劉瑞芳 張蓉芳 李桂榮 雷苗 高文龍?zhí)m州大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計所730000; 甘肅省婦幼保健院國際醫(yī)療部哮喘門診,蘭州730050

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應為主要特征的常見呼吸道疾病。WHO 報告截止2017年底全球約有2.35億人罹患哮喘,約40萬人因哮喘而死亡[1]。哮喘與免疫、遺傳、環(huán)境以及其他因素有關,其中遺傳因素可能占病因的48%～79%[2-3]。目前雖然哮喘發(fā)病機制未完全闡明,但研究表明維生素D 受體 (vitamin D receptor,VDR)基因是其重要候選基因之一[4-6]。VDR 基因是一類多功能基因,往往與自身免疫性疾病、炎癥和過敏性疾病發(fā)病有關[5,7-12]。由于不同的國家地區(qū)、民族、環(huán)境等因素影響,VDR 基因多態(tài)性與哮喘之間的關聯(lián)還未能得出一致結論,Saadi等[13]做的山東漢族成人VDR 基因與哮喘關系的病例對照研究表明Apa Ⅰ位點與成人哮喘有關,Maalmi等[14]對埃及兒童的研究顯示ApaⅠ位點與哮喘患病無關而Bsm Ⅰ、Fok Ⅰ和Taq Ⅰ位點與哮喘有關。為此本研究用meta 分析方法來研究VDR 基因多態(tài)性與哮喘的關系,為哮喘遺傳研究提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索策略 檢索Pub Med、EMBASE、Wed of Science、Elsevier、中國知網(wǎng)、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)平臺等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫從1980年到2017年7月的文獻,并手工檢索國內(nèi)外相關雜志。中文檢索策略: (VDR or維生素D 受體)和 (多態(tài)性or SNP)和(哮喘);英文檢索策略: (“vitamin D receptor”or“VDR”)和 (“SNP”or“genetic variation”)和asthma;檢索語言為中文和英語。

1.2 文獻納入與排除標準 納入標準為:(1)關于VDR 基因多態(tài)性與哮喘相關性研究;(2)研究類型為病例對照研究;(3)提供或可推算病例組及對照組各基因型的頻數(shù)數(shù)據(jù);(4)對照組是非哮喘患者且無過敏性疾病病史。排除標準為: (1)綜述、病例報道、非人群研究;(2)重復研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取及質(zhì)量評價 數(shù)據(jù)提取內(nèi)容包括:第一作者、發(fā)表年限、研究地點、樣本的特征(年齡、性別、種族、例數(shù))、哮喘診斷標準、VDR 基因各多態(tài)性位點基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)。在確定VDR 基因位點等位基因野生型和突變型時依據(jù)Pub Med中查詢的SNP 中rs序列信息公布的全球最小等位基因頻率和祖先等位基因 (Ancestral Allele)信息,最終確定VDR 基因4 個位點ApaⅠ(rs7975232 C＞A C 為野生型,A 為突變型)、Fok Ⅰ(rs2228570 T＞C T 為野生型,C 為突變型)、Bsm Ⅰ (rs1544410 G＞A G 為野生型,A為突變型)和Taq Ⅰ (rs731236 T＞C T 為野生型,C 為突變型)。按照Newcastle-Ottawa Scale(NOS)評分標準對納入研究評價方法學質(zhì)量,評價標準滿分共9分。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用Stata 12.0軟件完成meta分析。(1)分別采用顯性、隱性和等位基因模型,合并計算各研究比值比 (odds ratios,OR)及其95% 置 信 區(qū) 間 (95% confidence interval,95%CI);按種族 (黃種人、白人、黑人),年齡(≤20歲、＞20歲),性別(男≥50%、男＜50%)分層并進行亞組分析。(2)通過計算I2值和Q 檢驗,衡量納入文獻的異質(zhì)性。若I2＜50%或P＞0.1,認為多個研究之間具有同質(zhì)性,選擇固定效應模型;若I2＞50%或者P＜0.1,則采用隨機效應模型。 (3)用Egger's檢驗定量分析發(fā)表性偏倚,逐步排除法做敏感性分析。

