種植面積和產(chǎn)量占全國(guó)的98 %，受三七連作障礙的影響，目前三七面臨著無(wú)地可種的難題，逐漸從海拔1200～2000 m的地區(qū)向更高海拔、高緯度的低溫地區(qū)引種，造成其種植帶逐漸向以冬春季極端低溫和易持續(xù)低溫天氣為主的北方轉(zhuǎn)移[4-6]。提高三七的皂苷含量和三七無(wú)地可種所造成的種植帶轉(zhuǎn)移是現(xiàn)階段所面臨的主要問(wèn)題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】三七對(duì)溫度、光照、濕度、土壤等生態(tài)因子十分敏感，生態(tài)適應(yīng)性差，研究表明環(huán)境對(duì)三七的生長(zhǎng)發(fā)育及皂苷積累有重要影響[7]。生長(zhǎng)/分化平衡(Growth/differentiation balance，GDB)假說(shuō)、最佳防御(Optimun defense，OD)假說(shuō)和資源獲得(Resource availability，RA)假說(shuō)中均表明當(dāng)植物處于環(huán)境脅迫時(shí)，其自身次生代謝產(chǎn)物會(huì)增加[8-9]。次生代謝產(chǎn)物是中藥中的主要成分，皂苷是三七主要的次生代謝產(chǎn)物，含量約占三七塊根的10 %～12 %[10-11]。溫度可影響藥用植物的光合作用、呼吸作用等生理功能，造成植物體內(nèi)的有效成分的形成和積累[12]。Oh[13]和劉佳[14]等研究顯示低溫脅迫可顯著增加人參中的總皂苷含量。【本研究切入點(diǎn)】隨著生物醫(yī)藥和大健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，三七的需求量迅猛增加，導(dǎo)致當(dāng)前三七種植地逐漸向非道地產(chǎn)區(qū)外移，然而，有關(guān)不同溫度對(duì)三七植株不同部位皂苷積累的影響鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究針對(duì)即將采收的3年生三七，采用人工氣候，設(shè)置不同溫度梯度培養(yǎng)30 d，分別對(duì)三七的主根、剪口、莖和葉4個(gè)部位進(jìn)行皂苷含量分析，預(yù)期闡明不同溫度對(duì)三七不同部位皂苷含量的影響，為三七引種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2018年8月12日采自文山州硯山縣三七種植基地，選取生長(zhǎng)正常、長(zhǎng)勢(shì)一致的3年生三七(Panaxnotoginseng)。對(duì)照品為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd(HPLC ≥98 %，北京索萊寶科技有限公司)；甲醇(色譜純，SIGMA，USA)；HPLC(型號(hào)Agilent1260Ⅱ，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將盆栽的3年生三七分別置于10、15和20 ℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)30 d，每個(gè)處理6株。同時(shí)，在基地選取12株生長(zhǎng)基本一致的三七作為對(duì)照，其中6株于9月12日采收，作為人工氣候室溫度處理的對(duì)照材料(CK)，另外6株11月12日采收(采收期組)，用于比較不同采收期三七的皂苷含量。

將不同溫度處理后的3年生三七，以及生長(zhǎng)在基地的3年生三七各6株，去泥洗凈。將清洗后三七的主根、剪口、莖和葉4個(gè)部分分別置于烘箱內(nèi)，在40 ℃下將樣品烘干至恒重并研磨成粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取主根、剪口、莖和葉粉末各0.1 g，置于試管內(nèi)，用甲醇進(jìn)行溶解，超聲振蕩提取1 h，靜置10 min后，用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，所得濾液為供試品。

將對(duì)照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd混合，加甲醇定容到10 mL。

利用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，并參照2015版藥典有關(guān)三七質(zhì)量檢測(cè)的方法[15]。根據(jù)對(duì)照品溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)三七主根中皂苷含量的影響

