郭寶元，張洋，王松雪

1. 國家糧食和物質(zhì)儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，中國科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085

啶氧菌酯，化學(xué)名為(E)-3-甲氧-2-[2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基]丙烯酸甲酯，英文名為picoxystrobin，CAS號(hào)為117428-22-5，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。熔點(diǎn)為75 ℃，水中溶解度為0.128 mg·L-1，LogKow(20 ℃)為4.48[1]。啶氧菌酯主要用于防治麥類的葉面病害如葉枯病、葉銹病、穎枯病、褐斑病和白粉病等，與其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑相比，其對(duì)小麥葉祜病、網(wǎng)斑病和云紋病有更好的效果[2-3]。啶氧菌酯最早由先正達(dá)公司于2001年在歐洲推出，隨后在全球得到廣泛應(yīng)用。但在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，啶氧菌酯對(duì)水生生物存在著比較大的毒性，同時(shí)，其代謝產(chǎn)物具有潛在的致癌性，因此給其應(yīng)用前景帶來一層陰影。

圖1 啶氧菌酯結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structure of picoxystrobin

農(nóng)藥施用的目的是達(dá)到病蟲害的防治作用，而農(nóng)藥施用后，只有少部分可到達(dá)靶標(biāo)，大部分則進(jìn)入土壤，同時(shí)即使達(dá)到靶標(biāo)的農(nóng)藥，也會(huì)通過雨水沖刷而進(jìn)入土壤，后通過地表徑流，進(jìn)入水體，從而危害到水生生物的安全[4]。因此，對(duì)于農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是考察其對(duì)水生動(dòng)植物的安全性。同時(shí)，考慮到啶氧菌酯logKow為4.48，具有強(qiáng)疏水性，可能在水生生物體內(nèi)存在累積作用，從而對(duì)水生生物造成更大危害，乃至通過食物鏈傳導(dǎo)到食物鏈的其他環(huán)節(jié)[5]。

國內(nèi)啶氧菌酯的登記工作剛剛開始，至2018年，在國內(nèi)已經(jīng)有8家企業(yè)成功登記該農(nóng)藥[1]。而對(duì)啶氧菌酯的研究，已經(jīng)涉及到其合成工藝優(yōu)化[6]、藥效評(píng)價(jià)[7]、殘留檢測(cè)方法[8-10]以及在水土界面的環(huán)境行為等方面，對(duì)于其環(huán)境安全評(píng)價(jià)的研究還比較少。因此，本文開展啶氧菌酯對(duì)生物斑馬魚的安全性和風(fēng)險(xiǎn)研究，并考察其在生物體內(nèi)的生物累積效應(yīng)，以評(píng)估啶氧菌酯施用后，對(duì)水生食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

TSQ Quantum Access MAX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；湘儀離心機(jī)1850購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Mettler Toledo pH計(jì)購自瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團(tuán)；上海雷磁JPB-607A型溶解氧分析儀購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

乙腈(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(北京)；乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。95%啶氧菌酯原藥由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所惠贈(zèng)，啶氧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(99.5%)購自Sigma-Aldrich。涉及流動(dòng)相、提取等過程的用水采用Millipore超純水設(shè)備制備。暴露用水為經(jīng)曝氣的自來水。

1.2 分析方法

流動(dòng)相為V(0.33%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=10∶90，流速0.2 mL·min-1；色譜柱型號(hào)Hypersil GOLD25002-102130 (100 mm×2.1 mm)，柱溫30 ℃，樣品室溫度20 ℃；進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣體積5 μL；保留時(shí)間為1.75 min；離子源類型為ESI-，離子源溫度350 ℃。

水樣前處理方式：5 mL樣品，用5 mL二氯甲烷漩渦振蕩3 min，重復(fù)提取一次，合并二氯甲烷。取5 mL二氯甲烷濃縮近干，用5 mL乙腈定容，超聲3 min，過0.22 μL有機(jī)濾膜，待測(cè)。

魚體樣品前處理方式：1 g魚體樣品研磨(濕重)，加20 mL乙腈，浸泡振蕩過夜，離心5 min，取上清液過膜，待測(cè)；如有濃度高的樣品，稀釋后進(jìn)樣。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

取95%啶氧菌酯原藥0.3065 g，以適量二甲基亞砜作為助溶劑，以吐溫80為穩(wěn)定劑，用去離子水溶解定容至100 mL，得3.00 g a.i.·L-1儲(chǔ)備液。用曝氣自來水稀釋得到濃度為0.0300、0.0390、0.0507、0.0658和0.0856 mg a.i.·L-1的5組試驗(yàn)處理藥液，以曝氣自來水為空白對(duì)照，以與最高濃度中二甲基亞砜和吐溫80含量相同的溶液為溶劑對(duì)照，對(duì)照組和各處理組均只設(shè)1個(gè)重復(fù)。每個(gè)燒杯中裝有2 L藥液，分別放入10尾斑馬魚。試驗(yàn)期間不曝氣、不喂食。分別于24、48、72和96 h觀察斑馬魚中毒癥狀和死亡情況。

分別在試驗(yàn)開始后0和24 h更換試驗(yàn)溶液之前從各處理組取100 mL的供試物溶液，于冰箱中保存，用于啶氧菌酯水體濃度檢測(cè)。

計(jì)算各濃度組在試驗(yàn)開始后24、48、72和96 h試驗(yàn)魚的累計(jì)死亡率。采用SPSS軟件的Probit法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)致死濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間。

