商振達，譚占坤，李家奎，卓嘎，王宏輝，巴桑，謝國平，劉鎖珠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝860000；2.西藏高原飼料加工工程研究中心，西藏 林芝 860000；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

西藏地處我國青藏高原西南部，具有特殊的氣候條件和地理位置(高寒、高海拔)，畜牧業(yè)是其農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，具有不可替代的社會、經(jīng)濟作用[1]。但由于西藏地區(qū)草地生產(chǎn)能力極低，牧草生長期短，優(yōu)質(zhì)飼料資源嚴重缺乏，難以為牦牛、藏羊等家畜提供充足的飼草料資源，當(dāng)前飼料的短缺已成為制約西藏畜牧業(yè)發(fā)展的瓶頸問題[2]。因此，開發(fā)擴大牧草資源，增加青綠飼料來源，對解決西藏地區(qū)家畜飼糧短缺問題具有重要意義。

青貯作為一種飼料長期保存的貯存技術(shù)，具有減少飼草養(yǎng)分損失、增加飼草的利用價值、調(diào)整牧草供應(yīng)時期、提高飼草消化率和動物適口性等優(yōu)點?？梢赃M行青貯的飼草很多，但為確保青貯的成功，也需要飼草含有適量的水分和糖分等營養(yǎng)物質(zhì)。青貯飼料是一個非常復(fù)雜的生化物質(zhì)轉(zhuǎn)化和微生物活動的過程，飼草中的營養(yǎng)成分和微生物菌群結(jié)構(gòu)都可以對其青貯后的飼料發(fā)酵品質(zhì)產(chǎn)生很大的影響[3-6]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，該項技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域已被廣泛使用[7-10]。

蕎麥(Fagopyrumesculentum)和玉米(Zeamays)作為西藏地區(qū)較為古老的栽培作物，現(xiàn)階段在西藏廣泛種植，其中西藏蕎麥的年栽培面積可以達到6667 hm2，西藏青飼玉米的產(chǎn)量可達667 kg·hm-2左右[11-12]。蕎麥作為一種飼料，富含蛋白質(zhì)、脂肪、鐵、鈣、磷等多種營養(yǎng)成分，其營養(yǎng)價值為玉米的70%。有研究表明，用蕎麥飼喂家禽可加快和提高家禽的生長速度和產(chǎn)蛋率；喂豬可提高豬肉品質(zhì)，飼喂奶?？商岣吲Ｄ痰馁|(zhì)量[13]。與其他飼料作物相比，蕎麥還有生育期短，抗寒能力強等優(yōu)點，可以在短時間內(nèi)提供大量優(yōu)質(zhì)飼料。但蕎麥含水量和含糖量相對較低，難以為單獨青貯提供優(yōu)質(zhì)的青貯條件。玉米作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料作物，具有生長速度快、再生能力強、適口性好、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點[14]，且玉米的含水量較為合適，含糖量相對較高，可以為青貯提供優(yōu)質(zhì)的條件。近年來關(guān)于利用玉米與飼草混合青貯改善飼料品質(zhì)的研究越來越多，如青飼玉米和青稞秸稈(barley straw)混合青貯研究、全株玉米與飼用苧麻(Boehmerianivea)混合青貯研究、全株玉米與高粱(Sorghumbicolor)混合青貯研究等[15-17]，且結(jié)果均顯示混合青貯可以改善飼料的品質(zhì)。因此，為充分利用西藏地區(qū)全株蕎麥，擴大西藏地區(qū)飼料資源，解決西藏飼料短缺問題，本研究利用常規(guī)營養(yǎng)分析方法和高通量測序技術(shù)，分析全株蕎麥和全株玉米以不同比例進行混合青貯后的發(fā)酵品質(zhì)和微生物菌群結(jié)構(gòu)，探究全株蕎麥與全株玉米混合青貯的最佳比例，為西藏地區(qū)蕎麥飼用提供理論依據(jù)，為解決西藏地區(qū)非糧飼料開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蕎麥和玉米種植于西藏林芝西藏農(nóng)牧學(xué)院試驗地，該地區(qū)平均海拔3100 m，屬于熱帶、亞熱帶、溫帶、寒帶，濕潤和半濕潤并存的多種氣候帶，年降水量650 mm左右，年均溫度8.7 ℃，年均日照2000 h，無霜期180 d。青貯材料于2017年3月進行種植，于2017年10月進行刈割，種植期間適時除草、追肥和灌水。兩種青貯材料的營養(yǎng)成分見表1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計，設(shè)置5個處理，分別為全株蕎麥青貯A組(A1、A2、A3和A4分別為青貯7、14、30和60 d)、全株蕎麥∶全株玉米=4∶1混合青貯B組(B1、B2、B3和B4分別為青貯7、14、30和60 d)、 全株蕎麥∶全株玉米=3∶2混合青貯C組(C1、C2、C3和C4分別為青貯7、14、30和60 d)、全株蕎麥∶全株玉米=2∶3混合青貯D組(D1、D2、D3和D4分別為青貯7、14、30和60 d)、全株蕎麥∶全株玉米=1∶4混合青貯E組(E1、E2、E3和E4分別為青貯7、14、30和60 d)，每組3袋作為3個重復(fù)，共60袋。每組青貯結(jié)束后打開青貯發(fā)酵罐取樣進行分析。

