梁 易， 李良建， 馬凌暉， 劉楚琪， 李 暢， 王萬軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶(Somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK)廣泛存在于植物中。1997年Schmidt等首先從胡蘿卜(Daucuscarota)下胚軸發(fā)現(xiàn)第一個(gè)SERK基因，即DcSERK[1]。隨后，研究人員在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[2]、玉米(Zeamays)[3]、水稻(Oryzasativa)[4-5]、苜蓿(Medicagotruncatula)[6]、小麥(Triticumaestivum)[7]、大麥(Hordeumvulgare)[8]、鴨茅 (Dactylisglomerata)[9]、可可(Theobromacacao)[10]、文心蘭(Cyrtochilumloxense)[11]和卡特蘭(Cattleyamaxima)[12]等植物中分別發(fā)現(xiàn)了SERK基因。除了少數(shù)SERK基因的表達(dá)在體細(xì)胞胚內(nèi)檢測不到外，其他已經(jīng)報(bào)道功能的SERK基因一般都參與了體細(xì)胞胚的發(fā)生[13]。

SERK蛋白屬于富亮氨酸重復(fù)序列類受體蛋白激酶(Leucine-rich repeat receptor-like kinases, LRR-RLKs)的第二亞類，具有典型的胞外受體結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶活性結(jié)構(gòu)域；SPP基序(Ser-Pro-Pro，富脯氨酸結(jié)構(gòu)域)是SERKs區(qū)別于其他LRR-RLKs蛋白的特征，也是鑒定SERK蛋白的依據(jù)[14]。SPP基序位于胞外受體結(jié)合域與跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可能起鉸鏈作用使胞外信號(hào)接收更加靈活。SERK蛋白高度同源，特別是胞內(nèi)激酶區(qū)；但胞外區(qū)的同源性稍低，不同的SERK蛋白可能接收不同的刺激信號(hào)，因而胞外受體結(jié)合域的序列變化更多。此外，SERK基因結(jié)構(gòu)也很保守，一般含有11個(gè)外顯子與10個(gè)內(nèi)含子；外顯子與編碼蛋白功能域相對(duì)應(yīng)。以擬南芥AtSERK1為例，信號(hào)肽(Signal peptide, SP)由外顯子1編碼，跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane region, TM)由外顯子8編碼，外顯子9～11編碼胞內(nèi)激酶活性結(jié)構(gòu)域[2]。

Schmidt等發(fā)現(xiàn)DcSERK只在胡蘿卜胚性細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且只表達(dá)到體細(xì)胞胚的球形期[1]，蜜柑CiSERK也只在胚性細(xì)胞內(nèi)檢測到[15]，擬南芥外植體中過量表達(dá)AtSERK1時(shí)能提高成胚率3～4倍[2]，水稻表達(dá)OsSERK1也會(huì)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生能力增強(qiáng)[5]，金花茶(Camellianitidissima)體胚發(fā)生5個(gè)不同階段都有SERK表達(dá)[16]；這些事實(shí)都表明SERK基因在體細(xì)胞胚發(fā)生過程起重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SERK基因的表達(dá)并不局限于體細(xì)胞胚發(fā)生過程，它在植物其它生理過程中也起作用。例如擬南芥SERKs蛋白與ERECTA、TMM組成受體復(fù)合體共同激活下游MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控氣孔發(fā)育[17]；擬南芥serk1、bak1、bkk1三突變體只能長出非常短的根且分生組織非常少[18]，促進(jìn)植物生長的肽類激素Phytosulfokine (PSK)能在根中介導(dǎo)SERK蛋白與PSKR1的異源二聚化并啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19-20]。SERKs作為共受體還參與包括油菜素內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)、花藥絨氈層細(xì)胞分化和維管束發(fā)育及花器官脫落在內(nèi)的諸多生長發(fā)育過程；還參與細(xì)胞死亡調(diào)控、植物對(duì)病原菌的先天免疫反應(yīng)等過程[21]。

