陳云雨，牛夏憶，李妍，劉曉平

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基于β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)的新型抗腫瘤藥物高通量篩選模型的建立

陳云雨1,2，牛夏憶1，李妍3，劉曉平1

1 皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 新藥篩選與評(píng)價(jià)中心，安徽 蕪湖 241002 2 中國科學(xué)院 長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022 3 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 國家新藥 (微生物) 篩選中心，北京 100050

陳云雨, 牛夏憶, 李妍, 等. 基于β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)的新型抗腫瘤藥物高通量篩選模型的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(4): 707–717.Chen YY, Niu XY, Li Y, et al. Development of an ELISA-based high throughput screening method for novel anticancer agents targeting β-catenin/Lef1 interaction. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 707–717.

旨在以β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)，建立基于ELISA原理的適用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制劑篩選的高通量篩選模型。利用DNA重組技術(shù)，將構(gòu)建的β-catenin-pET-30a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)。采用親和層析方法分離純化β-catenin后，以GST Pulldown實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定。利用ELISA原理建立β-catenin/GST-Lef1結(jié)合的分子模型，通過優(yōu)選GST-Lef1最佳包被濃度和β-catenin最佳反應(yīng)濃度，建立適用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制劑篩選的高通量篩選模型。SDS-PAGE和Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)β-catenin的原核表達(dá)。GST Pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)純化的β-catenin具有良好的生物學(xué)活性。通過對(duì)基于ELISA原理建立的β-catenin/GST-Lef1結(jié)合的分子模型優(yōu)化，選用10 μg/mL GST-Lef1和6 μg/mL β-catenin建立ELISA高通量篩選模型，其Z￠因子為0.76。本研究成功建立了基于ELISA原理的β-catenin/GST-Lef1結(jié)合的分子模型，為靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制劑的高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。

Wnt抑制劑，β-catenin，β-catenin/Lef1相互作用，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，高通量篩選

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異?；罨诮Y(jié)腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)成為腫瘤分子靶向治療的一個(gè)重要靶標(biāo)[1]。β-catenin是介導(dǎo)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子，同時(shí)通過與E-cadherin相互作用，參與細(xì)胞黏連和細(xì)胞骨架的構(gòu)成。β-catenin核心功能區(qū)是12個(gè)連續(xù)重復(fù)的犰狳蛋白重復(fù)片段 (Armadillo repeats, 138–686 aa)，兩側(cè)是N端結(jié)構(gòu)域和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (Carboxy-terminal transactivation domain, CTA)。其中犰狳蛋白重復(fù)片段對(duì)β-catenin的生物學(xué)功能尤為重要，幾乎介導(dǎo)了β-catenin與所有已知互作蛋白的結(jié)合[2]。在經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中，β-catenin作為重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過與Tcf4 (T-cell factor 4) 和Lef1 (Lymphoid enhancer factor 1) 相互作用而啟動(dòng)大量原癌基因的表達(dá)[3-4]。研究表明，β-catenin/Lef1相互作用在非小細(xì)胞肺癌 (Non-small cell lung cancer，NSCLC) 腦 (骨) 轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)肺癌細(xì)胞浸潤和腦 (骨) 轉(zhuǎn)移的形成[5-6]。另一方面，β-catenin/Lef1相互作用對(duì)于維持腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells, CSC) 分化和自我更新具有極其重要的促進(jìn)作用，參與維持腫瘤干細(xì)胞休眠體的形成，促進(jìn)腫瘤耐藥與復(fù)發(fā)[7-8]。此外，β-catenin/Lef1相互作用在急 (慢) 性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，已經(jīng)成為白血病治療的新靶標(biāo)[9-13]。因此，靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)對(duì)于抑制NSCLC轉(zhuǎn)移和急 (慢) 性淋巴細(xì)胞白血病的治療具有重要意義。

