蔣笑麗，章建紅*，李玉祥，王正加

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040； 2.寧波市佳禾生態(tài)科技有限公司，浙江 寧波 315801； 3.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 311300)

薔薇科Rosaceae石楠屬Photinia在薔薇科中是個大家族，全世界有60多種，我國約有40種，其中大多數(shù)花、葉、果俱美，有較高的觀賞價值[1]。由于其樹形端正，可自然成形，適于公園、花園及路旁交叉點(diǎn)綴，三角地栽植，有時也被用作綠籬、綠屏，因其對二氧化碳、氯氣有較強(qiáng)抗性，且有隔音功能，又可用于街道、廠礦綠化。目前，我國擁有世界上最大的石楠屬植物栽培面積，由于國內(nèi)綠化苗木產(chǎn)業(yè)長期存在“重引輕育”的現(xiàn)象，其育種和品種改良工作發(fā)展十分緩慢，現(xiàn)有栽培品種均為國外育種專家選育，國內(nèi)對石楠屬植物的選育和遺傳改良的工作幾乎為零[2-9]。

目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水稻(Oryzasativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、小麥(Triticumaestivum)等作物的品種鑒定、遺傳親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建[10]。然而，該技術(shù)應(yīng)用于石楠屬植物遺傳育種研究卻鮮有報(bào)道。ISSR與RAPD相比，其可靠性更高，重復(fù)性好，每個引物能產(chǎn)生更高的多態(tài)性；同時，ISSR的操作也簡單。與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、穩(wěn)定、成本較低、DNA用量小，安全性較高[11]。本研究將利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對18個石楠屬植物樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，探討其遺傳親緣關(guān)系，從而為創(chuàng)新種質(zhì)資源及選育新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所需試材于2017年5月15日采自浙江寧波與臨安兩地，相關(guān)信息見表1。每個樣品采集5個單株的植株嫩葉2片，使每個混合樣品達(dá)5 g以上，用生物冰袋保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試材料的相關(guān)信息

注：采集地浙江臨安的為采自浙江農(nóng)林大學(xué)校園的植物園內(nèi)，采集地浙江寧波的為采自寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院位于鄞州區(qū)東錢湖鎮(zhèn)高錢村的實(shí)驗(yàn)園區(qū)內(nèi)。紅葉石楠金鳳凰、石楠幻彩為寧波佳禾生態(tài)科技有限公司自主選育的植物新品種權(quán)授權(quán)品種，紅葉石楠黃斑、紅葉石楠銀邊、紅葉石楠彩邊均為寧波佳禾生態(tài)科技有限公司自主選育的優(yōu)良株系，尚未申報(bào)新品種權(quán)，為暫定名。

1.2 DNA提取

參考相關(guān)文獻(xiàn)中的CTAB法[12]提取的嫩葉中基因組DNA，純化后分別通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳、分光光度計(jì)對其濃度及D值的檢測，電泳條帶單一、清晰明亮，且點(diǎn)樣孔內(nèi)沒有殘余，則提取的DNA質(zhì)量較好。

1.3 ISSR引物的篩選及ISSR反應(yīng)體系的建立

首先選取浙江本地分布的落葉種垂絲石楠與國外引進(jìn)的常綠種紅葉石楠紅羅賓2個形態(tài)與地理關(guān)系差異明顯的DNA，對50個引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出能夠在2份DNA中同時擴(kuò)增出條帶的引物，然后使用所有試材DNA對上述篩選出的引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后可得到多態(tài)性引物。

PCR體系的總體積為20 μL，其中含DNA模板1 μL(100 ng)，引物0.5 μmol·L-1，Taq0.067 U·μL-1，dNTP 0.2 mmol·L-1, Mg2+2.5 mmol·L-1，10×緩沖液2 μL(所有試劑均購自上海生物工程公司)，ddH2O 12.4 μL。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min；于4 ℃保溫，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)，于120 V恒定電壓下電泳30 min之后，在紫外成像系統(tǒng)中觀察照相并保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過對各個引物的ISSR擴(kuò)增圖譜進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，觀察每個引物對18個材料的擴(kuò)增條帶，記錄該引物在18個材料中不同遷移位置的條帶總數(shù)即為擴(kuò)增總條帶數(shù)；擴(kuò)增條帶最少的材料，其條帶數(shù)即為共有條帶數(shù)。多態(tài)性比率=(總條帶數(shù)-共有條帶數(shù))/總條帶數(shù)×100%。在凝膠的同一個位置，出現(xiàn)條帶的記為“l(fā)”，無條帶的記為“0”，建立原始數(shù)據(jù)表。利用NTSYS計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)成組配對算數(shù)平均法(UPGMA)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的檢測

