王松 白義春 馬雅娜 劉聰 郭冰心 吉宏龍新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院肺病與分子治療研究所453003;德克薩斯大學(xué)泰勒醫(yī)學(xué)研究中心細(xì)胞與分子生物學(xué)系,泰勒75708

呼吸系統(tǒng)疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病?？諝馕廴?、吸煙以及人口老齡化等多種因素使呼吸系統(tǒng)疾病的流行病學(xué)和疾病譜分布正在發(fā)生改變。由于缺乏高效特異的藥物治療,肺移植是目前治療終末期呼吸系統(tǒng)疾病較為可靠的方法,但該方法卻受到供體缺乏以及免疫排斥反應(yīng)等因素的限制[1]。所以,我們亟需一個高通量藥物篩選模型,進(jìn)行更有效的藥物研發(fā)和篩選,這對發(fā)現(xiàn)新的精準(zhǔn)治療措施至關(guān)重要?！靶酒巍笔且环N在微流控芯片上利用微加工技術(shù)制造出的仿生肺三維模型。它可以模擬肺臟氣血屏障的部分功能、肺部炎癥和肺水腫的發(fā)生過程,用于評估空氣中納米顆粒的吸收,以及評價新藥的安全性和有效性。此外,通過細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)還可建立非小細(xì)胞肺癌模型,對肺癌的發(fā)生過程進(jìn)行研究。本文將從 “芯片肺”的結(jié)構(gòu)、研究進(jìn)展等方面進(jìn)行介紹。

1 “芯片肺”的結(jié)構(gòu)及其作用原理

1.1 “芯片肺”的結(jié)構(gòu) 哈佛大學(xué)維斯生物工程研究院的研究人員首次研制出可以模擬肺泡功能的 “芯片肺” (圖1),這種 “芯片肺”能夠精確的模擬人肺不同組織間的相互作用,在肺泡水平上重現(xiàn)肺的部分生理功能[2]。 “芯片肺”分為上下兩層,上層為氣體通道,模擬肺泡腔;下層為液體通道,模擬血管腔,中間由多孔的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)薄膜 (10μm)將其分隔。在PDMS 薄膜的上、下表面均包被一層細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),上表面培養(yǎng)暴露在空氣中的人體肺泡上皮細(xì)胞,下表面培養(yǎng)浸潤在液體中的血管內(nèi)皮細(xì)胞,在體外模擬人肺泡氣血屏障的主要結(jié)構(gòu)、功能和力學(xué)性質(zhì)。細(xì)胞在接種到附有ECM 的PDMS薄膜對立面后,分別在各自的通道中形成緊密連接的單層細(xì)胞。之后,氣體通道中通入空氣,模擬在體狀態(tài)下肺泡上皮細(xì)胞生存的氣-液界面,液體通道中通入液體,模擬在體狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞生存的液體環(huán)境。氣體進(jìn)入氣體通道后,肺泡上皮細(xì)胞分泌表面活性物質(zhì)增多,形成氣-液界面,增強了肺泡穩(wěn)定性;當(dāng)液體通道通入液體后,血管內(nèi)皮細(xì)胞被重新排列。在 “芯片肺”的左右兩側(cè)存在兩個側(cè)室與兩個真空泵相連,通過規(guī)律地改變側(cè)室的壓力,引起PDMS薄膜規(guī)律的起伏,進(jìn)而模擬肺的呼吸運動[3]。目前 “芯片肺”已成功地在體外模擬了肺氣血屏障的多項基本功能。

圖1 “芯片肺”結(jié)構(gòu)示意圖[2]