從表1可知，三七皂苷R1等4種皂苷成分，只有人參皂苷Rg1在不同溫度處理間差異顯著，以20 ℃含量為最高，依次為20 ℃(4.4380 %)> 10 ℃(4.3500 %)> 15 ℃(3.3721 %)> CK(3.0762 %)。三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd各處理間均未呈顯著差異。其中，三七皂苷R1以15 ℃最高，為1.1356 %；人參皂苷Rb1以20 ℃最高，為3.6175 %；人參皂苷Rd以20 ℃最高，為1.1098 %。三七總皂苷含量亦以20 ℃最高，且20 ℃與15 ℃和10 ℃呈顯著差異，20 ℃與CK呈極顯著差異，其含量依次為20 ℃(10.1506 %)> 10 ℃(9.2027 %)> 15 ℃(8.4686 %)> CK(7.5603 %)。綜上表明，20 ℃有利于主根中皂苷含量的積累，其差異主要來(lái)源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。

表1 不同溫度下3年生三七主根中皂苷含量

注：同一行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示0.05水平上，下同。

Note: Data following by small letters in the same line meant significant difference at 0.05 level.The same as below.

表2 不同溫度下3年生三七剪口中皂苷含量

2.2 不同溫度對(duì)三七剪口中皂苷含量的影響

從表2可知，剪口中三七皂苷R1等4種皂苷含量在不同溫度處理間均未呈顯著差異。三七皂苷R1以15 ℃最高，為1.9046 %；人參皂苷Rg1以20 ℃最高，為6.7542 %；人參皂苷Rb1以15 ℃最高，為4.7827 %；人參皂苷Rd以15 ℃最高，為1.7422 %。剪口中三七總皂苷含量在不同溫度下差異不顯著，以15 ℃最高，為14.2905 %。

2.3 不同溫度對(duì)三七莖中皂苷含量的影響

從表3可知，莖中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量極低，通過(guò)HPLC并未檢測(cè)出。人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd在不同溫度處理間均未呈現(xiàn)顯著差異；人參皂苷Rb1以CK最高，為0.2895 %；人參皂苷Rd以CK最高，為0.1340 %。莖中三七皂苷亦未呈現(xiàn)顯著差異，其含量為0.4235 %。綜上表明，三七莖中皂苷含量在不同溫度下差異不顯著，以CK的皂苷含量為最高。

2.4 不同溫度對(duì)三七葉中皂苷含量的影響

從表4可知，葉中三七皂苷R1通過(guò)HPLC未檢出，同時(shí)CK組葉中未檢出人參皂苷Rg1。葉中人參皂苷Rb1存在顯著差異，以15 ℃含量最高，20 ℃最低，依次為15 ℃(0.2510 %)>CK(0.2470 %)>10 ℃(01939 %)>20 ℃(0.1199 %)；人參皂苷Rd亦存在顯著差異，以CK含量最高，20 ℃為最低，依次為CK(0.0430 %)>15 ℃(0.0350 %)>10 ℃(0.0321 %)>20 ℃(0.0169 %)；人參皂苷Rg1未呈顯著差異，以15 ℃下含量最高，為0.1573 %；三七總皂苷含量以15 ℃為最高，與CK和10 ℃差異不顯著，與20 ℃差異顯著，依次為15 ℃(0.4433 %)>10 ℃(0.3243 %)>CK(0.2900 %)>20 ℃(0.1957 %)。綜上表明，15 ℃有利于葉中皂苷的積累，其差異主要來(lái)源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。

表3 不同溫度下3年生三七莖中皂苷的含量

表4 不同溫度下3年生三七葉中皂苷的含量

圖1 采收期與對(duì)照組三七主根總皂苷含量分析Fig.1 Content analysis of total saponins in main root of P. notoginseng during harvest and non-harvest period

2.5 不同采收時(shí)期三七主根及剪口中皂苷含量分析

從圖1可知，三七皂苷R1：采收期(1.1901 %)> CK(0.9616 %)，高出23.76 %；人參皂苷Rg1：采收期(3.9943 %)> CK(3.0762 %)，高出29.85 %；人參皂苷Rb1：CK(2.6583 %)> 采收期(2.3375 %)，高出13.72 %；人參皂苷Rd：CK(0.8642 %)> 采收期(0.7579 %)，高出14.03 %；總皂苷：采收期(8.2798 %)> CK(7.5603 %)，高出9.52 %。

