張琳婧，梁羽茜，張秋艷，趙丕文，王媛媛，胡秀華*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)又稱震顫麻痹，是第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病，僅次于癡呆，發(fā)病人群集中于中老年段。 當(dāng)前，我國老齡化社會的日益發(fā)展，人均期望壽命逐步增加，患病率預(yù)計會隨之逐漸升高,這不僅嚴(yán)重影響個人生存質(zhì)量及其社會功能，更會增加家庭、社會和經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)[1-2]。流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，老年人群中帕金森病患病率成倍增長，其中，65 歲以上老年人群患病率為1%～2%、85歲以上為3%～5%[3]，患病率60歲為0.25%、65歲為0.5%、70歲為1%、75歲為1.5%、80歲為2.5%、85歲為3.5%～4.0%[4]。

帕金森病屬于中醫(yī)“顫證”范疇，歷代醫(yī)家認(rèn)為帕金森病中醫(yī)病因病機復(fù)雜，但基本病機為本虛標(biāo)實，本虛多為肝脾腎及氣血陰陽虧虛，標(biāo)實為風(fēng)、火、痰、瘀、熱。病程初期，風(fēng)、火、痰、瘀、熱互結(jié)，病久易導(dǎo)致虛實夾雜之證，病程后期則累及肝腎，導(dǎo)致肝腎不足，精血虧虛[5]。帕金森病分為不同證型，包括肝腎陰虛型、痰熱動風(fēng)型、氣血兩虛型及瘀血阻絡(luò)型。中醫(yī)治則以息風(fēng)止顫為主，同時針對不同證型，輔以培補肝腎、清熱化痰、益氣養(yǎng)血及活血通絡(luò)[6]。亞洲使用中藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有先例, 范圍涉及帕金森病、癲癇、中風(fēng)等[7-9]。中藥方劑牽正散由白附子、白僵蠶、全蝎組成, 具有祛風(fēng)化痰, 通絡(luò)止痙的作用。白附子祛風(fēng)化痰、散寒止痛為君藥，全蝎息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛，白僵蠶息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛。全蝎與白僵蠶共為臣藥。現(xiàn)代研究表明，牽正散提取物可能通過減輕線粒體損傷、保護(hù)神經(jīng)元從而顯著抑制帕金森病模型小鼠震顫，改善其運動障礙[10]。本文以中醫(yī)息風(fēng)止痙為出發(fā)點，利用PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，建立PC12細(xì)胞帕金森病模型，并在體外研究牽正散水煎劑對PSI誘導(dǎo)形成的PC12細(xì)胞帕金森病模型的增殖情況的影響。

1 材料與儀器

1.1 材料

蛋白酶體抑制劑I(Proteasome inhibitor I,PSI)，胎牛血清(Gibco美國)，馬血清(Invitrogen)，1640培養(yǎng)基(Gibco),生理鹽水，0.05%胰蛋白酶( Hy-clone公司),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽噻唑藍(lán)(MTT，Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，牽正散購自北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(pheochromocy-toma cells，PC12細(xì)胞)購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 儀器

倒置顯微鏡(Olympus日本)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，CO2培養(yǎng)箱(BINDER德國)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國)，24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)。

1.3 藥物制備

4 gPSI粉末溶解于4 mLDMSO中；白附子、白僵蠶、全蝎各9 g，按常規(guī)中藥煎煮方法煎煮至100 mL時，將牽正散水煎劑移入容量為150 mL的燒杯中，并用高壓滅菌過的培養(yǎng)皿蓋住燒杯口煎煮至10 mL，將燒杯轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，離心1 000 r/min、20 min，取上清液即為牽正散水煎劑，4℃密閉保存。取1 mL牽正散水煎劑與2 mL1640培養(yǎng)基混合加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)基，確定無菌后，將牽正散水煎劑4℃保存，濃度為2 g/mL的儲存液。