2 結果

2.1 納入文獻概況 共檢索出相關文獻443 篇,經(jīng)初篩、剔除與研究目的無關、綜述和動物實驗以及無法獲得VDR 基因多態(tài)性位點基因頻數(shù)文獻后(圖1)共納入16篇文獻,研究類型均為病例對照研究設計,累積研究對象病例組2 823例,對照組3 184例,涉及7個國家 (包括中國、埃及、突尼斯、塞浦路斯、伊朗、塞爾維亞和美國)。其中中文文獻5篇、英文文獻11篇。研究對象有黃種人8篇、白人5篇和黑人3篇。納入研究中報告ApaⅠ、Fok Ⅰ、Bsm Ⅰ和Taq Ⅰ位點的研究分別為11篇、11篇、8篇和8篇。按照NOS評價標準評估納入研究的方法學質(zhì)量,納入文獻得分均在6分及以上(表1)。

2.2 meta分析結果

2.2.1 ApaⅠ位點 11篇文獻做ApaⅠ位點與哮喘相關研究。病例組1 875例,對照組2 448例。異質(zhì)性檢驗顯示顯性基因模型AA+AC 比CC (I2=55.60%,P=0.01)、隱性基因模型AA 比AC+CC (I2=56.70%,P=0.01)、等位基因模型A比C (I2=68.70%,P=0.00)存在較高異質(zhì)性,選用隨機效應模型。Apa Ⅰ位點的顯性、隱性、等位基因模型與哮喘患病無關聯(lián) (顯性基因模型OR=1.05,95%CI:0.80～1.36;隱性基因模型OR=1.13,95%CI:0.84～1.51;等位基因模型OR=1.00,95%CI:0.82 ～1.22;圖2～4)。

圖1 維生素D受體基因多樣性與哮喘相關性研究meta分析文獻篩選過程

2.2.2 Bsm Ⅰ位點 8篇文獻研究了Bsm Ⅰ位點與哮喘關聯(lián)性,病例組1 241例,對照組1 950例。異質(zhì)性檢驗表明顯性基因模型AA+AG 比GG(I2=0.00%,P=0.86)、隱性基因模型AA 比AG+GG (I2=44.20%,P=0.10)二者采用固定效應模型;等位基因模型A 比 G (I2=93.40%,P=0.00)采用隨機效應模型。Bsm Ⅰ位點顯性、隱性和等位基因模型與哮喘相關性無統(tǒng)計學意義 (顯性基因模型OR=0.92,95%CI:0.75 ～1.14; 隱性基因模型OR= 0.87,95%CI:0.64～1.19;等位基因模型OR=0.60,95%CI:0.31～1.15;圖5～7)。

圖2 ApaⅠ位點顯性基因模型與哮喘關聯(lián)性的meta分析

2.2.3 Fok Ⅰ位點 11篇研究報道了Fok Ⅰ位點與哮喘的相關性,病例組2 327例,對照組2 070例。異質(zhì)性檢驗結果中顯性模型CC+CT 比TT (I2=59.80%,P=0.01)、隱性模型CC 比CT+TT (I2=82.50%,P=0.00)、等位基因模型C比T (I2=83.60%,P=0.00)有較高異質(zhì)性,采用隨機化模型。Fok Ⅰ位點顯性、隱性、等位基因模型與哮喘相關性無統(tǒng)計學意義(顯性基因模型OR=1.03,95%CI:0.79～1.35;隱性基因模型OR=1.10,95%CI:0.76～1.58;等位基因模型OR=1.05,95%CI:0.83～1.32;圖8～10)。

表1 納入文獻的一般特征

圖3 ApaⅠ位點隱性基因模型與哮喘關聯(lián)性的meta分析

圖4 ApaⅠ位點等位基因模型與哮喘關聯(lián)性的meta分析

圖5 Bsm Ⅰ位點顯性基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖6 Bsm Ⅰ位點隱性基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖7 Bsm Ⅰ位點等位基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖8 Fok Ⅰ位點顯性基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖9 Fok Ⅰ位點隱性基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖10 Fok Ⅰ位點等位基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