本研究通過原核表達(dá)和分離純化高活性的β-catenin與GST-Lef1功能蛋白，以β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)，建立基于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 原理的高通量篩選模型，為靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制劑的理性化發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-30a(+)與pGEX-4T-1載體由本室保存；GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒由中國科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院袁莉教授惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、.Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞、.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、?-T DNA聚合酶、Trans2K?DNA Marker、u?Ⅱ、?-T1試劑盒、?試劑盒、瓊脂糖、?HⅠ和?Ⅰ購自TransGen公司；酵母粉、胰蛋白胨和瓊脂粉購自O(shè)xoid公司；BCA (Bicinchoninic acid) 試劑盒購自Thermo公司；硫酸卡那霉素、氨芐西林和異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG) 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白(Bull serum albumin, BSA)、小鼠抗組氨酸 (Histidine，His) 標(biāo)簽單抗、小鼠抗谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 (Glutathione S-transferase，GST) 標(biāo)簽單抗和辣根過氧化物酶 (Horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自Biosharp公司；MaxiLuminTM化學(xué)發(fā)光液購自Biokits公司；96孔酶標(biāo)板購自Corning公司；可溶型單組分四甲基聯(lián)苯胺 (3,3?,5,5?-Tetramethylbenzidine，TMB) 溶液購自天根生化科技 (北京) 有限公司；醋酸纖維素膜購自Millipore公司；HisTrap和GSTrap層析柱購自GE公司；谷胱甘肽親和介質(zhì)購自中科森輝微球技術(shù) (蘇州) 有限公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 β-catenin (138–781 aa) 基因片段擴(kuò)增

β-catenin功能區(qū)主要包括犰狳蛋白重復(fù)片段(138–686 aa) 和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 (687–781 aa)，主要介導(dǎo)與Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的相互作用和染色質(zhì)重塑復(fù)合體的募集[2]。根據(jù)β-catenin (138–781 aa) 基因序列設(shè)計(jì)引物，以GST-β-catenin- pGEX-4T-1重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增基因片段 (1 932 bp)。按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增[14]，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[14]。首先，將回收的基因片段與T載體連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒。將克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，以單菌落PCR反應(yīng)和質(zhì)粒雙酶切法鑒定陽性克隆，質(zhì)粒測(cè)序由General Biosystems公司完成。

雙酶切克隆質(zhì)粒中的基因片段后回收，再與pET-30a(+)載體連接，構(gòu)建β-catenin- pET-30a(+)重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，同法鑒定陽性克隆。

1.2.3 β-catenin原核表達(dá)

按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)[14]。首先，將β-catenin-pET-30a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化.Rosetta (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落，以1 mmol/L IPTG于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)。離心收集菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)量分析。

工程菌大量誘導(dǎo)培養(yǎng)后，將離心收集的菌體以適量TBS (50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0) 溶液重懸，離心收集超聲波裂解后的上清液和沉淀。8% SDS-PAGE進(jìn)行β-catenin的可溶性表達(dá)分析。

1.2.4 β-catenin分離純化

大量收集菌體裂解后的上清液，以25%飽和硫酸銨沉淀后制備粗提液，再按照文獻(xiàn)所述方法以HisTrap層析柱進(jìn)行β-catenin的分離純化[14]。純化的β-catenin以8% SDS-PAGE進(jìn)行分析，經(jīng)TBS溶液透析后，以BCA法定量。

1.2.5 Western blotting實(shí)驗(yàn)鑒定β-catenin

按照文獻(xiàn)所述方法[14]，純化的β-catenin經(jīng)8% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，一抗為1∶2 000稀釋的小鼠抗His標(biāo)簽單抗，二抗為1∶4 000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，用MaxiLuminTM化學(xué)發(fā)光液顯影成像。

1.2.6 GST-Lef1 (1–76 aa) 原核表達(dá)與分離純化

Lef1是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，β-catenin通過犰狳蛋白重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域與Lef1的βBD結(jié)構(gòu)域 (β-catenin binding domain, βBD, 1–76 aa) 相互作用，進(jìn)而調(diào)控大量原癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[15-16]。檢索Lef1 (1–76 aa) 的基因序列，以HⅠ和Ⅰ作為酶切位點(diǎn)，由General Biosystems公司進(jìn)行全基因合成后連接pGEX-4T-1載體，構(gòu)建GST-Lef1-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒。