2 實驗方法

2.1 MTT法測定牽正散水煎劑對PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用

對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞計數(shù)每孔2×104個/mL溶于1640培養(yǎng)基中，以每孔體積100 μL培養(yǎng)基接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，于每孔加入不同濃度(終濃度分別為1.5,3,6,12,24 mg/mL)牽正散水煎劑的1640培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照組，每組設(shè)6個重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸出孔中全部液體后，用PBS清洗96孔板1次。避光條件下，1 mL濃度為5 mg/mL MTT溶液與9 mL無血清1640培養(yǎng)基混勻后加入96孔板,每孔加10 μL。用錫紙嚴(yán)密包裹整個96孔板，在培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4 h，棄上清并每孔加入150 μLDMSO，于搖床震蕩40 min，置于酶標(biāo)儀570 nm處測量光吸收值(OD值)。按抑制率(%)=(1-實驗組OD均值/對照組OD均值)×100%計算PC12細(xì)胞生長抑制率, 重復(fù)測定牽正散水煎劑對PC12細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)結(jié)果計算出牽正散水煎劑的IC0、IC25、IC50劑量。

2.2 計算牽正散水煎劑的IC0、IC25及IC50劑量

實驗重復(fù)3次，對牽正散水煎劑濃度和PC12的抑制率進(jìn)行線性擬合，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)結(jié)果計算出PC12細(xì)胞生長抑制率為0%時對應(yīng)的牽正散水煎劑濃度(IC0)、PC12細(xì)胞生長抑制率為25%時對應(yīng)的牽正散水煎劑濃度(IC25)及PC12細(xì)胞生長抑制率為50%時對應(yīng)的牽正散水煎劑濃度(IC50)。

2.3 利用DAPI染色熒光觀察結(jié)合伊紅染色觀察PSI誘導(dǎo)PC12形成的帕金森病模型

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以2×104個/mL接種在24孔培養(yǎng)板中，分別用0.1%DMSO和PSI(濃度分別為1,2,4,6,8 μmol/L)處理PC12細(xì)胞48 h后，進(jìn)行HE染色，4%多聚甲醛固定15 min，伊紅染色15 min，雙蒸水沖洗1次，DAPI染色15 min后，放置于熒光顯微鏡下觀察并照相。

2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察PSI誘導(dǎo)PC12形成的帕金森病模型

將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞以2×104個/mL接種24孔培養(yǎng)板，分別用0.1%DMSO和6 μmol/L PSI處理PC12細(xì)胞48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，雙蒸水沖洗1次，蘇木精染液染色15 min，雙蒸水沖洗1次，伊紅染液染色15 min，雙蒸水沖洗后于倒置顯微鏡鏡下觀察。此間在加PSI后24 h,48 h時于倒置顯微鏡下觀察并照相。

2.5 不同濃度牽正散水煎劑對PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞帕金森病模型增殖的影響

對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞計數(shù)每孔2×104個/mL溶于1640培養(yǎng)基中，以每孔體積100 μL培養(yǎng)基接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，PSI模型組加入濃度為6 μmol/L的PSI誘導(dǎo)細(xì)胞形成帕金森病模型；牽正散水煎劑組分別加入IC0(3.038 6 mg/mL)，IC25(8.403 4 mg/mL)和IC50(13.768 2 mg/mL)；PSI加牽正散水煎劑組先后加入IC0(3.038 6 mg/mL)，IC25(8.403 4 mg/mL)和IC50(13.768 2 mg/mL)和濃度為6 μmol/L的PSI；同時設(shè)空白對照組，每個組設(shè)6個重復(fù)孔。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸出孔中全部液體后，用PBS清洗1次96孔板。避光條件下，1 mL濃度為5 mg/mL MTT溶液與9 mL無血清1640培養(yǎng)基混勻后加入96孔板,每孔加10 μL。用錫紙嚴(yán)密包裹整個96孔板，在培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4 h，棄上清并每孔加入150 μLDMSO，于搖床震蕩40 min，置于酶標(biāo)儀570 nm處測量光吸收值(OD值)。按抑制率(%)=(1-實驗組OD均值/對照組OD均值)×100%計算PC12細(xì)胞生長抑制率,測定牽正散水煎劑對PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞帕金森病模型增殖的影響，重復(fù)3次，并根據(jù)結(jié)果計算出抑制率。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 不同濃度牽正散水煎劑對PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性

