劉淑娟，張曉軍，李欣，劉成，白建榮，任永康，鄭軍，李世姣，郭慧娟，梅超，張樹偉，暢志堅*，喬麟軼*

(1.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原 030031；3.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，山東 濟南 250100； 4.山西省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所，山西 臨汾 041000)

中間偃麥草(Thinopyrumintermedium，2n=6x=42，JJJsJsStSt)是禾本科小麥族偃麥草屬的多年生異花授粉植物，具有長勢茂盛、適應性廣、莖葉富含蛋白等特性，在世界各地被作為優(yōu)良牧草而廣泛栽培，同時也是防風固沙、保持水土和改良鹽堿地的理想物種[1]。中間偃麥草屬于部分異源-同源六倍體，其進化過程和染色體組成較為復雜。自1936年起，研究人員先后提出了 AXY[2]、BEF[3]、E1E2X[4-5]和B2X1X2[6]等染色體結(jié)構(gòu)，目前普遍認為其組成應為JJsSt，其中 J 來自百薩偃麥草(Th.bessarabicum，2n=2x=14，JbJb)和二倍體長穗偃麥草(Th.elongatum，2n=2x=14，JeJe)，St 來自擬鵝觀草(Pseudoroegneiriastrigosa，2n=2x=14，StSt)，Js則是與St發(fā)生部分重組的J染色體組[7-12]。

由于中間偃麥草與普通小麥(Triticumaestivum，2n=6x=42，AABBDD)同為六倍體，容易與之雜交成功，且因其抗逆性強，尤其對小麥白粉病、銹病、黃矮病、黑穗病等主要病害均表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性[1,13-22]，因此成為小麥遺傳改良的重要野生資源之一。目前國內(nèi)外已將中間偃麥草諸多優(yōu)良抗性導入小麥，并利用細胞學技術(shù)鑒定出一大批小麥-中間偃麥草附加系、代換系和易位系[14-22]，其中，中間偃麥草第6同源群已被證實對小麥白粉病和條銹病免疫[16-17]。

隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記也被用于鑒定雜交材料中的外源染色體片段。Qi 等[21]利用1個 SSR 標記和3個 EST 標記鑒定出小麥抗白粉病材料 SN100109中附加了1對中間偃麥草2J 染色體；Salina等[17]利用9個 SSR 標記鑒定出小麥品系Tulaikovskaya的6D 染色體被同源的中間偃麥草6號染色體代換從而獲得了抗病性；Li 等[22]利用42個 PLUG 標記鑒定出4個小麥-中間偃麥草附加系、代換系和易位系。然而由于中間偃麥草基因組尚未完成測序，而現(xiàn)有的中間偃麥草特異分子標記很大部分來自小麥等物種[15-22]，或者是基于中間偃麥草某條染色體或染色體區(qū)段而開發(fā)的若干標記[23]，遠不能滿足鑒定需要。為此，本研究對近期公布的中間偃麥草 GBS(genotyping-by-sequencing)芯片探針序列[24]進行組裝和過濾，據(jù)此開發(fā)了一套分子標記，并對第6同源群的標記進行了篩選驗證，以期為中間偃麥草染色體的鑒定提供較為經(jīng)濟和便捷的工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中間偃麥草 Z1141、百薩偃麥草、擬鵝觀草、普通小麥農(nóng)家品種中國春、蘭花麥、白秋麥、小白芒、江西早由作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室提供；二倍體長穗偃麥草以及中國春-二倍體長穗偃麥草代換系6Je/6A、6Je/6B 和6Je/6D 由四川農(nóng)業(yè)大學馬建副研究員和山東省農(nóng)業(yè)科學院劉成副研究員惠贈；小麥-偃麥草代換系材料 F881(6St/6D)由電子科技大學楊足君教授惠贈。試驗時間為2018年3-10月。

1.2 序列組裝及過濾

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載中間偃麥草 GBS 芯片探針數(shù)據(jù)(注冊號SRX3008333)，使用 SOAPdenovo 軟件將其組裝為 Contig 序列，并去除冗余，將所獲序列與小麥中國春基因組(IWGSCv1.0，https://urgi.versailles.inra.fr/)進行比對，去除相似性大于80%的序列。

1.3 分子標記開發(fā)

對中間偃麥草Contig序列開發(fā)序列標簽位點(sequence-tagged site，STS)分子標記，用于分析擴增產(chǎn)物的有無或長短。設(shè)計引物所用的 Perl-primer 腳本程序由山西省農(nóng)業(yè)科學院王長彪副研究員惠贈，參數(shù)設(shè)置為：引物長度20 bp，產(chǎn)物長度范圍100～400 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 DNA提取及標記驗證