Lef1 (1–76 aa) 基因合成序列如下 (下劃線為雙酶切位點(diǎn))：5?-ATGCCCCAACTTTC CGGAGGAGGCGGCGGGGGGGACCCGGAACTCTGCGCCACCGATGAGATGATCCCCTTCAAGGACGAAGGCGATCCCCAGAAGGAGAAGATCTTCGCCGAGATCAGTCATCCCGAAGAGGAGGGCGACTTAGCCGACATCAAGTCATCTTTGGTTAACGAGTCCGAAATCATCCCAGCCAGCAACGGGCATGAGGTGGTCAGACAAGCCCCGTCC-3?。

大量收集菌體裂解后的上清液，再按照文獻(xiàn)所述方法以GSTrap層析柱分別進(jìn)行GST-Lef1和GST的分離純化[14]。純化的GST-Lef1和GST以10% SDS-PAGE進(jìn)行分析，經(jīng)TBS溶液透析后，以BCA法定量。

1.2.7 GST Pulldown實(shí)驗(yàn)

將10 μg GST-Lef1和10 μg GST分別加入到20 μL GST瓊脂糖凝膠親和介質(zhì)中，4 ℃反應(yīng)過夜。收集反應(yīng)后的GST瓊脂糖凝膠，以TBS溶液重懸。離心洗滌3次后，分別加入2 μg和10 μg β-catenin，室溫反應(yīng)1 h，收集GST凝膠。以1.2.5方法檢測(cè)β-catenin的結(jié)合量。

1.2.8 基于ELISA原理的高通量篩選模型的優(yōu)化與建立

1) GST-Lef1最佳包被濃度的確定

將5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的GST-Lef1包被96孔酶標(biāo)板(100 μL/孔)，每組3個(gè)復(fù)孔，以包被1 μg BSA 孔作為陰性對(duì)照。酶標(biāo)板經(jīng)含0.1% Tween-20的磷酸鹽 (Phosphate-buffered solution, PBS) 緩沖液(PBST) 洗板3次后，以含10% BSA的PBST溶液于37 ℃封閉2 h。PBST洗板后，依次加入1∶2 000稀釋的小鼠抗GST標(biāo)簽單抗和1∶4 000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，室溫反應(yīng)1 h。以PBST洗板3次后，每孔加入TMB溶液 (100 μL/孔)，室溫避光顯色5 min，再加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450值 (CytationTM5, BioTek)。

2) β-catenin最佳反應(yīng)濃度的確定

GST與GST-Lef1 (10 μg/mL；100 μL/孔) 包被96孔酶標(biāo)板，以包被GST孔作為陰性對(duì)照組。酶標(biāo)板經(jīng)PBST洗滌和10% BSA封閉后，將0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的β-catenin (100 μL/孔) 依次加入到96孔酶標(biāo)板中，每組3個(gè)復(fù)孔，室溫孵育1 h。PBST洗板后，按照上述方法依次加入1∶2 000稀釋的小鼠抗His標(biāo)簽單抗和1∶4 000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，室溫反應(yīng)1 h。以TMB溶液 (100 μL/孔) 顯色，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450值。

3) DMSO濃度對(duì)β-catenin/GST-Lef1結(jié)合的影響

GST-Lef1 (10 μg/mL；100 μL/孔) 包被的96孔酶標(biāo)板以PBST洗滌和10% BSA封閉后，依次加入含0%、1%、2%、3%、4%、5% DMSO濃度的β-catenin (6 μg/mL；100 μL/孔) 到96孔酶標(biāo)板中，每組3個(gè)復(fù)孔，室溫反應(yīng)1 h。按照上述方法檢測(cè)450值。