圖1為18個石楠屬植物樣品提取的DNA電泳圖，在電泳圖中條帶清晰，亮度高，無明顯拖尾和彌散現(xiàn)象，DNA完整性較好，無降現(xiàn)象，提取的純度較好。如果點(diǎn)樣孔中近有少許亮帶存在，說明提取的基因組DNA中仍有大分子物質(zhì)存在沒有被去除。

2.2 多態(tài)性

對50個ISSR引物進(jìn)行初篩，最終篩選出9條引物用于所有樣品擴(kuò)增，共獲得54條譜帶，其中50條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為92.59%。其中圖2為57號引物對18個石楠屬植物樣品DNA擴(kuò)增的譜帶情況。9條引物平均每對引物擴(kuò)增出譜帶6條，平均5.6條具有多態(tài)性(表2)。

圖1 18個石楠屬植物樣品的DNA電泳結(jié)果

圖2 57號引物ISSR擴(kuò)增的譜帶

表2 ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 聚類

基于9個引物的擴(kuò)增結(jié)果數(shù)據(jù)，通過聚類分析得到各樣品間相似系數(shù)為0.28～0.90，從表3可知，小葉石楠與傘花石楠相似度達(dá)0.9，親緣關(guān)系最近；其次是紅葉石楠銀邊與小葉紅葉石楠相似度0.88；親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是紅葉石楠銀邊和短葉石楠，相似度僅0.28。從圖3中可以看出，在相似系數(shù)0.60左右的位置可以將18個石楠屬植物樣品分為5大類：Ⅰ類為欏木石楠、垂絲石楠、小葉石楠、傘花石楠、絨毛石楠、玉蘭葉石楠；Ⅱ類為中華石楠、光葉石楠、羅城石楠；Ⅲ類為石楠、紅葉石楠紅羅賓、紅葉石楠黃斑、紅葉石楠銀邊、紅葉石楠彩邊、小葉紅葉石楠；Ⅳ類為短葉石楠；Ⅴ類為石楠幻彩、紅葉石楠金鳳凰。從聚類分析樹狀圖中可以看出，這5類遺傳距離較遠(yuǎn)，說明它們的親緣性也較遠(yuǎn)。

表3 18個石楠屬植物樣品的相似系數(shù)

圖3 基于ISSR分子標(biāo)記的18個石楠屬植物試材的聚類樹

3 小結(jié)與討論

遺傳多樣性是生物種質(zhì)資源多樣性的主要評價內(nèi)容，可為其遺傳育種提供依據(jù)。本研究使用9個ISSR引物對18個石楠屬植物進(jìn)行了遺傳多樣性分析，從聚類分析圖看出，在遺傳相似系數(shù)為0.6時，18個石楠屬植物被分為5類；并且9個引物擴(kuò)增共獲得54條帶，其中有50條具有多態(tài)性，說明石楠屬植物的遺傳多樣性較高。另外，聚類分析結(jié)果表明，不同石楠屬植物間的遺傳差異較大，ISSR相似系數(shù)為0.28～0.90，小葉石楠與傘花石楠遺傳距離最近，兩個標(biāo)記的相似度均最高，因?yàn)樾∪~石楠與傘花石楠形態(tài)上最為接近，兩者均為傘形花序，花量極少，而其他石楠屬植物為傘房或復(fù)傘房花序，且花量多，因而與其有明顯區(qū)別。從遺傳距離的遠(yuǎn)近與地理種源的相關(guān)性來看，國外引進(jìn)的紅葉石楠系列品種能較好地聚在一起，短葉石楠產(chǎn)于貴州，而其他石楠屬植物在浙江均有分布，因而短葉石楠與其他國內(nèi)種的石楠屬植物遺傳距離也較遠(yuǎn)，說明了石楠屬植物的遺傳親緣關(guān)系與地理種源分布存在緊密聯(lián)系。

紅葉石楠是石楠雜交種的統(tǒng)稱，紅葉石楠是石楠雜交種，因而其系列品種與石楠聚合成一組；欏木石楠是常綠小喬木，與垂絲石楠、小葉石楠、傘花石楠、絨毛石楠、玉蘭葉石楠等落葉灌木聚在一起；而中華石楠為落葉灌木，又和光葉石楠、羅城石楠等常綠灌木聚在一起，說明石楠屬植物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與常綠和落葉、喬木還是灌木并沒有完全

的相關(guān)性。

總之，本研究結(jié)果表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在石楠屬植物的基因型差異上表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，能夠更好地分析石楠屬植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。另外，聚類分析的結(jié)果從分子水平上印證了這些石楠屬植物之間的遺傳親緣關(guān)系，能夠?yàn)楹罄m(xù)石楠屬植物雜交育種中親本選配提供一定的參考依據(jù)。