1.2 “芯片肺”的作用原理 肺泡是肺的基本功能單位。平靜呼吸時,吸氣運動膈肌與肋間外肌收縮,胸廓擴(kuò)大,外界大氣壓力高于肺內(nèi)氣壓,外界空氣流入肺泡,肺泡隨之?dāng)U大,使肺泡上皮細(xì)胞和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞伸展;呼氣運動膈肌和肋間外肌松弛,胸腔容積縮小,肺彈性回縮,肺內(nèi)壓也隨之升高,當(dāng)高于大氣壓時,肺內(nèi)氣體排出肺泡,使肺泡上皮細(xì)胞和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞回縮?！靶酒巍蓖ㄟ^與兩個側(cè)室相連的真空泵的規(guī)律作用,引起兩個側(cè)室內(nèi)壓力的變化,進(jìn)而引起PDMS 薄膜形變。與PDMS薄膜緊密相連的肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也隨之發(fā)生伸展和回縮,以此來模擬肺呼吸運動時產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力[3]。不同的是,肺呼吸運動時,肺泡與外界大氣之間的壓力差為肺通氣提供了直接動力,“芯片肺”模型中真空泵的規(guī)律變化引起的壓力差僅通過引起PDMS薄膜的彈性形變來模擬肺泡在肺通氣過程中的起伏,并不能模擬呼吸肌運動提供的原動力。另外,“芯片肺”還不能實現(xiàn)人肺肺泡與血流之間的換氣功能。

呼吸道與外界相通,全身血液均流經(jīng)肺臟,故肺臟易遭受身體內(nèi)外微生物的侵襲。因此,肺臟除了主管呼吸功能外還具備非呼吸性的防御與免疫功能?！靶酒巍蹦Ｐ统丝梢阅M呼吸運動外,還能模擬肺臟免疫功能。通過在“芯片肺”的氣體通道和液體通道中分別加入炎癥因子和免疫細(xì)胞,模擬體內(nèi)肺炎等呼吸疾病發(fā)生時的免疫過程。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞使細(xì)胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表達(dá)增強,促進(jìn)了中性粒細(xì)胞的黏附。中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞扁平化,由血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙滲出,通過PDMS薄膜出現(xiàn)在肺泡上皮細(xì)胞。在 “芯片肺”中加入免疫細(xì)胞,可以實時監(jiān)控循環(huán)的免疫細(xì)胞在疾病發(fā)展中的作用[4-5]。除循環(huán)的免疫細(xì)胞外,肺部駐留的免疫細(xì)胞在肺部疾病發(fā)展中也起著重要作用[6],不足的是,“芯片肺”無法模擬駐留的免疫細(xì)胞在肺部疾病發(fā)展中的具體作用。

2 “芯片肺”與細(xì)胞模型和動物模型的差別

2.1 “芯片肺”與細(xì)胞模型的差別 通常新藥的藥效及毒性測試實驗在細(xì)胞模型及動物模型中進(jìn)行,單一細(xì)胞的靜態(tài)培養(yǎng)是組織病理學(xué)、藥效學(xué)和藥代動力學(xué)最常用的細(xì)胞模型。但其無法模擬各種肺細(xì)胞間的相互作用和呼吸運動。另外,呼吸運動產(chǎn)生的機(jī)械力和血流產(chǎn)生的剪切力對肺細(xì)胞的生長、修復(fù)、損傷、炎癥、表面活性物質(zhì)的釋放以及組織的發(fā)育有著強烈的影響[7],所以單一細(xì)胞的靜態(tài)培養(yǎng)無法準(zhǔn)確的模擬體內(nèi)細(xì)胞生長和藥物代謝真實環(huán)境[8-10]?！靶酒巍蹦軌蚰M呼吸運動產(chǎn)生的機(jī)械力和血流產(chǎn)生的剪切力,使細(xì)胞的生長、分化的力學(xué)條件更接近人體。在“芯片肺”的氣-液界面培養(yǎng)的肺泡上皮細(xì)胞與靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)相比增大了通過細(xì)胞層的電阻和屏障功能,表現(xiàn)出與肺相似的蛋白通過率[3,11]。