4) Z￠因子及其他主要技術(shù)參數(shù)的測(cè)定

GST和GST-Lef1 (10 μg/mL；100 μL/孔) 包被的96孔酶標(biāo)板以PBST洗滌和10% BSA封閉后，將β-catenin (6 μg/mL；100 μL/孔) 加入到96孔酶標(biāo)板中，室溫孵育1 h。將GST-Lef1與β-catenin反應(yīng)孔設(shè)置為陰性孔，GST與β-catenin反應(yīng)孔設(shè)置為陽性孔，其中1#–30#孔為陰性孔，31#–60#孔為陽性孔。以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450值并按照BioTek操作系統(tǒng)的相關(guān)程序進(jìn)行Z￠因子的自動(dòng)計(jì)算。

另外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]，我們也對(duì)本篩選模型的信號(hào)本底比 (Signal to background，S/B)、信號(hào)窗 (Signal window，SW)、信噪比 (Signal to noise，S/N)、信號(hào)/本底變異系數(shù) (Coefficient of variation of signal/background，CV) 進(jìn)行了定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒為模板，利用PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增了與基因片段 (1 932 bp) 大小一致的特異DNA片段 (圖1A)。將構(gòu)建的β-catenin-pET-30a(+) 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，以單菌落PCR反應(yīng)和質(zhì)粒雙酶切法鑒定經(jīng)卡那霉素抗性篩選的陽性克隆。鑒定結(jié)果表明，所挑取的單菌落均可特異性擴(kuò)增出約1 932 bp的DNA片段 (圖1B)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切后，再次得到了與PCR擴(kuò)增結(jié)果大小一致的DNA片段 (圖1C)。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 β-catenin原核表達(dá)與分離純化

6株工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，離心收集菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件進(jìn)行β-catenin原核表達(dá)分析。與陰性對(duì)照組相比，在β-catenin理論分子量 (77 kDa) 位置可見明顯的蛋白表達(dá)條帶，β-catenin表達(dá)量約為15% (圖2A)。取菌體裂解后的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，β-catenin以可溶形式表達(dá)，大部分存在于上清液中(圖2B)。綜上所述，成功進(jìn)行了β-catenin原核表達(dá)。

25%飽和硫酸銨沉淀的菌體裂解上清液經(jīng)HisTrap層析柱分離純化后，收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，在β-catenin理論分子量 (77 kDa) 位置呈單一蛋白條帶，表明純化的β-catenin具有較高的純度 (圖2B)。以Western blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)純化的β-catenin進(jìn)行鑒定，在β-catenin理論分子量 (77 kDa) 位置仍呈現(xiàn)出特異性條帶，證實(shí)了β-catenin的正確表達(dá) (圖2C)。β-catenin經(jīng)TBS溶液透析和BCA法定量后，其濃度為1.0 mg/mL。

圖1 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

圖2 β-catenin原核表達(dá)與分離純化

2.3 GST-Lef1原核表達(dá)與分離純化

工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌體，以10% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件進(jìn)行GST-Lef1原核表達(dá)分析。結(jié)果表明，在GST-Lef1理論分子量 (34 kDa) 位置可見明顯的蛋白表達(dá)條帶，GST-Lef1表達(dá)量約為18 % (圖3)。取菌體裂解后的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，GST-Lef1以可溶形式表達(dá)，大部分存在于上清液中(圖3)。

圖3 GST-Lef1原核表達(dá)與分離純化

菌體裂解上清液經(jīng)GSTrap層析柱分離純化后，收集的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，得到了與預(yù)期分子量 (34 kDa) 大小一致且純度較高的GST-Lef1 (圖3)。純化的GST-Lef1和GST (26 kDa) 經(jīng)TBS溶液透析和BCA法定量后，其濃度分別為1.3 mg/mL和1.7 mg/mL。

2.4 β-catenin生物學(xué)活性鑒定

細(xì)胞核內(nèi)β-catenin/Lef1相互作用是Wnt/ β-catenin信號(hào)通路中最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式[3-4,15-16]。GST Pulldown實(shí)驗(yàn)表明，純化的β-catenin能與GST-Lef1在體外發(fā)生明顯的特異性結(jié)合反應(yīng)，且結(jié)合反應(yīng)具有典型的量效關(guān)系，但β-catenin不能與GST發(fā)生結(jié)合反應(yīng) (圖4)。上述結(jié)果表明，純化的β-catenin具有良好的生物學(xué)活性。