1.3 測定方法

1.3.1青貯飼料制作 將全株蕎麥和全株玉米均切成1～3 cm后稱取55 g，充分混合均勻后，快速裝填并壓實于110 mL的小型實驗用青貯窖中密封后，置于室溫條件下保存，分別在青貯第7、14、30和60天后全部打開，取出全部青貯飼料將其混勻，稱35 g放入200 mL的廣口三角瓶，加入105 mL的去離子水(青貯飼料∶水=1∶3)，在4 ℃的冰箱內(nèi)浸提24 h。然后對青貯飼料進行榨汁和過濾，將上清液用過濾漏斗通過2層紗布和濾紙過濾，保存濾液待測。濾液用來測定pH值、乳酸、氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸。將剩余的青貯飼料收集起來烘干，稱重粉碎，測定干物質(zhì)、總氮以及水溶性碳水化合物含量。

表1 青貯材料營養(yǎng)成分Table 1 The nutritional ingredient of silage material

1.3.2青貯飼料發(fā)酵營養(yǎng)成分測定 采用烘干法測定青貯飼料中干物質(zhì)含量；用HANNA pH211精密pH計(意大利HANNA公司)對青貯樣品處理后的過濾液直接測定pH；通過日立高效液相色譜儀測定揮發(fā)性脂肪酸含量；通過凱氏定氮法測定總氮(total nitrogen，TN)含量。采用硫酸-蒽酮比色法[18]和苯酚-次氯酸鈉比色法[19]分別測定水溶性碳水化合物和氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)含量。

1.3.3青貯飼料微生物多樣性的測定 將每個青貯組中的3個重復(fù)樣品均勻地混合在一起。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒提取青貯飼料中的微生物組總DNA，利用前引物(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和后引物(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)獲得細菌16S rRNA 基因V3-V4高變異區(qū)。擴增產(chǎn)物回收純化，采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序并對結(jié)果進行分析。Illumina HiSeq測序及結(jié)果分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用UCLUST比對工具，按97%的序列相似度，對OTU(operational taxonomic unit)[20]進行歸并和劃分，通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫的模板序列相對比，對OTU進行分類地位的鑒定。利用Shannon、Simpson、Chao1和ACE 4種多樣性指數(shù)來分析微生物菌群的豐富度和均勻度。使用QIIME軟件進行各分類水平的分類學(xué)組成分析。通過IBM SPSS Statistics軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏地區(qū)全株蕎麥與全株玉米混合青貯發(fā)酵品質(zhì)及營養(yǎng)成分變化

整個青貯過程中，全株蕎麥單獨青貯組干物質(zhì)含量顯著(P<0.05)高于全株蕎麥和全株玉米混合青貯組(表2)，且干物質(zhì)含量隨著全株玉米混合比例的增加而顯著(P<0.05)下降。全株蕎麥單獨青貯組pH值顯著(P<0.05)高于混合青貯組，且pH值隨著全株玉米混合比例的增加而顯著(P<0.05)下降。相應(yīng)的乳酸含量在全株蕎麥單獨青貯組中顯著(P<0.05)低于混合青貯組，且乳酸含量隨著全株玉米混合比例的增加而顯著(P<0.05)升高。這可能是因為全株蕎麥中干物質(zhì)含量較高，水溶性碳水化合物含量較低，而全株玉米中干物質(zhì)含量較低，水溶性碳水化合物含量較高。隨著青貯天數(shù)的增加，各青貯中干物質(zhì)含量顯著下降(P<0.05)或下降(P>0.05)。各混合青貯組中pH值隨著青貯的進行有先下降后升高的趨勢，而乳酸含量有先升高后下降的趨勢。但各混合青貯中的pH始終高于4.2。 本研究中乙酸含量的變化趨勢與乳酸含量基本相同，隨著青貯天數(shù)的增加，各青貯組中丁酸含量逐漸升高，但均低于10 g·kg-1DM。

表2 西藏地區(qū)蕎麥與玉米混合青貯過程中pH值、干物質(zhì)和揮發(fā)性脂肪酸含量的變化Table 2 Changes in pH, DM and volatile fatty acid contents of mixed silages of buckwheat and maize during ensiling in Tibet

注：不同小寫字母表示相同處理不同青貯天數(shù)間差異顯著，不同大寫字母表示相同青貯天數(shù)不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Values with different lowercase letters show significant differences among different ensiling days in the same treatment, values with different capital letters show significant differences among different treatments in the same ensiling day (P<0.05), the same below.