2.2 “芯片肺”與動物模型的差別 動物實驗,尤其是嚙齒類動物已經(jīng)在生理學(xué)和病理生理學(xué)方面做出了極大的貢獻(xiàn),并且能夠反映完整個體中的藥物代謝情況。但耗時長、價格昂貴,動物模型與人類在呼吸系統(tǒng)生長發(fā)育、結(jié)構(gòu)功能、細(xì)胞比例和疾病的特征等方面不盡相同[12-13],導(dǎo)致藥物研發(fā)多在臨床試驗階段失敗。此外,動物模型存在一系列的倫理問題[9-10,14-15]。綜上所述,動物模型已經(jīng)無法滿足更為精確的實驗需求?！靶酒巍蹦軌蚰M肺的主要功能、肺在體內(nèi)生長分化所需微環(huán)境以及肺和所處微環(huán)境之間的相互作用[16]。每一種具體的 “芯片肺”模型都能通過人為主觀地改變某種條件,使其更接近肺在體或疾病發(fā)展的相應(yīng)狀態(tài),并且能夠研究該變化在疾病發(fā)展和治療過程中的作用。因此,“芯片肺”或在肺部疾病的防治方面發(fā)揮重要作用。

3 “芯片肺”在呼吸疾病研究中的應(yīng)用

3.1 “芯片肺”在肺炎中的研究 肺炎是指由病原微生物、理化因素、免疫損傷、過敏及藥物所致的終末氣道,肺泡和肺間質(zhì)的炎癥。細(xì)菌感染是引起肺炎的主要因素之一,研究表明,當(dāng)將大腸桿菌加入 “芯片肺”的氣體通道后,ICAM-1表達(dá)明顯增強,血管內(nèi)皮細(xì)胞對中性粒細(xì)胞的黏附作用增強。隨后,中性粒細(xì)胞激活、遷移、滲出,最終到達(dá)肺泡上皮表面,并吞噬大腸桿菌。此外,研究人員在 “芯片肺”模型氣體通道中加入TNF-α以及IL-8等炎癥因子,中性粒細(xì)胞出現(xiàn)了與在氣體通道中加入細(xì)菌相同的結(jié)果。該結(jié)果與臨床上肺炎時中性粒細(xì)胞的遷移一致,證明 “芯片肺”模型能夠重現(xiàn)人體內(nèi)病原微生物以及炎癥因子等引起的肺炎發(fā)生以及免疫應(yīng)答過程[3,17]。

大量研究表明吸入納米顆?？梢鸱窝譡18-20]。將直徑12 nm 的二氧化硅納米顆粒加入 “芯片肺”的氣體通道,納米顆粒通過激活肺上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子,同時活化血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICMA-1從而引起肺炎,這與臨床試驗相符。運用 “芯片肺”模型同時發(fā)現(xiàn),機(jī)械牽張在此過程中起著非常重要的作用?；钚匝?(reactive oxygen species,ROS)是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要信號分子,研究人員以ROS的產(chǎn)生量為指標(biāo),定量測定機(jī)械牽張對吸入納米顆粒引起肺炎的影響。結(jié)果顯示,僅用納米顆粒而無機(jī)械牽張作用時,“芯片肺”產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生ROS。而在有機(jī)械牽張時,相同條件下的納米顆粒則能引起ROS的穩(wěn)定增長。進(jìn)一步研究表明,ROS的產(chǎn)生量與機(jī)械牽張強度成正比,而且長期受到二氧化硅納米顆粒的作用時,即使沒有機(jī)械牽張的參與,仍然會產(chǎn)生大量的ROS[3,16-17]。在 “芯片肺”上的研究結(jié)果表明,機(jī)械牽張能顯著增強由納米材料導(dǎo)致的肺炎發(fā)生,這種效應(yīng)在小鼠模型上已經(jīng)得到驗證[3]。