鐵皮石斛種子萌發(fā)需形成原球莖結(jié)構(gòu)，過程可分為8個(gè)時(shí)期，分別為種胚活化期、原球莖形成期、原分生組織形成期、頂端分生組織形成期、葉維管系統(tǒng)形成期、根形成期、原球莖退化期、苗形成期，記為P1～P8。本研究通過對(duì)鐵皮石斛SERK基因的篩選鑒定，并利用熒光定量PCR方法研究基因在原球莖發(fā)育各時(shí)期和不同組織的表達(dá)情況，同時(shí)對(duì)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入研究SERK基因的功能奠定了理論基礎(chǔ)，也為研究鐵皮石斛原球莖發(fā)育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛種子；RNA提取試劑盒購自成都biofite公司；PCR反應(yīng)體系購自上海生工，引物由上海生工合成；熒光定量試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄體系購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 原球莖發(fā)育各時(shí)期與各組織器官材料的獲取

鐵皮石斛種子接種于1/2 MS半固體培養(yǎng)基上，分別取種胚活化期 (P1,～5 d)、原球莖形成期(P2,～15 d)、原分生組織形成期 (P,～28 d)、頂端分生組織形成期 (P4,～37 d)、橢球形原球莖期 (P5,～45 d)、葉原基維管系統(tǒng)形成期 (P6,～60 d)、根端分生組織形成期 (P7,～80 d)、原球莖基部退化期 (P8,～100 d)與幼苗(P9,～120 d)材料。愈傷組織由莖段誘導(dǎo)，根、莖、葉、花等植物組織采集于成熟的鐵皮石斛植株。原材料樣品用液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鐵皮石斛總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

取上述凍存原材料，用植物RNA提取試劑盒(biofite公司)提取總RNA，DNaseⅠ膜上消化去除基因組污染。電泳檢測到28 S與18 S兩條帶，測得OD260/280在1.8～2.1之間，總RNA -80℃保存?zhèn)溆?。以上述總RNA為材料，使用逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-，TaKaRa)體系和引物Oligo(dT)18逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩拿糠輈DNA取少量得混合cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 鐵皮石斛SERK基因的篩選與鑒定

SERK基因的篩選主要通過同源比對(duì)方法，用到的數(shù)據(jù)庫和工具包括鐵皮石斛CDS與基因組數(shù)據(jù)庫、NCBI、Blast、FGENESH+。首先從NCBI上下載其他物種已鑒定的SERK基因CDS序列，比對(duì)鐵皮石斛CDS與基因組數(shù)據(jù)庫得到目的片段；然后通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)等多重特征確定目的片段是否為SERK基因。

采用3′RACE實(shí)驗(yàn)方法鑒定從數(shù)據(jù)庫中篩選到的SERK基因。設(shè)計(jì)基因特異引物GSP為上游引物，下游使用通用引物3RNP。以混合cDNA為模板，PCR反應(yīng)后回收目的片段，連接載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(菌種購自上海生工)，藍(lán)白斑篩選挑取白斑單克隆，搖菌培養(yǎng)過夜后菌液PCR檢測合格后測序，測序結(jié)果與原序列一致，則鑒定成功。

1.2.4 qRT-PCR

根據(jù)基因的CDS序列設(shè)計(jì)qRT-PCR上游引物DoSERK2-U與下游引物DoSERK2-D，見表1。引物驗(yàn)證合格后，使用SYBR Green I(購自TaKaRa)體系檢測相對(duì)表達(dá)量。

表1 研究中所用到的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛SERK基因篩選與克隆鑒定

利用同源比對(duì)方法從鐵皮石斛CDS和基因組數(shù)據(jù)中獲得5個(gè)片段，分別位于scaffold2481、4966、1126、7408、12 804上，通過FGENESH+在線工具預(yù)測得5個(gè)基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列以及這5個(gè)基因的基因結(jié)構(gòu)，將這5個(gè)基因記為gene1、gene2、gene3、gene4和gene5?；蚪Y(jié)構(gòu)圖顯示gene1、gene2、gene3和gene4含有11個(gè)外顯子，而gene5則只有8個(gè)外顯子且基因結(jié)構(gòu)不全。

表2 基因結(jié)構(gòu)

