李 雪 阮祥燕，2* 谷牧青 蔡桂舉 趙 越 Alfred O. Mueck,2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026；2.德國(guó)圖賓根大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心, 圖賓根 D-72076, 德國(guó) )

中國(guó)女性的預(yù)期壽命為76.2歲[1]，而平均絕經(jīng)年齡為49歲左右[2]，因此大部分女性一生中有超過1/3的時(shí)間在絕經(jīng)后度過。絕經(jīng)雖然是一種自然現(xiàn)象但會(huì)引起很多病理性結(jié)果，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量(如潮熱、出汗、失眠、抑郁、性交疼痛)，增加各種慢性病的發(fā)生(心血管病、骨質(zhì)疏松、老年癡呆、萎縮性陰道炎、尿道炎等)[3-6]。

絕經(jīng)后激素治療(menopause hormone therapy, MHT) 是緩解絕經(jīng)相關(guān)癥狀，預(yù)防或減少各種慢性病發(fā)生最有效的方法。 根據(jù)最新的中國(guó)絕經(jīng)管理與絕經(jīng)激素治療指南 (2018)[7]，MHT 應(yīng)該使用個(gè)體化的方案，對(duì)于有完整子宮，絕經(jīng)過渡期或絕經(jīng)后仍希望有月經(jīng)樣出血的婦女，應(yīng)采用雌孕激素序貫方案，對(duì)于有完整子宮，絕經(jīng)后不希望有月經(jīng)樣出血的婦女則提倡采用連續(xù)聯(lián)合方案。

盡管MHT治療可以緩解更年期癥狀，但是用藥后乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加仍然是降低MHT普及率的主要原因。如果能夠找出激素致乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加的原因與機(jī)制，采取精準(zhǔn)預(yù)防及治療對(duì)策，則可以充分發(fā)揮激素治療的優(yōu)勢(shì)，避免或減少乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加可能不僅僅與肥胖、吸煙史、缺乏運(yùn)動(dòng)、酗酒有關(guān)，而且可能與某些特定的膜受體的表達(dá)相關(guān)。孕激素受體膜組分1 (progesterone receptor membrane component 1, PGRMC1)是近年發(fā)現(xiàn)的22 000～26 000的小蛋白，是多蛋白孕酮復(fù)合物的成員之一。目前的研究[8-11]提示PGRMC1促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，PGRMC1的表達(dá)在肺、甲狀腺、結(jié)腸、卵巢、宮頸和乳腺癌中上調(diào)。本課題組的臨床研究[12-13]表明，乳腺癌組織中不僅有PGRMC1高表達(dá)，同時(shí)PGRMC1表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM 分級(jí)、總體生存率、無瘤生存率之間相關(guān)。前期的PGRMC1相關(guān)基礎(chǔ)研究[14-15]主要使用MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，但最近的研究[16]表明，與MCF-7乳腺癌細(xì)胞系相比，T47D細(xì)胞系是闡明乳腺癌與孕激素特異性作用的最理想的細(xì)胞模型。因此，本研究首次使用T47D細(xì)胞系探討PGRMC1在激素與乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用， 并對(duì)周期序貫/連續(xù)聯(lián)合方案對(duì)乳腺癌細(xì)胞增生的作用進(jìn)行比較， 以期找出激素致乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加的原因, 為臨床MHT治療方案的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

雌二醇(estradiol，E2), 屈螺酮(drospirenone，DRSP), 炔諾酮(norethisterone，NET)購自美國(guó)Sigma公司，使用乙醇稀釋至10-2mol/L，并分裝于100 μL EP管中；96孔板購自美國(guó)Corning公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國(guó)Hermo公司；青霉素購自美國(guó)Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermofisher公司；生物安全柜購自Haier公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)庫購買 T47D 乳腺癌細(xì)胞系, 將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活FBS、25 mmol/L HEPES以及1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液中。37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染

T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有HA標(biāo)記的PGRMC1(T47D-HA-PGRMC1)或空質(zhì)粒(T47D-HA-vector), 質(zhì)粒載體pcDNA3.0為5.3 kb，48 h后，用800 μg/mL 的G418 進(jìn)行為期3周的單克隆篩選。為避免轉(zhuǎn)染試劑的影響，將T47D-HA-vector設(shè)置為對(duì)照組。最后，Western blotting法檢測(cè)T47D-HA-PGRMC1及T47D-HA-vector 的PGRMC1表達(dá)情況。

1.4 細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)接種: 細(xì)胞按照每孔4 000個(gè)[200 μL培養(yǎng)基RPMI 1640+10%(體積分?jǐn)?shù))FBS+1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青霉素]接種到96孔板，置于37 ℃培養(yǎng)箱，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng)過夜，以使細(xì)胞貼壁。

