黃 彧， 劉春明*， 吳 桐， 王樂奇， 侯萬超， 李賽男

(長春師范大學(xué)中心實驗室，吉林長春 130032)

肝臟是機(jī)體中參與代謝藥物的重要器官，它含有大量與藥物代謝密切相關(guān)的重要酶系。其中，最重要的Ⅰ相反應(yīng)酶是細(xì)胞色素P450酶(CYP450)，人體內(nèi)幾乎70%的藥物由其代謝[1]。大量研究表明，CYP450亞型酶對藥物的代謝顯示出特異性，這使得我們可以根據(jù)CYP450亞型酶的特異性抑制劑來確定藥物的代謝途徑。由于許多藥物的相互作用是通過提供藥物誘導(dǎo)或抑制CYP450酶的活性，使其它藥物的代謝增強(qiáng)或減弱所導(dǎo)致的，所以了解藥物在CYP450酶中的代謝情況，并確定對應(yīng)的代謝酶亞型顯得非常重要[2]。

厚樸對食積氣滯、腹脹便秘等疾病有治療作用[3]。在2015年版《中國藥典》中有近100種中藥制劑配方是將其作為主要成分的，例如小兒瀉痢片、小兒豉翹清熱顆粒、木香順氣丸等[4]。厚樸樹皮中含木脂體類化合物厚樸酚(Magnolol)、和厚樸酚(Honokiol)等，還有單萜木脂體類化合物、生物堿、揮發(fā)油等，而它的主要藥理活性成分是厚樸酚、和厚樸酚[5]。有研究表明厚樸酚可能是預(yù)防骨質(zhì)紊亂如骨質(zhì)疏松癥的候選藥物[6]。厚樸及厚樸中的兩種藥效成分厚樸酚與和厚樸酚對羥自由基和過氧化氫有清除作用，并且相對于厚樸酚、和厚樸的抗氧化能力更強(qiáng)[7]。王俊俊通過和厚樸酚能夠降低大鼠Ⅱ型糖尿病模型的血糖血脂、增強(qiáng)肝臟抗氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)了和厚樸酚具有抗糖尿病的效果[8]。和厚樸酚還可以通過阻止丙型肝炎病毒(HCV)細(xì)胞的侵入和復(fù)制而抑制HCV的傳播，是治療丙型肝炎的潛在藥物[9]。在抗菌方面，有報道證明厚樸酚與和厚樸酚的聯(lián)用對體外耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有效[10]。關(guān)于厚樸酚與和厚樸酚藥效作用的研究比較豐富，但在CYP450亞型酶(CYP1A2，2C9，2C19，2D6，2E1和3A4)中代謝機(jī)理的研究還沒見相關(guān)的報道。本文系統(tǒng)地研究了厚樸酚與和厚樸酚在大鼠肝微粒體(RLMs)中的體外代謝[11]，并應(yīng)用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)分析鑒定了主要代謝物。通過使用特異性抑制劑鑒定了指導(dǎo)厚樸酚與和厚樸酚在大鼠肝微粒體中代謝的CYP450亞型酶。本研究旨在為厚樸酚與和厚樸酚體外代謝的進(jìn)一步研究及臨床合理化用藥提供新的實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀(德國，Thermo Fisher Scientific)，配置在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器；Thermo Scientific Q Extractive 質(zhì)譜儀(德國，Thermo Scientific)；Xcalibur 3.2軟件；Sanorius BSl10S 分析天平(德國，Sanorius)；Sigma 1-14離心機(jī)(德國，Sigma)；DW-86L486型超低溫冰箱(中國Haier公司)。

厚樸酚、和厚樸酚(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：KS0912CB14，T28O6B5149)。槲皮素、α-萘黃酮、奎尼定、氯美噻唑、花椒毒素、噻氯匹定、酮康唑(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號分別為：83N2O-AR，UEESA-IH，WEODL-RE，WBHWE-F8，7OMXF-TL，RH58M-OI,ZJUZI-PM)。NADPH再生系統(tǒng)和磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(Solarbio公司，批號分別為：721L023，20161212)。色譜純甲醇、乙腈以及甲酸(美國Fisher Scientific公司)。實驗用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 動物

雄性SD大鼠(混合)肝微粒體購自瑞德肝臟疾病研究所(上海)有限公司，蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL(批號：JPXY)。

1.3 實驗方法

1.3.1厚樸酚與和厚樸酚的體外代謝150 μL酶反應(yīng)系統(tǒng)[12]，含有0.5 mg/mL肝微粒體蛋白，100 mmol/L PBS(pH=7.4)，NADPH再生系統(tǒng)(終濃度為3.3 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1.3 mmol/L NADP+，0.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和3.3 mmol/L MgCl2)以及10 μL厚樸酚、和厚樸酚(終濃度為50 mmol/L)。RLMs與厚樸酚、和厚樸酚在37 ℃下預(yù)溫育5 min后，通過加入NADPH再生系統(tǒng)啟動反應(yīng)。37 ℃孵育90 min。