如表3所示，各混合青貯組中氨態(tài)氮/總氮的值均顯著高于(P<0.05)或高于(P>0.05)全株蕎麥單獨青貯組，且隨著青貯天數(shù)的增加，各混合青貯組中氨態(tài)氮/總氮的值有升高的趨勢，但均低于100 g·kg-1。各混合青貯組中水溶性碳水化合物的含量均顯著低于(P<0.05)或低于(P>0.05)全株蕎麥單獨青貯組，且隨著青貯天數(shù)的增加，各混合青貯組中水溶性碳水化合物的含量有下降的趨勢，可能是因為混合青貯中加入全株玉米后，提高了碳水化合物的利用效果。

2.2 西藏地區(qū)全株蕎麥與全株玉米混合青貯發(fā)酵微生物多樣性研究

2.2.1測序結(jié)果及Alpha多樣性分析 本研究利用高通量測序技術(shù)對5個處理組，共20份青貯飼料樣品的菌群V3-V4區(qū)進行測序，共計獲得753445條有效序列，樣品平均有效序列為37672條。將豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU去除，并按照97%的相似度對OTUs在門、綱、目、科、屬、種6個分類水平上進行分類鑒定(圖1)。

從圖2可見，隨著測試深度的不斷加深，物種觀察指數(shù)稀釋曲線逐漸增加，其斜率逐漸減小，趨于平臺期，說明樣本測序量已經(jīng)飽和，大多數(shù)菌群被覆蓋，足夠反映樣本中絕大部分細菌物種的信息。由各青貯試驗組的4種Alpha多樣性指數(shù)可知(表4)，隨著青貯天數(shù)的逐漸增加，各青貯組中Simpson和Shannon指數(shù)[21]逐漸下降，表明隨著青貯的進行，青貯飼料中微生物菌群的均勻度逐漸下降，而各青貯組中Chao1和ACE指數(shù)[22-23]隨著青貯天數(shù)的逐漸增加也逐漸下降，說明隨著青貯的進行，青貯飼料中微生物菌群的豐富度逐漸下降。各青貯組中，隨著全株蕎麥和全株玉米混合青貯的比例不同，4種Alpha多樣性指數(shù)也不同，表明混合青貯中原料的比例不同，會導(dǎo)致青貯過程中微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

表3 西藏地區(qū)蕎麥與玉米混合青貯過程中氨態(tài)氮/總氮和水溶性碳水化合物含量的變化Table 3 Changes in AT/TN and WSC content of mixed silages of buckwheat and maize during ensiling in Tibet

圖1 OTUs分類地位鑒定Fig.1 The classification of OTUs in different silage samples

圖2 各青貯組稀釋曲線Fig.2 Rarefaction analysis per experimental group

指數(shù)Index青貯天數(shù)Ensiling days (d)處理 TreatmentsABCDESimpson指數(shù)Simpson index70.970.970.960.970.98140.960.970.950.980.97300.950.960.970.940.92600.900.950.900.940.86Shannon指數(shù)Shannon index77.417.556.787.347.47147.337.306.617.507.32306.777.047.346.736.47604.765.954.675.805.03ACE指數(shù)ACE index71492.481844.241182.391464.181192.10141699.631583.851110.001447.661358.09301453.471594.841466.371222.221519.6660607.18792.68352.27830.45667.05Chao1指數(shù)Chao1 index71457.291833.881131.061445.891191.01141643.651508.301110.001409.441348.53301434.431581.301426.391220.031549.1060575.13772.38351.08827.28673.22

2.2.2基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在門分類水平上豐度大于1%的菌種，分析各青貯樣品在門分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。表5顯示了在門水平上不同青貯組在不同青貯天數(shù)中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化(豐度>1%)，20個樣品中共鑒定出15種菌門，其中豐度大于1%的菌門有5個，分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，其豐度值依次為51.8%、23.3%、16.2%、7.4%和1.1%，占菌群分類的99.8%，此5種菌門為全株蕎麥和全株玉米混合青貯中的優(yōu)勢菌門，0.2%左右的為其他菌門。