將試驗材料在培養(yǎng)皿中發(fā)苗，待生長至3葉期剪取葉片。采用 CTAB 法提取材料葉片的基因組總 DNA。PCR 反應總體系為10 μL：1.5 μL DNA(50 ng·μL-1), 1.0 μL Primers(50 ng·μL-1), 5.0 μL Taq PCR Mix 預混液，2.5 μL ddH2O。反應擴增程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=29∶1)中電泳后用0.1%硝酸銀染色顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間偃麥草序列組裝及標記開發(fā)

利用下載的中間偃麥草 GBS 探針序列(每條60 bp)共組裝出5877409條 Contig，長度范圍為100～3094 bp，總堿基數(shù)915311073 bp(表1)。通過信息學分析，篩選出具有染色體同源群定位信息[24]的非冗余 Contig 序列5452條，在中間偃麥草第1至第7同源群分布數(shù)目依次為704、686、877、656、893、624、1012條(圖1)。

對篩選出的5452條中間偃麥草 Contig 設(shè)計引物，共開發(fā)標記2019個，在第1至第7同源群分布數(shù)目依次為250、215、323、253、323、253和402個(圖1)。

表1 中間偃麥草GBS探針序列組裝結(jié)果Table 1 Sequence assembly for GBS probes of Th. intermedium

2.2 第6同源群標記篩選

圖1 中間偃麥草Contig序列和開發(fā)標記分布Fig.1 Distribution of Contigs and developed markers in Th. intermedium

利用5株中間偃麥草和5個小麥農(nóng)家種的 DNA 對中間偃麥草第6同源群的253個分子標記進行篩選，共有160個標記擴增出差異條帶(表2，圖2)，分布在同源群內(nèi)的 Group6 (G6)-Chr1、G6-Chr2和G6-Chr3染色體，分別有58、59和43個，其中只在中間偃麥草中具有擴增產(chǎn)物的“+/-”型特異標記共有53個，依次為32(G6-Chr1)、13(G6-Chr2)和8(G6-Chr3)個。

2.3 G6特異標記所在基因組分析

利用中間偃麥草祖先種和6Je代換系對160個 G6特異標記進行檢測，結(jié)果顯示 G6-Chr2上59個標記中有11個標記在祖先種中無擴增或無相同條帶，剩余標記在 Je基因組(二倍體長穗偃麥草、代換系 6Je/6A、6Je/6B 和6Je/6D)、Jb基因組(百薩偃麥草)和 St 基因組(擬鵝觀草)有特異性擴增條帶的數(shù)目依次為1、5和34，其中 St 特異標記占85%(圖2b，圖3)，因此推斷 G6-Chr2為中間偃麥草6St 染色體；而 G6-Chr1和 G6-Chr3上的 Je/Jb/St 基因組特異標記數(shù)目分別為10/1/18和6/4/11，暫不能確定其染色體組成。

2.4 Thi-6St特異標記用于材料驗證

選擇6St(G6-Chr2)染色體上的13個“+/-”型特異標記對代換系材料 F881(6St/6D)進行進一步驗證。這些標記在中間偃麥草中都能擴增出條帶，在 F881中能擴出11個(85%)，在中國春中則無擴增(圖4)，該結(jié)果可從分子水平上驗證代換系材料 F881中導入了6St 染色體，證實了Thi-6St 特異標記用于外源鑒定的可行性。

表2 中間偃麥草第6同源群部分特異分子標記Table 2 Parts of specific molecular markers in the sixth homo-group of Th. intermedium

圖2 第6同源群特異標記G6-Chr1-107(a)、G6-Chr2-72(b)、G6-Chr3-128(c)的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of Thi-G6 specific markers G6-Chr1-107(a), G6-Chr2-72(b) and G6-Chr3-128(c) M: 指示帶；1～5：中間偃麥草 Z1141-1～5；6～10：普通小麥農(nóng)家種蘭花麥、白秋麥、小白芒、江西早和中國春；11：百薩偃麥草；12：二倍體長穗偃麥草；13：擬鵝觀草；14～16：中國春-二倍體長穗偃麥草代換系6Je/6A、6Je/6B和6Je/6D。箭頭指示多態(tài)性條帶。M: Marker ladder; 1-5: Th. intermedium Z1141-1～5; 6-10: Wheat landraces Lanhua, Baiqiu, Xiaobaimang, Jiangxizao and Chinese spring; 11: Th. bessarabicum; 12: Th. elongatum; 13: Ps. strigosa; 14-16: Chinese spring-Th. elongatum substitution line 6Je/6A, 6Je/6B and 6Je/6D. Arrows show polymorphic bands.