用不同濃度的牽正散水煎劑(終濃度分別為1.5,3,6,12,24 mg/mL)分別處理細(xì)胞，同時設(shè)立空白對照組，48 h后，MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，1.5 mg/mL和3 mg/mL牽正散水煎劑處理PC12細(xì)胞時，可促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，分別促進(jìn)增殖達(dá)到3%和8%；濃度為6 mg/mL、12 mg/mL和24 mg/mL牽正散水煎劑處理PC12細(xì)胞時，呈不同程度的抑制作用，抑制率分別為5%，61%，91%，在24 mg/mL時抑制率達(dá)到最高91%，12 mg/mL組和24 mg/mL組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 MTT測定牽正散對PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05

3.2 計算牽正散水煎劑對PC12細(xì)胞的IC0、IC25及IC50劑量

實驗重復(fù)3次，對牽正散水煎劑濃度和PC12的抑制率進(jìn)行線性擬合，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)結(jié)果計算出細(xì)胞生長抑制率為0%時對應(yīng)的藥物濃度(IC0)、細(xì)胞生長抑制率為25%時對應(yīng)的藥物濃度(IC25)及細(xì)胞生長抑制率為50%時對應(yīng)的藥物濃度(IC50)，結(jié)果見表2。

表2 牽正散水煎劑對PC12細(xì)胞的IC0、IC25、IC50劑量濃度

3.3 PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞形成體外帕金森病模型

不同濃度PSI處理PC12細(xì)胞48 h后，DAPI和伊紅共同染色后，觀察結(jié)果如圖1所示，正常對照組，部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，散在或聚團(tuán)生長，細(xì)胞大小及形態(tài)均勻一致，呈圓形，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核為橢圓形，核膜完整，邊界清楚，結(jié)構(gòu)正常，未見細(xì)胞核附近有其他染色物質(zhì)出現(xiàn)；PSI模型組與空白對照組相比，隨PSI濃度增大，同一視野下，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核邊界模糊，形態(tài)改變，核膜不完整，細(xì)胞核附近出現(xiàn)紅色嗜伊紅物質(zhì)。在PSI濃度1 μmol/L和2 μmol/L時，細(xì)胞數(shù)量有少量減少，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞形態(tài)有輕微改變，但與正常對照組沒有明顯區(qū)別；在PSI濃度4 μmol/L時，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變明顯，胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)嗜酸性表達(dá)；PSI濃度6 μmol/L時，細(xì)胞形態(tài)改變異常，由圓形變成纖維狀，體積增大，并在細(xì)胞漿內(nèi)明顯可見被伊紅染色的嗜酸性包含體，類似帕金森病的標(biāo)志性病理改變Lewy小體，如圖1中箭頭所示；PSI濃度8 μmol/L時，細(xì)胞數(shù)量減少，懸浮細(xì)胞及細(xì)胞周圍碎片增多，且形態(tài)改變及嗜酸性小體表達(dá)不太明顯，結(jié)果見圖1。

注：A-C：嗜酸性小體圖1 DAPI結(jié)合伊紅染色觀察不同濃度PSI處理PC12細(xì)胞后嗜酸性小體形成的情況(×400)

3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察PSI誘導(dǎo)PC12形成的帕金森病模型

用濃度為6 μmol/L的PSI分別處理PC12細(xì)胞24 h和48 h后，倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)24 h及48 h后，空白對照組均無明顯形態(tài)學(xué)及數(shù)量改變，細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)無雜質(zhì)； PSI模型組在24 h后即出現(xiàn)堆疊與聚集趨勢，細(xì)胞體積增大，少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜不完整，胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)雜質(zhì)，48 h后細(xì)胞堆疊與聚集趨勢愈發(fā)明顯，較空白對照組細(xì)胞體積大，細(xì)胞膜不完整，形態(tài)破碎，胞漿內(nèi)有大量雜質(zhì)，細(xì)胞周圍有凋亡碎片形成，且具有時間依賴性。