比較不同青貯試驗組樣品可知，混合青貯B組只有在青貯第60天時變形菌門豐度低于全株蕎麥青貯組，其他青貯天數(shù)時均高于全株蕎麥青貯組；混合青貯C組中，變形菌門豐度在青貯7和30 d時高于全株蕎麥青貯組，在青貯14和60 d時低于全株蕎麥青貯組；混合青貯D組中，變形菌門豐度在青貯7和60 d時低于全株蕎麥青貯組，在青貯14和30 d時高于全株蕎麥青貯組；而混合青貯E組在青貯第30和60天時變形菌門豐度高于全株蕎麥青貯組，青貯第7和14天均低于或接近于全株蕎麥青貯組；各混合青貯組中厚壁菌門的豐度在青貯前30 d時均高于全株蕎麥青貯組，而在青貯60 d時低于全株蕎麥青貯組；與全株蕎麥青貯組相比，各混合青貯組中放線菌門和藍細菌門豐度的變化規(guī)律與厚壁菌門豐度的變化規(guī)律相反；各混合青貯組中擬桿菌門的豐度大部分低于全株蕎麥青貯組。

2.2.3基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在屬分類水平上豐度大于1%的菌種，分析各青貯樣品在屬分類水平上相對豐度較高的物種及其比例。表6顯示了在屬水平上不同青貯組在不同青貯天數(shù)中微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化(豐度>1%)，20個樣品中共鑒定出365種菌屬，其中豐度大于1%的菌屬有10個，分別為假單細胞菌屬(Pseudomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、泛菌屬(Pantoea)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、魏斯氏菌屬(Weissella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸桿菌屬(Escherichia)、沙雷菌屬(Serratia)，其豐度值依次為30.50%、12.60%、9.10%、5.40%、3.40%、3.00%、2.80%、1.60%、1.20%、1.20%，占菌群分類的70.80%，此10種菌屬為全株蕎麥和全株玉米混合青貯中的優(yōu)勢菌屬，29.20%左右的為其他菌屬。

表5 基于門水平上各青貯組中微生物菌群結(jié)構(gòu)Table 5 The microflora structure of different silage groups at phylum level (%)

表6 基于屬水平上各青貯組中微生物菌群結(jié)構(gòu)Table 6 The microflora structure of different silage groups at genus level (%)

續(xù)表6 Continued Table 6

比較不同青貯試驗組樣品可知，青貯前30 d時，各混合青貯組中乳桿菌屬豐度均高于全株蕎麥青貯組，且隨著全株玉米混合比例的增加而升高，但在青貯第60天時，全株蕎麥青貯組中乳桿菌屬豐度高于混合青貯組。各混合青貯組中魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬豐度均高于全株蕎麥青貯組，而在混合青貯D和E組中泛菌屬、腸桿菌屬和沙雷菌屬的豐度大部分低于全株蕎麥青貯組。青貯前30 d時，各青貯組中均無鏈霉菌屬，而青貯第60天時，各青貯組中滋生了鏈霉菌屬。因此，全株蕎麥與全株玉米混合青貯，尤其是當(dāng)混合青貯組中玉米所占比例超過60%時，可以增加乳桿菌屬豐度，降低泛菌屬、腸桿菌屬和沙雷菌屬豐度，有利于提升青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

3 討論

由于西藏地區(qū)特殊的氣候條件和地理位置(高寒、高海拔)，造成其草地生產(chǎn)能力極低，優(yōu)質(zhì)飼料資源嚴重缺乏，難以為牦牛、藏羊等家畜提供充足的飼草料資源等問題[1-2]。本研究以西藏地區(qū)全株蕎麥和全株玉米為青貯原料，研究不同混合比例對全株蕎麥和全株玉米混合青貯發(fā)酵品質(zhì)和青貯過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化的影響，為西藏地區(qū)蕎麥飼用提供技術(shù)支撐。