1.3.2厚樸酚與和厚樸酚代謝酶亞型的特異性抑制劑探針法利用CYP450亞型酶的特異性抑制劑來確定厚樸酚與和厚樸酚的CYP450代謝酶亞型[13]。抑制劑濃度及其靶點具體如下：0.01 mmol/L槲皮素(CYP2C)，0.02 mmol/L花椒毒素(CYP2A6)，0.02 mmol/L奎尼定(CYP2D6)，0.02 mmol/L氯美噻唑(CYP2E1)，0.01 mmol/L酮康唑(CYP3A)，0.025 mmol/Lα-萘黃酮(CYP1A2)，0.02 mmol/L噻氯匹定(CYP2B6)[8 - 11]。這些化合物用于分析厚樸酚與和厚樸酚在RLMs中的代謝途徑。

將用于溶解厚樸酚、和厚樸酚的溶劑的孵育溶液(甲醇)用作陰性對照[14]，將上述特定抑制劑用作陽性對照。其他孵育條件與“1.3.1”部分中描述相同。比較代謝物含量的變化。

1.3.3樣品處理加入150 μL冰乙腈溶液終止反應(yīng)。渦旋樣品，4 ℃、13 000 r/min離心10 min。上清液供UPLC-HRMS分析。

1.3.4色譜和質(zhì)譜條件使用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(100×2.1 mm，1.7 μm)分離厚樸酚、和厚樸酚以及代謝產(chǎn)物。流動相由0.1%甲酸(A)和乙腈(B)組成。線性梯度洗脫程序：0～5 min，5%B；5～8 min，5%～30%B；8～15 min，30%～52%B；15～20 min，52%～72%B。柱溫：20 ℃。采用全掃描和選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)方式鑒定：噴霧電壓設(shè)定為-4.5 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃，鞘氣壓為35 psi，輔助氣壓為10 psi。使用以下參數(shù)進(jìn)行一級質(zhì)譜(MS)和二級串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)數(shù)據(jù)采集：分辨率17 500，碎裂電壓NCE為30，掃描范圍m/z100～1 200。

2 結(jié)果與討論

2.1 厚樸酚代謝產(chǎn)物及代謝途徑的確定

使用UPLC-HRMS分析CYP450反應(yīng)體系中厚樸酚的代謝產(chǎn)物，與空白滅活的CYP450反應(yīng)體系相比，在總離子流圖中發(fā)現(xiàn)了5個明顯的新增質(zhì)譜峰。原型化合物厚樸酚及其代謝產(chǎn)物的MS2數(shù)據(jù)見表1。其中，厚樸酚的保留時間tR為18.27 min，分子離子峰[M-H]-(m/z=265.1235)。MS2中產(chǎn)生了m/z=247.1127的碎片離子和一個水分子碎片離子，這與Li等[15]的報道一致。

表1 厚樸酚及其主要代謝物的UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)

圖1 厚樸酚代謝產(chǎn)物M1的質(zhì)譜碎裂機(jī)理Fig.1 Mechanism of mass spectrometry fragmentation of Magnolol metabolite M1

代謝產(chǎn)物M1準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z295.0977，保留時間tR為11.22 min，結(jié)合厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測其為厚樸酚端位烯烴氧化產(chǎn)物。它在MS2中產(chǎn)生m/z277.0871、251.1078、233.0972、231.0812、209.0608等碎片離子，它們分別為代謝產(chǎn)物M1脫去一分子水；脫去一分子水、一個羰基以及發(fā)生了加氫還原；脫去兩個羥基和一個羰基；脫去兩分子水和一個羰基；脫去一個丙烯基、一個羰基以及一分子水。MS碎裂過程如圖1所示，MS2如圖2(a)所示。代謝產(chǎn)物M2準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z299.1291，保留時間tR為11.78 min。結(jié)合厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測是厚樸酚的末端雙鍵單氧化和單羥基化產(chǎn)物。這在MS2中產(chǎn)生了m/z239.1075、221.0968、133.0646和93.0331碎片離子，分別是代謝產(chǎn)物M2損失了兩個羥基；丟掉了兩個羰基和一個水分子；去掉了兩個羰基，一個水分子和環(huán)斷裂；去掉了兩個羰基，一個水分子，一個丙烯基團(tuán)，并發(fā)生了環(huán)斷裂。MS2如圖2(b)所示。代謝產(chǎn)物M3分子離子[M-H]-(m/z=281.1184)的保留時間tR為13.55 min，推測可能是厚樸酚苯環(huán)單羥基化產(chǎn)物。在MS2中產(chǎn)生m/z263.1079、245.0970、133.0646等碎片離子，分別為代謝產(chǎn)物M3丟失一分子水；丟失兩分子水；丟掉一分子水并發(fā)生環(huán)中裂。MS2如圖2(c)所示。代謝產(chǎn)物M4準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z279.103，保留時間tR為14.91 min，結(jié)合厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測是厚樸酚端位烯烴發(fā)生了氧化反應(yīng)。它在MS2中產(chǎn)生m/z261.092、233.0968、209.0601等碎片離子，它們?yōu)榇x產(chǎn)物M4分別脫去一分子水；脫去一分子水及羰基；脫去一分子水以及發(fā)生環(huán)中裂。其MS2圖見圖2(d)。代謝產(chǎn)物M5準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z285.1502，保留時間tR為17.89 min，結(jié)合厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測其為厚樸酚末端雙鍵單羥基化和苯環(huán)單羥基化產(chǎn)物。它在MS2中產(chǎn)生m/z267.1967、223.2063等碎片離子，它們分別為代謝產(chǎn)物M5脫去一分子水；脫去一分子水和羰基。其MS2圖見圖2(e)。