進(jìn)一步HE染色驗證，PSI作用PC12細(xì)胞48 h后進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖3所示，空白對照組PC12細(xì)胞胞核嗜堿性染色，胞漿嗜酸性染色，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核呈圓形及類圓形，細(xì)胞漿內(nèi)無雜質(zhì)出現(xiàn)；PSI模型組細(xì)胞，細(xì)胞體、細(xì)胞核體積明顯增大，胞漿內(nèi)空泡增多同時出現(xiàn)嗜酸性類Lewy小體，此小體嗜伊紅、邊界清楚。進(jìn)一步證明PSI為6 μmol/L時，所得的體外帕金森病模型最為典型。

注:A:空白對照組24 h;B:空白對照組48 h;C:PSI6 μmol/L 24 h;D:PSI6 μmol/L 48 h圖2 倒置顯微鏡下觀察PSI 6 μmol/L誘導(dǎo)PC12細(xì)胞變成帕金森病模型的形態(tài)改變(×400)

注：A-D：胞漿內(nèi)出現(xiàn)的嗜酸性包含體圖3 HE染色PSI處理PC12細(xì)胞48 h后嗜酸性小體形成的情況(×400)

3.5 不同濃度牽正散水煎劑對PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞帕金森病模型增殖的影響

不同濃度的牽正散水煎劑(濃度分別為3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL)分別作用在含有6 μmol/L PSI的PC12細(xì)胞中，48 h后，進(jìn)行MTT檢測，實驗重復(fù)3次，對不同濃度牽正散水煎劑對PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞帕金森病模型增殖結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果如表3所示，與空白對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中PSI模型組抑制率高達(dá)38.23%，牽正散水煎劑組在濃度為3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL時，抑制率分別為12.04%、17.32%和42.43%。PSI+牽正散水煎劑組在濃度時分別為3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL時，抑制率分別為24.53%、27.13%和41.76%。與PSI模型組比，PSI+牽正散水煎劑組中除濃度為13.768 2 mg/mL的牽正散水煎劑外，其他濃度的3.038 6 mg/mL和8.403 4 mg/mL的牽正散水煎劑，對PSI導(dǎo)致的PC12細(xì)胞增殖的抑制有不同程度的改善。其中PSI+3.038 6 mg/mL和PSI+8.403 4 mg/mL牽正散水煎劑組可以明顯改變PSI所致的PC12細(xì)胞的增殖抑制，由抑制率38.23%，改變?yōu)?4.53%和27.13%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中，3.038 6 mg/mL濃度的牽正散水煎劑對PSI模型組效果最好。說明牽正散水煎劑可以明顯改善由PSI誘導(dǎo)的PC12帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞增殖狀況。

表3 MTT測定牽正散水煎劑對PSI對PC12細(xì)胞模型的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與PSI模型組比較，#P<0.05