這5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)分別由614aa、647aa、633aa、628aa與454aa組成。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白都具有激酶結(jié)構(gòu)域，其中蛋白質(zhì)1、2可歸為一類，蛋白質(zhì)3、4歸為一類；gene3、gene4編碼的蛋白與SERK蛋白的長度和功能域符合，且含有特征序列SPP基序(圖1，紅框)。最終，確定gene3和gene4為鐵皮石斛SERK基因，分別命名為DoSERK1和DoSERK2。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)DoSERK1已被王曉娟等研究報(bào)道過[22]。因此，接下來的研究以DoSERK2為對(duì)象，Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)其在NCBI上被注釋為BAK-like基因(XM_020843144)。

設(shè)計(jì)3′RACE引物GSP，PCR產(chǎn)物電泳檢測得到長度為750 bp左右的片段(圖2)，回收、克隆與測序后得到一條長790 bp的核酸序列，比對(duì)后該片段與DoSERK2的CDS 3′端一致，含CDS區(qū)612 bp，其余178 bp為3′-UTR區(qū)。

2.2 DoSERK2的表達(dá)分析

提取鐵皮石斛種胚發(fā)育各時(shí)期和不同組織器官的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析DoSERK2在各個(gè)時(shí)期和不同組織的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示DoSERK2在原球莖發(fā)育各時(shí)期和不同組織器官中廣泛表達(dá)。原球莖發(fā)育過程中在P1時(shí)期(種胚活化期)表達(dá)量最高，P2～P9時(shí)期表達(dá)量低且差別不大(圖3)；在花中表達(dá)量最高，根、莖、葉和愈傷組織中表達(dá)量低且差別不大。

圖1 gene1、gene2、gene3、gene4和gene5編碼蛋白與DoSERK序列比對(duì)

圖2 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.3 DoSERK2生物信息學(xué)分析

2.3.1DoSERK2基因結(jié)構(gòu)

DoSERK2基因全長15 724 bp，CDS長1877 bp，5′-UTR區(qū)長1285 bp，3′-UTR長1204 bp，其基因結(jié)構(gòu)與AtSERK1基因相似，含11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子(表2，gene4)。各外顯子與功能域基本對(duì)應(yīng)(圖4)，外顯子1編碼信號(hào)肽(signal peptide, SP)；外顯子2編碼鋅指結(jié)構(gòu)和LRR1；外顯子4編碼LRR2與LRR3；外顯子5和6分別編碼LRR4和LRR5；外顯子7編碼SPP基序，該基序是SERK蛋白的特征序列；外顯子8編碼跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane region, TM)；外顯子9～11編碼胞內(nèi)激酶活性結(jié)構(gòu)域。

P1：種胚活化期；P2：原球莖形成期；P3：原分生組織形成期；P4：頂端分生組織形成期；P5：橢球形原球莖期；P6：葉原基維管系統(tǒng)形成期；P7：根端分生組織形成期；P8：原球莖基部退化期；P9：幼苗

圖3原球莖發(fā)育各時(shí)期和不同組織器官中DoSERK2相對(duì)表達(dá)量

Figure 3 Expression ofDoSERK2 in the development of protocorm, and in different tissues and organs

SP信號(hào)肽；ZIP鋅指結(jié)構(gòu)；LRR富亮氨酸重復(fù)序列；SPP富脯氨酸基序；TM跨膜區(qū)；Kinase激酶區(qū)

圖4DoSERK2各外顯子對(duì)應(yīng)的功能域

Figure 4 The functional domain corresponding to the exons ofDoSERK2

2.3.2DoSERK2調(diào)控元件分析

PlantCARE分析DoSERK2基因TSS上游1500 bp核苷酸序列，得調(diào)控元件分析表(表3)。TATA-Box位于TSS上游-35～30 bp，除含有TATA-box與CAAT-box基本元件外，還有4個(gè)元件涉及光響應(yīng)，2個(gè)元件與茉莉酸甲酯(MeJA)應(yīng)答有關(guān)，4個(gè)元件可能為MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

2.3.3 DoSERK2蛋白分析

DoSERK2基因CDS長1877 bp，編碼628個(gè)氨基酸。DoSERK2蛋白分子量為69.4 ku，等電點(diǎn)pI為5.64，是一個(gè)親水性蛋白；SignalP預(yù)測其1～28位氨基酸為信號(hào)肽，28～29位為切割位點(diǎn)；WoLFPSORT與TMHMM預(yù)測其為質(zhì)膜蛋白，1～241位氨基酸位于細(xì)胞質(zhì)膜外，242～264位氨基酸為跨膜螺旋區(qū)，265～628位氨基酸位于胞內(nèi)。