圖2 厚樸酚代謝產(chǎn)物二級質(zhì)譜圖 Fig.2 Secondary cascade mass spectrometry of Magnolol metabolites (a)M1;(b)M2;(c)M3;(d)M4;(e)M5.

2.2 和厚樸酚代謝產(chǎn)物及代謝途徑的確定

使用UPLC-HRMS分析了和厚樸酚在CYP450反應(yīng)體系中的代謝產(chǎn)物，與空白滅活的CYP450反應(yīng)體系比較，在總離子流圖中主要發(fā)現(xiàn)四個新增質(zhì)譜峰(圖略)。原型化合物和厚樸酚以及各代謝產(chǎn)物對應(yīng)的二級串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表2中。其中和厚樸酚，保留時間tR為31.62 min，化合物準(zhǔn)分子離子[M-H]-(m/z=265.1235)。它在MS2中產(chǎn)生m/z237.1285和224.0838碎片離子，它們分別代表和厚樸酚的去羰基化以及和厚樸酚的丙烯基碎片離子去質(zhì)子化，這與Li等[15]報道一致。

表2 和厚樸酚及其主要代謝物的UPLC-MS/MS數(shù)據(jù)

圖3 和厚樸酚代謝物M1的質(zhì)譜碎裂機(jī)理Fig.3 Mass spectrometry fragmentation mechanism of Honokiol metabolite M1

代謝產(chǎn)物M1準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z295.0977，保留時間tR為17.44 min，結(jié)合和厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測其為和厚樸酚端位單羥基化產(chǎn)物。它在MS2中產(chǎn)生m/z267.0664、254.0584、251.0711等碎片離子，它們是代謝產(chǎn)物M1分別脫去一個乙烯基；脫去一個乙烯基及一分子水；脫去丙烯基。質(zhì)譜碎裂過程如圖3所示。代謝產(chǎn)物M2準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z279.1026，保留時間tR為20.07 min，結(jié)合和厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測其為和厚樸酚端位烯烴氧化產(chǎn)物。它在MS2中產(chǎn)生m/z265.0870、251.0712、237.0554、210.0680碎片離子，它們是代謝產(chǎn)物M2分別脫去一個亞甲基；脫去一個乙烯基；脫去一個丙烯基；脫去一個丙烯基以及一個羰基。代謝產(chǎn)物M3準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z257.1759，保留時間tR為25.57 min，結(jié)合和厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測其為和厚樸酚發(fā)生單羥基化以及加氫還原反應(yīng)。它在MS2中產(chǎn)生m/z239.1651、195.1747等碎片離子，它們分別為代謝產(chǎn)物M3脫去一分子水；脫去一個羰基及兩個羥基。代謝產(chǎn)物M4準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z285.2075，保留時間tR為32.40 min，結(jié)合和厚樸酚結(jié)構(gòu)，推測其為和厚樸酚發(fā)生羥基化和加氫還原反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。它在MS2中產(chǎn)生m/z267.1968、223.2064等碎片離子，它們分別為代謝產(chǎn)物M4脫去一分子水；脫去一個羰基及兩個羥基。