從圖2可知，三七皂苷R1：采收期(1.9022 %)> CK(1.8720 %)，高出1.61 %；人參皂苷Rg1：采收期(6.9168 %)> CK(4.9553 %)，高出39.58 %；人參皂苷Rb1：CK(4.4511 %)> 采收期(3.7765 %)，高出17.86 %；人參皂苷Rd：CK(1.5352 %)>采收期(1.5129 %)，高出1.47 %；總皂苷：采收(14.1085 %)> CK(12.8136 %)，高出10.11 %。

三七皂苷R1與人參皂苷Rg1含量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，人參皂苷Rb1與人參皂苷Rd含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但三七總皂苷含量依然是采收期高于提早采收的CK組。因此，三七需適時(shí)采收，不宜提早采收。

3 討 論

本研究選取同一產(chǎn)地的3年生三七，對(duì)不同溫度處理下的三七主根、剪口、莖和葉的三七皂苷含量積累情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同溫度下的三七主根和葉中的皂苷含量存在差異，但剪口和莖對(duì)溫度不敏感。

圖2 采收期與對(duì)照組三七剪口總皂苷含量分析Fig.2 Content analysis of total saponins in rhizome of P. notoginseng during harvest and non-harvest period

研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)處理溫度下，三七主根三七總皂苷含量以20 ℃時(shí)最高，15和10 ℃三七總皂苷含量也均高于對(duì)照組。剪口中的三七總皂苷含量以15 ℃時(shí)最高，20和10 ℃時(shí)，其所含三七總皂苷也均高于對(duì)照組。這與黃璐琦[16]提出的中藥材逆境效應(yīng)相呼應(yīng)，一定的低溫有利于三七地下部分三七總皂苷的積累。在4個(gè)溫度下，均呈現(xiàn)人參皂苷Rg1>人參皂苷Rb1>三七皂苷R1，與朱潔[17]等研究結(jié)果和分析一致。同時(shí)，20和10 ℃的主根和剪口均為三七皂苷R1>人參皂苷Rd。綜上，一定的低溫可促進(jìn)三七總皂苷的積累，但不同的溫度對(duì)不同的皂苷積累仍存在差異。

研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)處理溫度下，3年生三七的莖中測(cè)定到的成分為人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd，劉英等[18]研究三七的地上部分主要以20(S)-原人參皂苷二醇型為主與此結(jié)果相一致。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得4種皂苷以人參皂苷Rb1含量最高，白敏等[19]研究也有此結(jié)論。三七莖與三七主根皂苷的主要區(qū)別在于三七莖中主要含有人參二醇型皂苷[20]。通過(guò)分析對(duì)照組莖中三七總皂苷高于低溫處理的，這表明低溫會(huì)減緩三七莖的生長(zhǎng)。

4個(gè)溫度處理，15 ℃時(shí)三七葉中所含三七總皂苷含量最高，20 ℃時(shí)最低。在15 ℃其葉中所含三七皂苷含量高，或與低溫可誘導(dǎo)葉中花色苷合成有關(guān)[21]，低溫不僅可誘導(dǎo)花色苷的合成，并可增加葉中皂苷含量。葉中三七總皂苷以人參皂苷Rb1較多，并測(cè)得人參皂苷Rg1和人參皂苷Rd。朱潔[17、22]等，利用HPLC-UV測(cè)定三七葉，檢測(cè)到人參皂苷Rb3、Rc、Rb1和Rd，與本研究中測(cè)得人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd相符。

采收期的三七皂苷總含量高于對(duì)照，采收期與對(duì)照的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的總量分別為采收期(8.18 %)>對(duì)照(7.59 %)，均高于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中要求的5 %[15]。崔秀明等[23]研究發(fā)現(xiàn)，采收期的三七主根與剪口皂苷含量均高于非采收期的三七，與本研究所得結(jié)論相一致。

4 結(jié) 論

剪口對(duì)溫度不敏感，20 ℃有利于主根中皂苷含量的積累，其差異主要來(lái)源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。莖對(duì)溫度不敏感，15 ℃有利于葉中皂苷的積累，其差異主要來(lái)源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。選擇三七適宜的采收期有利于總皂苷的積累，其主要來(lái)源于三七皂苷R1與人參皂苷Rg1含量差異。