圖3 第6同源群特異標記在Je/Jb/St基因組中的擴增Fig.3 Amplification of Thi-G6 specific markers in Je/Jb/St genomes圖形顏色的深淺代表數(shù)目的多少。 The shade of the color of the Wayne diagram represents the number.

圖4 “+/-”型Thi-6St特異標記在中間偃麥草Z1141(a)、小麥-偃麥草代換系F881(b)和中國春(c)中的擴增Fig.4 Amplification of “+/-” type Thi-6St specific markers in Th. intermedium Z1141 (a), wheat-Thinopyrum substitution line F881 (b) and Chinese spring (c) M: 指示帶Marker ladder；6St-7～6St-150：中間偃麥草6St染色體“+/-”型特異標記 “+/-” type specific markers on Thi-6St.

3 討論

自前蘇聯(lián)科學家Tsitsin[25]通過遠源雜交首次獲得小麥-中間偃麥草八倍體以來，利用附加系、代換系、易位系等材料將中間偃麥草的抗逆、優(yōu)質(zhì)等諸多農(nóng)藝性狀導入小麥，極大促進了小麥品種的遺傳改良。在對遠源雜交后代外源染色體的追蹤過程中，原位雜交技術(shù)是最為直觀和最有說服力的鑒定手段，但是其鑒定結(jié)果還不能精確到染色體具體位置，此外對于高代材料中的外源小片段、特別是對于隱性滲入系[26-27]尚無法鑒別，因此需要分子標記的輔助鑒定。

本研究基于組裝出的中間偃麥草基因組序列開發(fā)了一套STS標記，并從第6同源群上的253個標記中篩選出107個多態(tài)性標記，即因中間偃麥草和普通小麥基因組序列的部分同源性而擴增出不同長度產(chǎn)物的特異標記，該比例(42%)與利用小麥第6同源群SSR標記來驗證小麥-中間偃麥草間多態(tài)性的實驗結(jié)果(41%)一致[28]；另外本研究還篩選出53個只在中間偃麥草中有擴增產(chǎn)物的“+/-”型特異標記，豐富了鑒定標記的數(shù)量。分析這些特異標記所在染色體的基因組組成發(fā)現(xiàn)，G6-Chr2特異標記在擬鵝觀草中的特異性最高，因此最容易鑒定出其為6St；G6-Chr1上的標記在Je+Jb中特異的共有11個，在擬鵝觀草中特異的有18個，占62%，而 G6-Chr3上的標記在擬鵝觀草中特異的占52%，兩者無明顯差異，因此尚不能確定 G6-Chr1和 G6-Chr3的染色體組成，今后需使用中間偃麥草6Js或6J 在小麥中的附加系、代換系材料加以鑒定。6Js與6J 不易區(qū)分可能是由于中間偃麥草 Js染色體組與 J 染色體組非常相近，只在其染色體著絲粒區(qū)域包含部分 St 染色質(zhì)[7]所致，此外，Thi-G6特異標記中還有43個(27%)未能在任何一個祖先種中擴增出特異條帶，意味著中間偃麥草在由祖先種自然雜交形成多倍體后，其基因組經(jīng)歷了較深層次的重組，逐漸向新物種的方向演化，這個現(xiàn)象在自然界普遍存在[29]。

由于 J 組和 St 組是兩個麥族基礎(chǔ)基因組[13,30]，因此，中間偃麥草特異標記還可以用于鑒定含有 J 或 St染色體的其他麥族物種。利用53個“+/-”型Thi-G6特異標記對一份小麥和長穗偃麥草(2n=10x=70，JJJJJJJsJsJxJx)的代換系材料 X005(6Js/6B)[31]進行驗證，結(jié)果顯示 G6-Chr1-46、70、107和181等9個標記可以鑒定出 X005中的外源染色體6Js。本研究下一步將對其余6個同源群的分子標記進行篩選，開發(fā)整套中間偃麥草特異標記，這將為中間偃麥草甚至其他麥族近緣物種的鑒定提供較為快速和經(jīng)濟的分子檢測手段，這些標記既可用于麥族物種的分類和進化研究，也可用于小麥育種工作中的遺傳背景改良。

4 結(jié)論

本實驗基于組裝的中間偃麥草序列共開發(fā)2019對STS標記，其中第6同源群有253對，經(jīng)過篩選獲得160對特異標記，包含58個G6-Chr1標記、59個G6-Chr2標記和43個G6-Chr3標記。其中G6-Chr2為6St染色體，利用6St上的13個“+/-”型特異標記，可驗證小麥-偃麥草代換系材料F881中導入的外源6St染色體。