4 討論

帕金森病的病機特點主要是本虛標(biāo)實，在標(biāo)實即風(fēng)、火、痰、瘀、熱互結(jié)的基礎(chǔ)上，導(dǎo)致本虛肝腎虧虛?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩?“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”。中醫(yī)認(rèn)為，肝主疏泄，主筋，屬木。肝陰不足日久，則陰虛陽亢化風(fēng)，出現(xiàn)頭搖、肢顫；同時“陰虛而內(nèi)風(fēng)生”,導(dǎo)致陰液不能濡養(yǎng)筋脈出現(xiàn)肢體抽搐；另一方面氣機升降失調(diào)，肝氣郁結(jié)化火，肝陽擾動化熱生風(fēng)也可導(dǎo)致四肢顫震不已。由此可見“風(fēng)氣內(nèi)動”是本病的病機核心，由風(fēng)致顫。因此中醫(yī)治則多以息風(fēng)止痙為主，加以辨證論治[11]。而牽正散的功效是祛風(fēng)化痰止痙，據(jù)現(xiàn)代藥理研究證明：白附子、白僵蠶、全蝎均具有不同程度的抗癲癇、抗驚厥功能[12-14]。其中熊成成等[12]的研究表明，白附子具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗炎、鎮(zhèn)痛作用。李晶峰等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，白僵蠶具有抗凝、抗驚厥、抗血栓、抑菌、抗癌等藥效。史磊等[14]發(fā)現(xiàn)全蝎中含有蝎毒、核苷類等生物活性成分,具有抗腫瘤、抗癲癇、抗哮喘、抗血栓、抗凝、鎮(zhèn)痛等藥理作用。因此本實驗基于以上理論基礎(chǔ),研究牽正散水煎劑對PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的體外帕金森病模型影響。

近年來，外源性神經(jīng)毒素誘導(dǎo)形成PD細(xì)胞模型的研究方法，在PD發(fā)病機制研究中發(fā)揮重要作用[15]。PC12細(xì)胞株具有神經(jīng)細(xì)胞特性，且可穩(wěn)定傳代，其主要分泌物為兒茶酚胺類物質(zhì)。目前，PC12細(xì)胞模型已成為抗PD藥物的體外基礎(chǔ)研究的理想細(xì)胞模型[16]。此模型利用MPTP建立，是探索PD發(fā)生機制、生化異常、線粒體異常及篩選神經(jīng)保護(hù)藥物的良好模型[17]，而用蛋白酶抑制劑(PSI)作用于PC12細(xì)胞建立的PD模型，實驗中模擬的包涵體在形態(tài)和結(jié)構(gòu)等方面，最接近PD患者的嗜酸性小體，成功再現(xiàn)了PD的重要特征[18]。本實驗中DAPI染色結(jié)果顯示，PSI濃度為4 μmol/L開始出現(xiàn)嗜酸性小體，PSI濃度為6 μmol/L最典型；從而將6 μmol/L應(yīng)用于HE染色中，在HE染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)同樣嗜酸性類Lewy小體，提示PSI誘導(dǎo)PC12細(xì)胞模擬帕金森病模型造模成功；使用PSI6 μmol/L造模成功后，我們將之前篩選的牽正散水煎劑的IC0、IC25、IC50應(yīng)用于PC12細(xì)胞帕金森病模型，結(jié)果顯示PSI+IC0(PSI+3.038 6 mg/mL)與PSI+IC25(PSI+8.403 4 mg/mL)組與空白對照組和PSI模型組比較，結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明合適濃度的牽正散水煎劑可降低PSI對PC12細(xì)胞的抑制率，即對PSI誘導(dǎo)的PC12帕金森病模型具有保護(hù)作用。PSI的誘導(dǎo)使PC12細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)出現(xiàn)帕金森病的病理特征，首先提示，PSI適合做誘導(dǎo)劑用來造模，同時提示PC12細(xì)胞適合用來造模，最終指向PSI誘導(dǎo)的PC12體外帕金森病模型適合做體外抗PD模型。同時，MTT結(jié)果也揭示牽正散水煎劑對該體外細(xì)胞模型的保護(hù)作用，并且牽正散配伍符合中醫(yī)辨證論治治則，同時有現(xiàn)在藥理學(xué)研究佐證，為其科學(xué)性提供理論及現(xiàn)實支撐。

綜上所述，本實驗確定了PSI濃度6 μmol/L時誘導(dǎo)形成的PC12細(xì)胞模型具有帕金森病的特點，并可以應(yīng)用到實驗研究中。同時，不同濃度牽正散水煎劑對PC12細(xì)胞帕金森病模型具有不同的保護(hù)作用，其中3.038 6 mg/mL濃度的牽正散水煎劑對改善體外細(xì)胞帕金森病模型效果最好，本實驗為牽正散的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，為臨床藥物治療帕金森病提供新的思路。