2.5 GST-Lef1最佳包被濃度的確定

將不同濃度的GST-Lef1包被96孔酶標(biāo)板后，以ELISA方法進(jìn)行包被量檢測(cè)。結(jié)果表明，GST-Lef1包被濃度大于10 μg/mL時(shí)，450值趨于穩(wěn)定并始終維持在0.73–0.81之間，10 μg/mL的包被濃度基本達(dá)到包被飽和量 (圖5)。因此選用10 μg/mL作為GST-Lef1的最佳包被濃度。

圖4 GST Pulldown實(shí)驗(yàn)

圖5 GST-Lef1最佳包被濃度的確定

2.6 β-catenin最佳反應(yīng)濃度的確定

將系列稀釋的β-catenin加入到10 μg/mL GST-Lef1包被的96孔酶標(biāo)板中，以ELISA方法進(jìn)行β-catenin結(jié)合量檢測(cè)。結(jié)果表明，β-catenin與GST-Lef1的結(jié)合反應(yīng)具有良好的濃度依賴性。當(dāng)β-catenin濃度達(dá)到7 μg/mL時(shí)，450值達(dá)到最大并趨于結(jié)合反應(yīng)的飽和 (圖6)。為了使其結(jié)合反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)體系中趨于飽和狀態(tài)并增大實(shí)驗(yàn)體系的信號(hào)窗，因此選用6 μg/mL作為β-catenin的最佳反應(yīng)濃度。

圖6 β-catenin最佳反應(yīng)濃度的確定

2.7 DMSO濃度對(duì)β-catenin/GST-Lef1相互作用的影響

利用確定最佳GST-Lef1包被濃度和β-catenin反應(yīng)濃度的ELISA分子結(jié)合模型進(jìn)行DMSO濃度影響實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，DMSO濃度在0%–5% 時(shí)，450值趨于穩(wěn)定并始終維持在0.97–1.05之間，其對(duì)β-catenin/GST-Lef1相互作用未產(chǎn)生顯著影響 (圖7)。

圖7 DMSO濃度對(duì)β-catenin/GST-Lef1相互作用的影響

2.8 Z￠因子及其他主要技術(shù)參數(shù)的測(cè)定

通過綜合分析與計(jì)算，本篩選模型的Z￠因子值為0.76，滿足高通量篩選中Z￠因子大于0.5的基本要求 (圖8)。

除Z￠因子外，本篩選模型的其他4個(gè)通用技術(shù)指標(biāo)，如信號(hào)本底比 (S/B)、信噪比 (S/N)、信號(hào)窗 (SW) 和信號(hào)/本底變異系數(shù) (CV) 也完全滿足高通量篩選的基本要求 (表1)。

圖8 ELISA篩選模型Z￠因子的確定

表1 ELISA高通量篩選模型的綜合評(píng)價(jià)

3 討論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫耐受及化療耐藥密切相關(guān)。鑒于正常細(xì)胞中不存在Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而腫瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異?；罨?dòng)大量原癌基因的表達(dá)，所以Wnt/β-catenin信號(hào)通路已成為新型高選擇性抗腫瘤藥物開發(fā)的一個(gè)理想靶標(biāo)[3]。

Lef1與Tcf4同屬于高遷移組分 (High mobility group, HMG) 轉(zhuǎn)錄因子，是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)β-catenin通過與Lef1的βBD結(jié)構(gòu)域相互作用，啟動(dòng)大量原癌基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化[3-4,15-16]。目前靶向β-catenin/Tcf4相互作用的小分子抑制劑 (如ZTM-000990、PKF115-584、PKF222-815、PKF118-744、CGP049090、iCRT-3/5/14、LF-3等) 已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，在結(jié)腸癌[19-21]、乳腺癌[22]、肝癌[23-24]、多發(fā)性骨肉瘤[25]等腫瘤實(shí)驗(yàn)治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。但關(guān)于靶向β-catenin/Lef1相互作用的小分子抑制劑篩選方法及相關(guān)抑制劑的腫瘤分子治療研究卻鮮有報(bào)道[13,26]。