表3 DoSERK2 調(diào)控元件分析

圖5 PreditProtein預(yù)測DoSERK2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

Figure 5 Predict Protein predicts the secondary structure of DoSERK2

1)二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用PreditProtein與SOPMA網(wǎng)站預(yù)測DoSERK2的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)，DoSERK2蛋白具有 21個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè) DNA 結(jié)合位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)由40.61%α-螺旋、16.56%延伸鏈、7.48% β-轉(zhuǎn)角和35.35%無規(guī)卷曲組成，第242～263個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)域，無序區(qū)域較短。

圖6 NCBI Conserved domains在線分析

2)三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能域。SWISS-MODEL預(yù)測DoSERK2胞內(nèi)激酶區(qū)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，有一個(gè)明顯的凹陷區(qū)(圖7，白色箭頭)；NCBI Conserved domains在線分析結(jié)果(圖6)顯示了DoSERK2的功能域(圖7)，ATP結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、多肽底物結(jié)合位點(diǎn)與活性環(huán)都位于胞內(nèi)激酶區(qū)，將這些氨基酸在三維結(jié)構(gòu)中標(biāo)示出來，發(fā)現(xiàn)它們都位于凹陷區(qū)附近(圖7-B，彩色)。

A：molecular surface; B：ribbon；sticks and balls顯示位于ATP結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、多肽底物結(jié)合位點(diǎn)與活性環(huán)的氨基酸

圖7 SWISS-MODEL預(yù)測DoSERK2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

Figure 7 SWISS-MODEL predicts the tertiary structure of DoSERK2

圖中功能域分別為：信號(hào)肽(紅色)；LRR(亮氨酸重復(fù)序列，藍(lán)色)；SPP(富脯氨酸基序，橙色)；TM(跨膜區(qū)，灰色)；激酶(黃色)圖8 序列比對(duì)Figure 8 Sequence alignment

2.3.4 DoSERK2蛋白序列比對(duì)與分析

將DoSERK2與DoSERK1(AKN89445.1)，玉米ZmSERK1(CAC37638.1)、ZmSERK2(CAC37639.1)、ZmSERK3(NP_001306698.1)，擬南芥AtSERK1(ACN59271.1)、AtSERK2(CAF33246.1)、AtSERK3(AAK68074.1)、AtSERK4(NP_178999.2)和AtSERK5(NP_179000.3)共10條蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些序列同源性達(dá)83.72%，都具有SERK蛋白特征功能域(圖8)。采用MEGA5.0 UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖9)，發(fā)現(xiàn)DoSERK2蛋白與DoSERK1同源性最高，玉米3個(gè)SERK蛋白最接近，擬南芥AtSERK1與AtSERK2最接近；而AtSERK3、AtSERK4和AtSERK5與其他SERK蛋白同源性較低，特別是富脯氨酸區(qū)域和C-端與其他7個(gè)蛋白差別較大。這說明SERK蛋白在同一植物中既有相似性又有差異性。

The ID of corresponding mRNA in NCBI: DoSERK1 (AKN89445.1), DoSERK2 (XM_020843144)， ZmSERK1(CAC37638.1), ZmSERK2 (CAC37639.1), ZmSERK3 (NP_001306698.1)， AtSERK1 (ACN59271.1), AtSERK2 (CAF33246.1), AtSERK3 (AAK68074.1), AtSERK4 (NP_178999.2), AtSERK5 (NP_179000.3)