本試驗結(jié)果顯示，全株蕎麥與全株玉米混合青貯后，顯著降低了混合青貯組中干物質(zhì)含量，并且隨著全株玉米混合比例的增加而逐漸下降。混合青貯組中pH值顯著低于全株蕎麥青貯組，并且隨著全株玉米混合比例的增加而逐漸下降，相應(yīng)的乳酸含量隨著全株玉米混合比例的增加而逐漸升高，這可能是因為全株玉米中干物質(zhì)含量低于全株蕎麥，致使各混合組隨著全株玉米混合比例增加干物質(zhì)含量顯著下降，全株玉米中水溶性碳水化合物含量較高，可以為乳酸菌提供更多的發(fā)酵底物，有效地提高乳酸產(chǎn)量，降低了青貯飼料的pH值[24-26]，但各青貯組中pH值均沒降至常規(guī)成功青貯要求的4.2以下[27]。本研究中隨著青貯的進行，各青貯組中干物質(zhì)含量下降，pH值降低，乳酸含量升高，碳水化合物含量降低，這可能是因為全株蕎麥和全株玉米物理結(jié)構(gòu)較為粗糙，難以壓實，青貯過程中青貯窖中殘留較多的空氣，使一些好氧性微生物分解蛋白和糖，隨著青貯時間的延長和發(fā)酵強度的增加，厭氧菌和乳酸菌競爭營養(yǎng)，利用糖和乳酸等底物產(chǎn)生氣體，而導(dǎo)致干物質(zhì)的損失增加。除此之外，隨著青貯的進行，全株蕎麥和全株玉米混合青貯提高了碳水化合物的利用效率，使pH值降低，乳酸含量升高。本研究中，全株蕎麥與全株玉米混合青貯后，雖然沒有顯著降低青貯飼料中氨態(tài)氮/總氮的值和丁酸含量，但各青貯組中氨態(tài)氮/總氮的值和丁酸含量均低于優(yōu)質(zhì)青貯飼料的要求[28](氨態(tài)氮/總氮的值低于100 g·kg-1DM，丁酸含量低于10 g·kg-1DM)。

青貯飼料發(fā)酵過程中微生物菌群的豐度和結(jié)構(gòu)的變化影響著青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分[29]。因此本研究基于高通量測序技術(shù)對全株蕎麥與全株玉米混合青貯飼料的微生物菌群結(jié)構(gòu)進行檢測，由研究結(jié)果得到，樣本測序量已經(jīng)飽和，大多數(shù)菌群被覆蓋，足夠反映樣本中絕大部分細菌物種的信息。由4種Alpha多樣性指數(shù)可知，全株蕎麥與全株玉米混合比例不同，會使青貯飼料中微生物菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。本研究中共計檢測到15種菌門和365種菌屬，優(yōu)勢菌門依次為變形菌門、厚壁菌門、藍細菌門、放線菌門、擬桿菌門，優(yōu)勢菌屬依次為假單細胞菌屬、乳桿菌屬、泛菌屬、鏈霉菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、貪銅菌屬、乳球菌屬、腸桿菌屬和沙雷菌屬。這與胡宗福等[30]對青貯全株玉米中微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果不同。假單細胞菌屬作為一種專性需氧菌，是全株蕎麥與全株玉米混合青貯的優(yōu)勢菌屬，可能是青貯窖中有空氣殘留造成的。本研究中混合青貯組中厚壁菌門的豐度高于全株蕎麥單獨青貯，尤其是在青貯D和E組中，厚壁菌門的豐度較高，說明全株蕎麥與全株玉米混合青貯提高了青貯飼料中粗纖維的降解率[31]。青貯前30 d時，各混合青貯組中乳桿菌屬豐度均高于全株蕎麥單獨青貯組，除此之外，各混合青貯組中常見的乳酸菌菌種(lactic acid bacteria，LAB)，如魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬的豐度也高于全株蕎麥單獨青貯組，說明全株蕎麥與全株玉米混合青貯后，加強了產(chǎn)生乳酸的能力，降低了青貯飼料的pH值，抑制了有害雜菌的生長(青貯飼料的重要腐敗菌革蘭氏陽性芽孢桿菌屬和梭菌屬均不是全株蕎麥和全株玉米混合青貯的優(yōu)勢菌屬[32-33])。本研究中全株蕎麥與全株玉米的混合比例不同，也導(dǎo)致青貯過程中泛菌屬、貪銅菌屬、腸桿菌屬和沙雷菌屬的豐度出現(xiàn)變化，這幾種菌屬的功能還有待進一步研究。

4 結(jié)論

全株蕎麥和全株玉米混合青貯可以顯著改變?nèi)晔w麥單獨青貯后的發(fā)酵品質(zhì)，降低了青貯飼料的pH值，提高了乳酸含量和水溶性碳水化合物的利用率。提高了厚壁菌門和LAB菌種的豐度，有效抑制了腐敗菌的生長。而且這種效果隨著全株玉米混合比例越高而越顯著。綜合考慮全株蕎麥利用最大化和青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，建議將全株蕎麥和全株玉米以2∶3的比例混合青貯較為適宜。