由于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (Protein-protein interactions, PPIs) 位點(diǎn)缺少較深的“口袋”式結(jié)構(gòu)，且具有較大的非連續(xù)性的相互作用面積，這使得以PPIs為靶點(diǎn)的小分子藥物開發(fā)依然面臨較大的挑戰(zhàn)；另外，由于缺少具有多樣化學(xué)結(jié)構(gòu)的靶向PPIs的小分子配體，較難進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的定向藥物設(shè)計(jì)[27]。因此，靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)對(duì)未來以其為靶標(biāo)的新型抗腫瘤藥物定向設(shè)計(jì)具有重要的理論意義。

大腸桿菌原核表達(dá)體系已成為制備重組蛋白的首選表達(dá)體系[28]，本研究綜合利用DNA重組技術(shù)，成功進(jìn)行了β-catenin和GST-Lef1的原核表達(dá)與分離純化。由于His標(biāo)簽較小，幾乎不影響目的蛋白的理化性質(zhì)且方便目的蛋白的檢測(cè)與純化，His標(biāo)簽已被廣泛應(yīng)用于多種重組蛋白在各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)與純化中[29]。故此在設(shè)計(jì)β-catenin原核表達(dá)和分離純化策略時(shí)，筆者首次采用pET-30a(+) 載體的His標(biāo)簽融合表達(dá)策略成功進(jìn)行了β-catenin原核表達(dá)與分離純化。與已報(bào)道的GST-β-catenin融合表達(dá)策略相比[30]，筆者建立的β-catenin原核表達(dá)與分離純化方法具有更好的簡(jiǎn)便性和實(shí)用性。此外，鑒于.Rosetta (DE3) 可補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，可提高真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平，故此選擇.Rosetta (DE3) 作為β-catenin的表達(dá)宿主菌。

GST Pulldown實(shí)驗(yàn)主要在溶液中進(jìn)行，可以真實(shí)地反映蛋白質(zhì)分子間的相互作用，已成為體外研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法[31]。我們利用GST Pulldown實(shí)驗(yàn)進(jìn)行β-catenin的生物學(xué)活性鑒定，證實(shí)了純化的β-catenin能與GST-Lef1發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，這表明純化的β-catenin具有良好的生物學(xué)活性。

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，使其在疾病診斷和藥物篩選研究領(lǐng)域得到了極大的應(yīng)用與發(fā)展[32-34]。本研究以β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)，應(yīng)用ELISA原理建立的高通量篩選模型還具有所需樣品量少、重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)大樣本的簡(jiǎn)便、快速的高通量篩選與分析。雖然本篩選模型還存在一定的局限性 (如操作步驟較多、需多次洗滌、耗時(shí)較長(zhǎng)等)，但和本實(shí)驗(yàn)室曾采用的酵母雙雜交篩選模型相比，應(yīng)用本篩選方法不但可以有效減少篩選化合物用量，降低篩選成本，還具有更好的簡(jiǎn)便性和靈敏性。另外，本篩選模型基本真實(shí)模擬了β-catenin/Lef1的生理相互作用，不僅可以應(yīng)用于以β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)的抗腫瘤藥物高通量篩選，還可以聯(lián)合GST Pulldown實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)小分子抑制劑的體外抑制活性，因此本方法也具有良好的實(shí)用性。

目前，我們成功應(yīng)用本篩選模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)室天然產(chǎn)物化合物庫進(jìn)行了初步篩選，已獲得了若干苗頭化合物，相關(guān)化合物的抗腫瘤分子機(jī)制研究正在進(jìn)行之中。此外，我們也利用本篩選模型對(duì)本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一系列靶向多肽進(jìn)行了系統(tǒng)篩選和體外抑制活性評(píng)價(jià)，已獲得了若干有深入研究?jī)r(jià)值的多肽分子，相關(guān)多肽的細(xì)胞藥理學(xué)研究也在同步進(jìn)行之中。在本篩選模型的后續(xù)方法改進(jìn)中，可直接使用HRP-抗His標(biāo)簽抗體一步法檢測(cè)和顯色，通過減少實(shí)驗(yàn)操作步驟以提高篩選效率。