細(xì)胞處理：使用無酚紅的細(xì)胞培養(yǎng)液將激素稀釋成目標(biāo)濃度后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同方案刺激。周期序貫方案：E2 10-12mol/L 或 10-10mol/L濃度處理3 d后加用100 nmol/L 孕激素(DRSP或NET)繼續(xù)刺激3 d。連續(xù)聯(lián)合方案：10-12mol/L 或 10-10mol/L 濃度的E2以及100 nmol/L 的孕激素(DRSP或NET)共同處理6 d。將T47D乳腺癌細(xì)胞系采用不同激素刺激方案處理后，使用CCK-8 進(jìn)行細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)。具體檢測(cè)方法為： 每孔加入20 μL CCK-8試劑，避光37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育1 h。在M2機(jī)器上讀取 D450波長(zhǎng)的吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每組激素刺激方案組內(nèi)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較E2濃度、細(xì)胞類型、DRSP和NET方案之間的差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以及E2濃度、細(xì)胞類型、DRSP和NET方案之間的交互作用，兩兩比較采用LSD方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T47D-HA-PGRMC1 細(xì)胞系

T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有HA標(biāo)記的PGRMC1，并用G418篩選3周，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株，用Western blotting法對(duì)轉(zhuǎn)染/未轉(zhuǎn)染 PGRMC1 的T47D細(xì)胞PGRMC1表達(dá)情況進(jìn)行蛋白的測(cè)定。在T47D-HA-vector 細(xì)胞系中，未檢測(cè)到PGRMC1的表達(dá)。 而T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞則出現(xiàn)明顯的PGRMC1表達(dá)條帶，表明穩(wěn)定表達(dá)PGRMC1的T47D-HA-PGRMC1 細(xì)胞系構(gòu)建成功(圖 1)。

圖1 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T47D-HA-PGRMC1 細(xì)胞系Fig.1 Stable overexpression of PGRMC1 in T47D-HA-PGRMC1

PGRMC1 was cloned in frame with HA in the T47D cells. After transfection, the expression was detected by Western blotting using rabbit anti-HA antibody and mouse anti-β-actin antibody. This figure showns representative Western blotting image of PGRMC1 expression in the T47D cells;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

2.2 單用雌激素對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增生的影響

通過使用2×2析因方差分析，發(fā)現(xiàn)單用雌激素時(shí)，E2濃度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同細(xì)胞類型(T47D-HA-vector、T47D-HA-PGRMC1)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E2濃度和細(xì)胞類型之間沒有交互作用(P>0.05)，詳見表1。

兩兩比較結(jié)果顯示，當(dāng)E2濃度為0.001 nmol/L時(shí)，T47D-HA-vector(11%) 和 T47D-HA-PGRMC1(20%)均未出現(xiàn)顯著的細(xì)胞增生(P>0.05)；當(dāng)E2濃度為0.01 nmol/L時(shí)，T47D-HA-vector(11%) 和 T47D-HA-PGRMC1(21%)也未出現(xiàn)顯著的細(xì)胞增生(P>0.05)；當(dāng)E2濃度為0.1 nmol/L時(shí)，T47D-HA-vector的細(xì)胞增生約21%(P>0.05)，而T47D-HA-PGRMC1出現(xiàn)顯著細(xì)胞增生56%(P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見圖2。

E2/(nmol·L-1)TypeT47D-HA-vectorT47D-HA-PGRMC1FE2FtypeFinteract0.001110.57±22.02119.45±18.174.56?6.65?1.670.01113.34±19.17122.22±19.590.1120.57±28.52156.13±13.62 ? P<0.05, E2: estradiol;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

圖2 單用雌激素對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增生的影響 Fig.2 Effect of estrogen alone on cell proliferation of T47D breast cancer

T47D-vector cells and T47D-PGRMC1 cells were incubated with estradiol (E2: 0.001,0.01,0.1 nmol/L) alone cell proliferation was measured after 6 days. Data were presented as percentage of unstimulated control cells.*P<0.05vsunstimulated control；#P<0.05vscell proliferation of T47D-vector cells with the same treatment;E2: estradiol;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

2.3 周期序貫方案對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增生的影響

通過使用2×2析因方差分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于T47D-HA-vector細(xì)胞，E2濃度之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，DRSP和NET方案之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，E2濃度、DRSP和NET方案之間沒有交互作用(P>0.05)。對(duì)于T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞，E2濃度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DRSP和NET方案之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E2濃度、DRSP和NET方案之間沒有交互作用(P>0.05),詳見表2。