3.2 “芯片肺”在肺水腫中的研究 肺水腫可能是由于多種疾病或限制劑量的藥物毒性引起的毛細(xì)血管靜水壓或微血管通透性增加所致[21]。研究人員向 “芯片肺”的血管通道中加入IL-2,觀察到大量培養(yǎng)液從液體通道中滲漏,直至氣體通道完全充滿積液。臨床上使用IL-2進(jìn)行治療惡性黑色素瘤或轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌時的確能夠引起肺水腫[22],說明 “芯片肺”能在體外模擬肺水腫的發(fā)生[2]。

研究人員利用 “芯片肺”模型進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn),呼吸運動產(chǎn)生機(jī)械牽張能夠放大IL-2 引起血管通透性增高的效應(yīng)。僅用IL-2處理內(nèi)皮細(xì)胞而無機(jī)械牽張作用時,肺毛細(xì)血管屏障功能受損不嚴(yán)重,當(dāng)有機(jī)械牽張作用時,等劑量的IL-2會引起肺毛細(xì)血管屏障功能嚴(yán)重受損[21,23]。在 “芯片肺”上進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn),機(jī)械牽張通過激活瞬時感受器電位離子通道4 (transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)增大了細(xì)胞間隙,導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加和肺血管滲漏,從而放大了IL-2 引起血管通透性增高的效應(yīng)[24]。

有數(shù)據(jù)表明TRPV4通道阻滯劑能夠抑制機(jī)械牽張引起的效應(yīng),研究人員在 “芯片肺”模型上利用TRPV4 通道阻滯劑 (GSK2198374) 驗證了這一推斷。使用GSK2198374完全抑制了IL-2與機(jī)械牽張引起肺水腫的效應(yīng),該實驗結(jié)果與心力衰竭致肺水腫動物模型實驗結(jié)果相吻合。除GSK2198374 外,血管緊張素1 (angiotensin 1,Ang-1)與IL-2聯(lián)合使用加入 “芯片肺”的血管通道時,也能有效的抑制內(nèi)皮細(xì)胞的滲漏。由此可見,“芯片肺”模型不僅可以模擬臨床上肺水腫的發(fā)生,而且可以用于篩選預(yù)防和治療肺水腫的藥物,這為臨床預(yù)防和治療肺水腫提供了可靠的依據(jù)[21,23]。

3.3 “芯片肺”在非小細(xì)胞肺癌中的研究 肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%,嚴(yán)重危害人類健康[25]。研究人員在 “芯片肺”技術(shù)的基礎(chǔ)上采用細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)建立了非小細(xì)胞肺癌模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),呼吸運動產(chǎn)生的機(jī)械牽張并沒有促進(jìn)癌細(xì)胞的生長,反而抑制了癌細(xì)胞的生長。該結(jié)果表明呼吸運動減弱可能會促進(jìn)肺癌的進(jìn)展。Hassell等[26]發(fā)現(xiàn)原機(jī)械牽張作用明顯降低表皮生長因子 (epidermal growth factor receptor,EGFR)的表達(dá),而大大增強了EGFR Y845、Y998 和Y1068幾個位點的磷酸化,導(dǎo)致相同的抗癌藥物在傳統(tǒng)細(xì)胞模型較 “芯片肺”模型敏感性更高。有數(shù)據(jù)表明,細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子 (cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-MET)蛋白的過表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生以及對癌癥晚期患者產(chǎn)生抗藥性有關(guān)。在藥物敏感性降低的非小細(xì)胞肺癌 “芯片肺”模型上c-MET 也出現(xiàn)了過表達(dá)現(xiàn)象,二者相吻合[27-29]。

3.4 “芯片肺”在氣道疾病中的研究 Benam 等[30]在“芯片肺”技術(shù)的基礎(chǔ)上利用小氣道上皮細(xì)胞建立正常小氣道模型,并成功的模擬小氣道的多項生理功能。使用IL-13處理該模型模擬哮喘的發(fā)作,觀察到哮喘發(fā)作的典型特征,如杯狀細(xì)胞增生,黏液分泌增多,粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)產(chǎn)生和分泌增強,氣道纖毛擺動頻率降低[31]。使用高劑量的托法替尼處理哮喘模型,觀察到上述現(xiàn)象消失或減輕,與藥物臨床應(yīng)用效果相符。此外,使用病毒復(fù)制時產(chǎn)生的雙鏈RNA 類似物聚胞苷酸[polycytidine acid,poly(I:C)]處理該模型成功模擬了病毒感染引起的哮喘急性發(fā)作[5]。