2.3 參與厚樸酚與和厚樸酚I期代謝的CYP450亞型酶

確定藥物的代謝途徑對了解藥-藥相互作用是至關(guān)重要的。大量結(jié)果表明抑制CYP450亞型酶的活性會減少代謝物的形成，CYP450的特異性抑制劑被確定為檢測CYP450代謝途徑的有力工具。因此，在RLMs反應(yīng)系統(tǒng)中分別進(jìn)行CYP2C，2A6，2D6，2E1，3A4，1A2和2B6亞型酶介導(dǎo)的化學(xué)抑制測定。在存在或不存在CYP450亞型酶特異性抑制劑的情況下，將底物加入RLMs中預(yù)孵育30 min。將對照組(無抑制劑)產(chǎn)物的峰面積定義為100%活性，并與用抑制劑處理的樣品進(jìn)行比較。在CYP450特異性抑制劑的作用下，觀察代謝物的產(chǎn)量降低，表明該CYP450亞型酶催化該產(chǎn)物的產(chǎn)生。

圖4 CYP450亞型酶的特異性抑制劑對CYP450中厚樸酚代謝物產(chǎn)生率的影響Fig.4 Effects of specific inhibitors of CYP450 subtypes enzymes on the metabolite production rates of Magnolol in CYP450 Blank control without inhibitor.All values are the mean±SEM of three determinations(n=3).Bar graph from left to right:

厚樸酚在大鼠肝微粒體中有5種主要代謝物，對其進(jìn)行代謝途徑的探究。通過特異性抑制劑對CYP450代謝物產(chǎn)率的影響(圖4)可以看出，CYP2C抑制劑僅抑制M1產(chǎn)物的形成；CYP2A6抑制劑僅抑制M2產(chǎn)物的形成；CYP2E1抑制劑抑制M1、M2和M3產(chǎn)物的形成；CYP3A4抑制劑僅抑制M1、M2和M5產(chǎn)物的形成；CYP1A2抑制劑抑制M1、M4和M5產(chǎn)物的形成；CYP2B6抑制劑僅抑制M1、M2、M4和M5產(chǎn)物的形成。而CYP1A2和CYP2E1抑制劑顯著抑制M1和M3的產(chǎn)物形成。并且，CYP2D6抑制劑對厚樸酚的5種產(chǎn)物均無抑制作用，這說明CYP2D6亞型酶可能對厚樸酚的代謝沒有指導(dǎo)作用。由CYP450亞型酶指導(dǎo)的厚樸酚代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其代謝途徑顯示于圖5中。CYP1A2和2C是厚樸酚氧化的主要代謝酶，CYP2E1是厚樸酚末端羥基化的主要代謝酶。

同理，對和厚樸酚的四種主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行探究，圖6表明：CYP2C抑制劑抑制M1、M2和M3產(chǎn)物的形成；CYP2A6和2D6抑制劑僅抑制M2的形成；CYP2E1抑制劑抑制所有產(chǎn)物的形成；CYP3A4抑制劑僅抑制M2、M3和M4產(chǎn)物的形成；CYP1A2抑制劑抑制M2、M3和M4產(chǎn)物的形成；CYP2B6抑制劑抑制所有產(chǎn)物的形成。結(jié)果說明：CYP2C可能是主導(dǎo)和厚樸酚氧化代謝的主要亞型酶，CYP1A2和2E1可能是負(fù)責(zé)將和厚樸酚轉(zhuǎn)化為羥基化和氫化代謝產(chǎn)物的主要亞型酶，CYP2B6亞型酶可能是指導(dǎo)和厚樸酚苯環(huán)羥基化代謝的主要亞型酶。由CYP450亞型酶指導(dǎo)的和厚樸酚代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其代謝途徑如圖7所示。

圖6 CYP450亞型酶的特異性抑制劑對CYP450中和厚樸酚產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of specific inhibitors of CYP450 subtypes enzymes on the production rates of Honokiol in CYP450 Blank control without inhibitor.All values are the mean±SEM of three determinations(n=3).Bar graph from left to right:

圖7 和厚樸酚在大鼠肝微粒體中可能的代謝途徑Fig.7 Possible pathways of Honokiol in rat liver microsomes

2.4 統(tǒng)計分析

CYP450亞型酶的特異性抑制劑對厚樸酚、和厚樸酚在大鼠肝微粒體中產(chǎn)物產(chǎn)率的影響，用統(tǒng)計學(xué)軟件Origin 8.0進(jìn)行統(tǒng)計，顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)用*標(biāo)記，所有值均為3次測定的平均值±SEM(n=3)。

3 結(jié)論

本文基于大鼠肝微粒體(RLMs)的體外代謝研究，將細(xì)胞色素P450(CYP450)特異性抑制劑與超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了一種高分辨率、快速準(zhǔn)確的檢測方法，系統(tǒng)地對厚樸酚、和厚樸酚在RLMs中的體外代謝情況及代謝產(chǎn)物進(jìn)行探究。雖然對于CYP450亞型酶針對不同羥基化和氧化位點的通用指導(dǎo)性還未能確定，這或許在以后的研究中可以進(jìn)一步深入探究，但該實驗仍然為進(jìn)一步研究藥物相互作用提供了重要的參考。