兩兩比較結(jié)果顯示當(dāng)E2濃度為0.001 nmol/L時(shí)，E2/DRSP(17%)和 E2/NET(18%)方案對(duì)T47D-HA-vector 細(xì)胞增生沒有顯著促進(jìn)作用(P>0.05)，對(duì)于T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞，E2/DRSP(27%)方案刺激后未出現(xiàn)顯著增生(P>0.05)，而 E2/NET(82%)顯著增加了該細(xì)胞的增生(P<0.05)。 與T47D-HA-vector 相比， E2/NET 方案顯著增加了T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞的增生(P<0.05)，詳見圖3。

當(dāng)E2濃度為0.1 nmol/L 時(shí)，E2/DRSP(21%)對(duì)T47D-HA-vector 細(xì)胞增生沒有顯著促進(jìn)作用(P>0.05)，而E2/NET(37%)顯著增加了細(xì)胞增生(P<0.05)，對(duì)于T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞，各不同處理組均表現(xiàn)出明顯的增生(P<0.05),其增生情況依次為E2/DRSP(105%), E2/NET(170%)。與T47D-HA-vector 相比，E2/DRSP和E2/NET 方案均顯著增加了T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞的增生(P<0.05)，詳見圖3。

2.4 連續(xù)聯(lián)合方案對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增生的影響

通過使用2×2析因方差分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于T47D-HA-vector細(xì)胞，E2濃度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DRSP和NET方案之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，E2濃度、DRSP和NET方案之間沒有交互作用(P>0.05)。對(duì)于T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞，E2濃度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DRSP和NET方案之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E2濃度、DRSP和NET方案之間不存在交互作用(P>0.05)，詳見表3。

E2/(nmol·L-1)T47D-HA-vectorDRSPNETT47D-HA-PGRMC1DRSPNET0.001116.87±15.50118.50±12.44127.20±26.69181.66±5.280.1121.11±13.36137.00±7.04204.88±20.27269.91±2.86FE22.48771.24?FDRSP1.47436.96?Finteract0.9810.289 ?P<0.05;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1; E2: estradiol; DRSP: drospirenone; NET: norethisterone.

圖3 周期序貫方案對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增生的影響 Fig.3 Proliferation effect of sequential combination on T47D cells

T47D-vector cells and T47D-PGRMC1 cells were incubated with estradiol (E2: 10-12or 10-10mol/L) in sequential combination with drospirenone (DRSP), and norethisterone (NET) (10-7mol/L). Cell proliferation was measured after 6 days. Data were presented as percentage of unstimulated control cells.*P<0.05vsunstimulated control;#P<0.05vscell proliferation of T47D-vector cells with the same treatment.E2: estradiol;DRSP: drospirenone;NET: norethisterone；PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

兩兩比較結(jié)果顯示當(dāng)E2濃度為0.001 nmol/L時(shí)，E2/DRSP(17%)和 E2/NET(22%)方案對(duì)T47D-HA-vector 細(xì)胞增生沒有顯著促進(jìn)作用(P>0.05)，而E2/DRSP(77%) 和 E2/NET(158%)方案均顯著增加了T47D-HA-PGRMC1的細(xì)胞增生(P<0.05)。與T47D-HA-vector 相比，E2/DRSP和E2/NET 方案均顯著增加了T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞的增生(P<0.05)，詳見圖4。

當(dāng)E2濃度為0.1 nmol/L 時(shí)E2/DRSP(31%)對(duì)T47D-HA-vector 細(xì)胞增生沒有顯著促進(jìn)作用(P>0.05)，而E2/NET(44%)顯著增加該細(xì)胞的增生(P<0.05)，對(duì)于T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞，各不同處理組均表現(xiàn)出明顯的增生(P<0.05),其增生情況依次為E2/DRSP(129%), E2/NET(174%)。 與T47D-HA-vector 相比，E2/DRSP和E2/NET 方案均顯著增加了T47D-HA-PGRMC1細(xì)胞的增生(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 連續(xù)聯(lián)合方案對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增生的影響 Fig.4 Proliferation effect of continuous combination on T47D cells

T47D-vector cells and T47D-PGRMC1 cells were incubated with estradiol (E2： 10-12or 10-10mol/L) in continuous combination with drospirenone (DRSP) and norethisterone (NET) (10-7mol/L). Cell proliferation was measured after 6 days. Data were presented as percentage of to unstimulated control cells.*P<0.05vsunstimulated control;#P<0.05vscell proliferation of T47D-vector cells with the same treatment；E2: estradiol;DRSP: drospirenone;NET: norethisterone；PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，在T47D-HA-PGRMC1 細(xì)胞系中雌激素的作用是劑量依賴性的。當(dāng)雌激素濃度為0.1 nmol/L時(shí)，單用雌激素就能使T47D-PGRMC1細(xì)胞系明顯增生，所以對(duì)于過表達(dá)PGRMC1的乳腺癌患者，建議選擇低劑量的經(jīng)皮或口服雌激素。然而，即使是在雌激素濃度較低的情況下(E2=0.001 nmol/L)，加用NET仍然可以觀察到明顯的對(duì)增生的促進(jìn)作用。所以激素與乳腺癌增生的作用還與激素類型相關(guān)。