另外,Benam 等[32]利用COPD 患者小氣道上皮細(xì)胞建立COPD 模型,并觀察到COPD 患者的多項特征。他們使用細(xì)菌的細(xì)胞壁成分脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)和poly(I:C)處理正常小氣道模型和COPD 模型,發(fā)現(xiàn)僅使用poly(I:C)處理COPD 的模型時,才會出現(xiàn)巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (macrophage colony stimulatory factor,M-CSF)的大量分泌。所以,M-CSF 可以作為病毒引起的COPD 急性加重的特異性標(biāo)志物[5,32]。利用氣道上皮細(xì)胞建立的氣道模型檢驗電子香煙對肺組織產(chǎn)生的影響,結(jié)果表明,電子香煙氣溶膠能產(chǎn)生與香煙類似的影響[33]。

3.5 “芯片肺”在肺血栓栓塞中的研究 Jain 等[34]在“芯片肺”的基礎(chǔ)上利用原代肺泡上皮細(xì)胞建立肺泡模型,該模型用于研究肺血栓栓塞及其藥物的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS直接活化血管內(nèi)皮細(xì)胞不會引起血小板聚集以及血栓形成,而是通過活化肺泡上皮細(xì)胞間接引起血栓形成。parmodulin-2 (PM2)是一種潛在的蛋白酶激活受體-1 抑制劑,具有抗炎抗凝作用。使用PM2 提前處理該模型,30 min后再用LPS 處理,發(fā)現(xiàn)血小板聚集的現(xiàn)象明顯降低,說明該模型能有效地評估抗血栓藥物的效果。

4 小結(jié)與展望

“芯片肺”可部分代替動物實驗在體外進(jìn)行研究,能夠較準(zhǔn)確地模擬肺的在體狀態(tài),對于呼吸系統(tǒng)疾病的病變特征及機(jī)制研究有著重要作用;“芯片肺”可有效的評估新藥的作用效果,對于呼吸系統(tǒng)疾病和藥物的研究具有重要意義。此外,“芯片肺”呼吸運動的動力變化可以通過主觀控制,能夠觀測和研究各種疾病發(fā)展過程中呼吸運動帶來的影響,這在靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)模型和動物模型上是無法進(jìn)行的。然而 “芯片肺”的發(fā)展還處于起步階段,存在許多不足。例如,真實的氣血屏障由液體層、肺泡上皮細(xì)胞層、上皮基膜層、基質(zhì)層、毛細(xì)血管基膜層和內(nèi)皮細(xì)胞層構(gòu)成,比“芯片肺”復(fù)雜。在模擬肺水腫的 “芯片肺”模型中使用的肺上皮細(xì)胞,是從肺癌患者中分離出來的,因此 “芯片肺”不可能完全模擬人體肺泡上皮屏障功能[17,21]。此外,PDMS的機(jī)械強度較差,在體外模型的尺寸上限制了 “芯片肺”的開發(fā)與應(yīng)用;而且PDMS薄膜還會影響到疏水物質(zhì)的吸收,所以在物質(zhì)吸收方面也不能完全與肺相同[35-38]。肺在體內(nèi)并非單一獨立的器官,而是與其他系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)的,因此 “芯片肺”雖然能夠在一定程度上模擬肺的生理功能,但是僅限于肺泡水平,而不能模擬肺臟的整體功能以及肺臟與個體的相互作用與聯(lián)系,因此未來的研究重點將會轉(zhuǎn)向人工智能控制的多個器官聯(lián)系的 “多器官芯片”模型甚至 “人體芯片”模型[39-41],從而使我們的研究更加精確的模擬完整個體。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突