2.2.4 TaqⅠ位點 8篇研究報道了Taq Ⅰ位點與哮喘的相關性,病例組1 735例,對照組2 271例。異質(zhì)性檢驗后顯性基因模型CC+CT 比TT (I2=0.00%,P=0.56)、等位基因模型C 比T(I2=0.00%,P=0.62)采用固定效應模型;隱性基因模型CC 比CT+TT (I2=58.60%,P=0.02)采用隨機效應模型;TaqⅠ位點顯性基因模型 (OR=1.23,95%CI:1.05～1.44)、等位基因模型 (OR=1.23,95%CI:1.10～1.38)與哮喘關聯(lián)性有統(tǒng)計學意義,C等位基因可提高哮喘患病風險;隱性基因模型 (OR=1.35,95%CI:0.90～2.01)與哮喘關聯(lián)性不存在統(tǒng)計學意義。亞組分析顯示白人在顯性基因模型 (OR=1.34,95%CI:1.10～1.63)、等位基因模型中(OR=1.27,95%CI:1.10～1.46)均提示攜帶C基因可提高哮喘患病風險;黑人在隱性基因模型(OR=1.84,95%CI:1.19～2.85)、等位基因模型中 (OR=1.36,95%CI:1.06～1.75)表明攜帶C基因可提高哮喘患病風險。年齡亞組分析中＞20 歲組在顯性基因模型 (OR=1.27,95%CI:1.04～1.55)、等位基因模型中 (OR=1.24,95%CI:1.07～1.44)顯示攜帶C 基因可提高哮喘患病風險。性別亞組分析中男性＜50%組在顯性基因模型 (OR=1.26,95%CI:1.05～1.52)、等位基因模型中 (OR=1.23,95%CI:1.08～1.41)提示攜帶C 基因可提高哮喘患病風險(圖11～13)。

圖11 TaqⅠ位點顯性基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖12 TaqⅠ位點隱性基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

圖13 TaqⅠ位點等位基因模型與哮喘關聯(lián)的meta分析

2.3 發(fā)表性偏倚及敏感性分析 對ApaⅠ、BsmⅠ、Fok Ⅰ和TaqⅠ位點納入的文獻用Egger's檢驗進行發(fā)表性偏倚分析,Egger's檢驗結果P值分別為0.95、0.47、0.81和0.21,均提示不存在發(fā)表性偏倚。通過逐一排除法對Apa Ⅰ、Bsm Ⅰ、Fok Ⅰ和TaqⅠ位點顯性、隱性和等位基因模型敏感性分析后結果均較為穩(wěn)定。

3 討論

本研究匯總了16 篇關于VDR 基因多態(tài)性與哮喘患病關系的病例對照研究,用顯性、隱性和等位基因模型將VDR 基因4個位點 (Apa Ⅰ、BsmⅠ、Fok Ⅰ和Taq Ⅰ位點)對哮喘患病影響的效應值進行合并,經(jīng)meta分析發(fā)現(xiàn)Taq Ⅰ位點變異與哮喘患病存在關聯(lián),提示攜帶C 基因可提高哮喘患病風險,這與Tizaoui等[26]做的meta分析結果 (OR=1.49,95%CI:1.02～2.17)一致,但與Han 等[27]meta 分析結果 (OR=0.86,95%CI:0.79～0.94)相反。本研究未發(fā)現(xiàn)ApaⅠ、BsmⅠ和Fok Ⅰ位點與哮喘患病有關,這與Zhao等[28]針對兒童的meta分析結果不一致。基因分型是準確揭示基因變異與疾病相關性的重要基礎,雖然Tizaoui等[26]、Han 等[27]和Zhao 等[28]在不同時期做了相關meta分析,但是提取基因數(shù)據(jù)時基因分型標準沒有做明確陳述,合并OR值可能缺乏一定信度。而本文在數(shù)據(jù)提取時明確基因分型標準,對分型標準不明確或無法區(qū)分的研究均未做納入,這可能是本文與之前meta分析結果不同的重要原因[29-33]。另外,本研究納入了最新的研究,文獻數(shù)量更多,樣本量更大,合并效應值可能更為可靠。