E2/(nmol·L-1)T47D-HA-vectorDRSPNETT47D-HA-vectorDRSPNET0.001116.89±8.20121.83±7.88177.12±7.37258.00±10.860.1131.11±17.31143.66±7.44228.62±12.67274.25±8.15FE28.053?34.503?FDRSP1.896120.32?Finteract0.3580.864 ?P<0.05 E2: estradiol; DRSP: drospirenone; NET: norethisterone.

使用周期序貫方案時(shí)，當(dāng)雌激素濃度較低時(shí)(E2=0.001 nmol/L)，僅有E2/NET方案有明顯的促增生作用，但是對(duì)于連續(xù)聯(lián)合方案(E2=0.001 nmol/L)，E2/DRSP, E2/NET 均表現(xiàn)出明顯的促增生作用，說明在雌激素劑量較低情況下，連續(xù)聯(lián)合方案比周期序貫方案對(duì)乳腺癌細(xì)胞增生的刺激作用更明顯。同樣，當(dāng)雌激素劑量增加到0.1 nmol/L 時(shí)，對(duì)于DRSP, 周期序貫方案 E2/DRSP(204.9%)與連續(xù)聯(lián)合方案E2/DRSP(268.6%)相比，連續(xù)聯(lián)合方案更能明顯地促進(jìn)細(xì)胞的增生。然而對(duì)于NET，周期序貫方案E2/NET(258.0%)與連續(xù)聯(lián)合方案 E2/NET(270.0%)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的促進(jìn)增生作用無明顯區(qū)別。

作為非特異性的膜相關(guān)孕激素受體，PGRMC1與孕激素存在中等或較強(qiáng)的親和力[17-18]。除了細(xì)胞色素B5結(jié)構(gòu)域，PGRMC1還有許多結(jié)構(gòu)位點(diǎn)可以與蛋白相互作用，并與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，包括一個(gè)SH3靶序列，兩個(gè)SH2靶序列，一個(gè)酪氨酸激酶位點(diǎn)，兩個(gè)嗜酸性激酶位點(diǎn)及類似細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1的結(jié)合中心。越來越多的證據(jù)表明PGRMC1促進(jìn)癌癥的進(jìn)展。首先，PGRMC1 在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[8-11]。其次，PGRMC1參與多種實(shí)體腫瘤的細(xì)胞功能，如PGRMC1能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的分裂[19]，同時(shí)也能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)移[20]。此外，與本研究結(jié)果一致，本課題組的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[21]表明E2, 以及E2/NET 周期序貫方案刺激下，轉(zhuǎn)染過表達(dá)PGRMC1的裸鼠異種移植瘤體積比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的移植瘤增加2～3倍。

本研究選用T47D細(xì)胞系的主要原因是，其在激素與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中的應(yīng)用較少[22]。 而且，該細(xì)胞系最近被認(rèn)為是乳腺癌研究的理想細(xì)胞系[16,23]。濃度選擇方面，單用雌激素刺激時(shí)，本研究選取了0.1、0.01、0.001 nmol/L 3個(gè)E2 濃度, 是因?yàn)楫?dāng) E2 每日劑量為2 mg 時(shí)，血液E2濃度可達(dá) 50～200 pg/mL，約相當(dāng)于0.01～0.1 nmol/L，而雌激素在組織中的濃度約是其在血液中的十倍[24]。

體外實(shí)驗(yàn)不能代替臨床試驗(yàn)，本課題組進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)僅為臨床研究提供一個(gè)參考思路。另一個(gè)不足之處是僅選用了T47D 乳腺癌細(xì)胞系，但是T47D細(xì)胞系已經(jīng)被證實(shí)為乳腺癌相關(guān)研究的理想細(xì)胞系，而且迄今為止，尚沒有該細(xì)胞系周期序貫方案/連續(xù)聯(lián)合方案比較的研究。

本課題組的研究表明，對(duì)過表達(dá)PGRMC1的乳腺癌患者應(yīng)用連續(xù)聯(lián)合方案比周期序貫方案更有可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增生，合成孕激素NET 的促進(jìn)增生作用最明顯。當(dāng)雌激素應(yīng)用劑量較低時(shí)，不同激素刺激方案對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增生作用影響也較低，所以臨床應(yīng)用雌激素時(shí)應(yīng)使用能夠緩解更年期癥狀的最小雌激素劑量，以期達(dá)到最大臨床效果的同時(shí)，使乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到最低。