圖9系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 9 Phylogenetic tree

3 討論

SERK基因在植物中廣泛存在且在同一植物基因組中往往具有多個(gè)成員，如擬南芥有5個(gè)SERK基因，分別為AtSERK1、AtSERK2、AtSERK3、AtSERK4和AtSERK5[2]；玉米有3個(gè)，分別為ZmSERK1、ZmSERK2和ZmSERK3[3]；大麥有3個(gè)，為HvSERK1、HvSERK2與HvSERK3[8]。通過對(duì)鐵皮石斛基因組進(jìn)行同源搜索后共發(fā)現(xiàn)5個(gè)目的片段，翻譯成蛋白后鑒定含SPP基序的基因有2個(gè)且最終被確定為SERK基因，分別命名為DoSERK1與DoSERK2。DoSERK1即為DoSERK，已被王曉娟等研究報(bào)道過，編碼633個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與文心蘭(Cyrtochilumloxense)和卡特蘭(Cattleyamaxima)SERK親緣關(guān)系最近[22]。DoSERK2是篩選鑒定的另一個(gè)鐵皮石斛SERK基因，編碼628個(gè)氨基酸，序列與小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)BAK1-like蛋白(XP_020586612.1)、深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)SERK蛋白(PKA59550.1)同源性最高，分別為96%和93%。DoSERK1信號(hào)肽比DoSERK2多5個(gè)氨基酸，DoSERK2的信號(hào)肽切割位點(diǎn)在28～29位而DoSERK1則在33～34位[22]。DoSERK1與DoSERK2都是親水性蛋白，它們的分子量、等電點(diǎn)等理化特征與其他SERKs蛋白一致；功能域分析顯示DoSERK1和DoSERK2都具有SERK蛋白特征功能域。

DoSERK1在鐵皮石斛不同組織器官中均有表達(dá)，在幼嫩小苗根部表達(dá)量最高[22]；說明它可能參與多種生長發(fā)育過程，但在根的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。DoSERK2也在鐵皮石斛中廣泛表達(dá)，組織表達(dá)分析顯示它在花中表達(dá)量最高，而原球莖發(fā)育各時(shí)期表達(dá)分析顯示它在P1種胚活化期表達(dá)量最高。花是植物的生殖器官，其生物學(xué)功能是產(chǎn)生雌、雄配子體使之結(jié)合形成合子并最終發(fā)育成種子。這一進(jìn)程包括雌蕊與雄蕊的發(fā)育、授粉作用、受精作用和合子的發(fā)育，可推測DoSERK2在鐵皮石斛生殖過程中發(fā)揮重要作用，但具體在哪個(gè)步驟起作用尚不清楚。鐵皮石斛胚胎發(fā)育為紫菀型，基細(xì)胞與頂細(xì)胞都參與胚的發(fā)育，種子成熟時(shí)胚胎發(fā)育停止在早期，這時(shí)種胚尚未分化，需經(jīng)過原球莖這一中間結(jié)構(gòu)才能形成植株。因此，原球莖發(fā)育是胚胎發(fā)育與種子萌發(fā)過程的整合，原球莖發(fā)育早期可視為胚胎發(fā)育，后期可視為種子萌發(fā)形成植株的過程。原球莖發(fā)育第一階段屬于鐵皮石斛早期胚胎發(fā)育，可推測DoSERK2在鐵皮石斛早期胚胎發(fā)育過程中起重要作用。

DoSERK1與DoSERK2作為受體跨膜激酶參與鐵皮石斛生長發(fā)育過程，其作用機(jī)制還有待研究。一般來說，SERKs與其它LRR-RLKs相互作為共受體通過磷酸化與去磷酸化接收并傳導(dǎo)信號(hào)，擬南芥AtSERK3與BRI1(Brassinosteroid-intensitive1)作為共受體識(shí)別蕓苔素(Brassinosteroid, BR)信號(hào)并采用可逆的磷酸化途徑引發(fā)下游基因表達(dá)，由此產(chǎn)生BR生理效應(yīng)[23-27]。PlantCARE分析顯示DoSERK2可能參與光響應(yīng)過程，茉莉酸甲酯與MYB轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控DoSERK2的表達(dá)。茉莉酸甲酯是一種與損傷相關(guān)的植物激素和信號(hào)分子，能夠激發(fā)植物防御基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御。植物MYB轉(zhuǎn)錄因子參與眾多生物學(xué)過程，主要包括初生和次生代謝反應(yīng)、細(xì)胞形態(tài)與模式建成、植物生長發(fā)育、對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答等。這表明DoSERK2基因可能具有多重功能，參與多種生物學(xué)過程。