本文進一步對Taq Ⅰ位點變異與哮喘關聯(lián)做了人種、年齡和性別亞組分析,結果表明白人或黑人、年齡＞20歲或男性＜50%各組均顯示攜帶C基因可提高哮喘患病風險,而黃種人、年齡≤20歲或男性≥50%各組未發(fā)現(xiàn)二者關聯(lián),TaqⅠ位點變異對哮喘患病作用受到種族、年齡和性別因素影響。種族影響VDR 基因多態(tài)性對哮喘患病作用已有相關報道[13,22];年齡對該效應的影響,一方面可能由于兒童哮喘與成人哮喘在患病機制上存在一定的差異[15,22];另一方面,隨著年齡增長,環(huán)境因素的致病作用積累效應增多與Taq Ⅰ基因位點變異更容易產(chǎn)生聯(lián)合作用。性別對VDR 基因與哮喘患病關聯(lián)的影響提示女性較男性可能更傾向TaqⅠ位點基因的變異,性別相關基因作用機制有待進一步的研究澄清。

從VDR 基因結構分析,Fok Ⅰ位點位于編碼區(qū),可影響VDR 基因編碼氨基酸,但本文未發(fā)現(xiàn)Fok Ⅰ位點變異與哮喘患病存在關聯(lián);相反,位于非編碼區(qū)的Bsm Ⅰ、ApaⅠ、TaqⅠ3個位點中,TaqI位點變異與哮喘患病有關系,這表明VDR 基因?qū)ο疾〉淖饔弥饕诜蔷幋a區(qū),而Taq Ⅰ位點可能在VDR 基因?qū)ο疾≌{(diào)控機制中起主導作用。從非編碼區(qū)基因位點功能分析,TaqⅠ位點變異會影響VDR 基因m RNA 的穩(wěn)定性和VDR蛋白的表達效率,進而影響到VDR 與維生素D 結合、體內(nèi)維生素D 吸收和生理功能的發(fā)揮[34]。有研究顯示TaqⅠ位點C基因攜帶者血清25 (OH)D 水平明顯低于未攜帶者,而流行病學研究也發(fā)現(xiàn)哮喘患者血清25 (OH)D 水平偏低,這些發(fā)現(xiàn)有效證明本文結果的合理性[16,18,35]。維生素D 對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制研究表明維生素D 在Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)中起重要作用[36],當哮喘患者血清1，25-（OH）2D3水平明顯降低時,患者體內(nèi)T 輔助細胞向Th2分化使得Th2型細胞因子IL-4和IL-8過度表達,Th1/Th2平衡偏向Th2狀態(tài),導致細胞內(nèi)產(chǎn)生過量IgE并促使嗜酸粒細胞在氣道聚集引發(fā)氣道高反應,IL-8 因子還可引起嗜酸粒細胞釋放組織胺引發(fā)炎癥反應[14,37-39]。動物實驗表明,VDR 受體缺乏小鼠Th2水平較低;實驗通過脂多糖誘導小鼠哮喘時,VDR 基因敲除小鼠相對于野生型小鼠的肺部炎癥及哮喘反應癥狀均較輕,其原因可能是當VDR 基因敲除之后導致VDR 數(shù)量缺乏,肺環(huán)境對炎癥反應和吸引致病性免疫細胞(Th2細胞和嗜酸粒細胞)方面存在障礙。VDR 缺乏可以在1，25-（OH）2VD3的作用下使皮膚歸巢趨化因子CCR10的表達減少,使得α4β7介導T 細胞轉移至皮膚數(shù)量減少,使得VDR 缺乏小鼠對哮喘癥狀和炎癥性反應減弱[6,40-41]。雖然VDR 基因與哮喘發(fā)生發(fā)展有關,但Taq Ⅰ位點變異如何影響VDR 數(shù)量及維生素D 水平進而引發(fā)哮喘的更深入的分子機制仍需針對性的實驗研究來證實。

本研究有不足之處:(1)納入黑人相關研究只有3篇,比其他人種研究偏少,可能存在由文獻納入導致的偏倚;(2)哮喘是基因與環(huán)境等因素共同作用的慢性疾病,本研究未考慮環(huán)境因素與VDR基因的交互作用[42]。因此,VDR 基因位點多態(tài)性對哮喘患病的效應可能存在環(huán)境因素的混雜作用。

總之,VDR 基因中Taq Ⅰ位點變異與哮喘有關聯(lián)性,C等位基因可提高哮喘的患病風險,這為揭示哮喘患病遺傳機制提供了非常重要的線索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明劉瑞芳、張蓉芳負責論文撰寫;李桂榮協(xié)助文獻收集和數(shù)據(jù)提取;雷苗協(xié)助數(shù)據(jù)分析;高文龍負責選題和數(shù)據(jù)分析指導