Z￠因子是評(píng)價(jià)高通量篩選模型的核心參數(shù)，它結(jié)合了信號(hào)窗 (SW)和信號(hào)/本底變異系數(shù) (CV)這2個(gè)與模型質(zhì)量密切相關(guān)的重要參數(shù)，一般要求Z￠因子＞0.5的模型才適用于藥物高通量篩選[35]。通過對(duì)建立的ELISA高通量篩選模型的通用技術(shù)指標(biāo)，如Z￠因子、信號(hào)本底比 (S/B)、信噪比 (S/N)、信號(hào)窗 (SW)、信號(hào)/本底變異系數(shù) (CV)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，表明本篩選模型具有良好的穩(wěn)定性、靈敏性和特異性。

綜上所述，本研究成功建立了基于β-catenin/Lef1相互作用為靶標(biāo)的ELISA高通量篩選模型，為靶向β-catenin/Lef1相互作用的小分子抑制劑高通量篩選和藥理學(xué)活性評(píng)價(jià)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

致謝：衷心感謝中國科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院袁莉教授和美國華盛頓大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)系許文清教授在β-catenin原核表達(dá)方面給予的悉心指導(dǎo)和無私幫助！

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Development of an ELISA-based high throughput screening method for novel anticancer agents targeting β-catenin/Lef1 interaction

Yunyu Chen1,2, Xiayi Niu1, Yan Li3, and Xiaoping Liu1

1 Center for New Drug Screening & Evaluation, School of Pharmacy, Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui, China 2 Laboratory of Chemical Biology, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Changchun 130022, Jilin, China 3 National Center for Microbial Drug Screening, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based high throughput screening (HTS) method for β-catenin/Lef1 interaction antagonists screening,Rosetta (DE3) competent cells were transformed with β-catenin-pET-30a(+) plasmid. β-catenin protein was expressed after induction and purified using affinity chromatography. The biological activity of purified β-catenin was further analyzed by GST Pulldown assay. The β-catenin/GST-Lef1 binding model was established using ELISA principle, and the ELISA-based HTS method was further optimized through determination of an optimal coated concentration of GST-Lef1 and working concentration of β-catenin. The results showed that β-catenin protein was successfully expressed and purified. The GST Pulldown assay demonstrated a perfect biological activity for purified β-catenin. Subsequently, the ELISA-based HTS method was performed using 10 μg/mL GST-Lef1 and 6 μg/mL β-catenin, with the Z￠factor of 0.76. Taken together, we have successfully developed a simple, robust and reliable ELISA-based HTS method for screening of novel Wnt inhibitors targeting β-catenin/Lef1 interaction.

Wnt inhibitors, β-catenin, β-catenin/Lef1 interaction, ELISA, high throughput screening

10.13345/j.cjb.180344

August 26, 2018;

November 7, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 81703546), Anhui Provincial Natural Science Foundation (No. 1808085QH265), Jilin Scientific and Technological Development Program (No. 20160520045JH), The Doctoral Starting-up Fund of Wannan Medical College (No. RCQD201617), College Student Innovation Fund of Wannan Medical College (No. WK2018S54).

Xiaoping Liu. Tel: +86-553-3932601; Fax: +86-553-3932622; E-mail: liuxiaoping@wnmc.edu.cn

Yan Li. Tel: +86-10-63180623; Fax: +86-10-63180604; E-mail: 13391513480@163.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 81703546)，安徽省自然科學(xué)基金 (No. 1808085QH265)，吉林省科技發(fā)展計(jì)劃 (No. 20160520045JH)，皖南醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金 (No. RCQD201617)，皖南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研資助金 (No. WK2018S54) 資助。

2018-11-26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181122.1104.004.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)