1.4 斑馬魚生物富集

稱取1.4 g 95%啶氧菌酯原藥，用水定容于1 000 mL容量瓶中，得到濃度為1 330 mg·L-1的儲(chǔ)備液，過膜后濃度為204 mg·L-1。

經(jīng)斑馬魚急性毒性試驗(yàn)得到96 h-LC50為0.0509 mg·L-1。試驗(yàn)溶液配制濃度分別為96 h-LC50的1/100和1/10，即0.0005和0.005 mg·L-1。

根據(jù)設(shè)定濃度，配制2 L試驗(yàn)水，每種濃度各16缸，每缸放置5條斑馬魚，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。每24 h更換藥液。

于0、24、48、96、144和192 h分別從各處理中取水樣與魚樣，測(cè)定水樣與魚樣中的供試物含量。

檢測(cè)試驗(yàn)過程中魚體內(nèi)啶氧菌酯濃度，啶氧菌酯的生物富集系數(shù)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：BCF為生物富集系數(shù)(bioconcentration factor)；Cfs為魚體內(nèi)的啶氧菌酯含量(mg·kg-1)；Cws為水體中的啶氧菌酯含量(mg·L-1)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 LC-MS/MS分析方法

使用LC-MS/MS測(cè)定樣品，其線性范圍為0.001～1.5 mg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 37739475398x+509582745，R2= 0.9920；色譜圖中，在啶氧菌酯出峰的位置沒有干擾峰；在水中加入啶氧菌酯原藥儲(chǔ)備液，使其濃度為1.0和0.001 mg·L-12個(gè)濃度，平均添加回收率為88.99%～105.10%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.83%～5.5%，最低檢測(cè)濃度為0.001 mg·L-1；在魚體中加入啶氧菌酯原藥儲(chǔ)備液，使其濃度為0.004和5.2 mg·kg-12個(gè)濃度，平均添加回收率為72.07%～108.16%，RSD為2.53%～7.44%，最低檢測(cè)濃度為0.004 mg·kg-1；該方法能夠滿足水中/魚體啶氧菌酯的測(cè)定的要求。

2.2 啶氧菌酯對(duì)斑馬魚的急性毒性

試驗(yàn)期間pH值范圍為7.6～8.1，水溫范圍為23.0～25.0 ℃，溶解氧在65%～77%范圍內(nèi)，符合試驗(yàn)要求。啶氧菌酯的設(shè)定濃度為0.300、0.390、0.507、0.658和0.856 mg a.i.·L-1，0、24 h后對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)用水中啶氧菌酯濃度降低1.58%～6.75%，啶氧菌酯濃度均大于設(shè)定濃度的80%。試驗(yàn)期間空白對(duì)照試驗(yàn)用魚并未出現(xiàn)異常情況。各啶氧菌酯處理組斑馬魚均表現(xiàn)出興奮，尤其高濃度處理組的斑馬魚，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，魚開始游動(dòng)失衡，魚體側(cè)翻，游速緩慢，反應(yīng)遲鈍，嚴(yán)重的出現(xiàn)死亡。

表1 95%啶氧菌酯原藥對(duì)斑馬魚(Brachydonio rerio)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Acute toxicity test results of 95%picoxystrobin in Brachydonio rerio

依據(jù)表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算啶氧菌酯對(duì)斑馬魚的急性毒性，96 h-LC50為0.0509 mg a.i.·L-1，95%置信區(qū)間為0.0314～0.0641 mg a.i.·L-1。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中對(duì)魚類的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，95%啶氧菌酯對(duì)斑馬魚急性毒性指標(biāo)96 h-LC50<0.1 mg a.i.·L-1，屬“劇毒”級(jí)。

2.3 啶氧菌酯在斑馬魚體內(nèi)的生物累積效應(yīng)

啶氧菌酯對(duì)斑馬魚的毒性屬劇毒，而它同時(shí)還可能存在著生物累積效應(yīng)，因此，啶氧菌酯對(duì)斑馬魚等水生生物形成更大安全風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)LC50設(shè)置啶氧菌酯的生物富集試驗(yàn)濃度，采用1/10和1/100 LC50啶氧菌酯進(jìn)行生物富集的試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，啶氧菌酯在斑馬魚體內(nèi)存在明顯的生物富集效應(yīng)。從暴露開始，啶氧菌酯在斑馬魚體內(nèi)有一個(gè)快速累積的過程，在0.005 mg·L-1(1/100 LC50)水平下暴露24 h后，斑馬魚體內(nèi)的啶氧菌酯的濃度就達(dá)到0.037 mg·kg-1，BCF24 h達(dá)到61.67，隨后，斑馬魚體內(nèi)的啶氧菌酯增加速度變得緩慢。到第2天(48 h)時(shí)，斑馬魚體內(nèi)的啶氧菌酯濃度基本達(dá)到平衡，BCF達(dá)到73.33，到第8天(192 h)時(shí)，斑馬魚體內(nèi)的濃度達(dá)到0.048 mg·kg-1，BCF8 d緩慢增長(zhǎng)到80.00。

在更高濃度的暴露環(huán)境中，在1/10 LC50(0.005 mg·L-1)水中，24 h后，斑馬魚體內(nèi)啶氧菌酯濃度就達(dá)到平衡，約為0.553 mg·kg-1，BCF24h基本達(dá)到106.35。隨后斑馬魚體內(nèi)的啶氧菌酯濃度維持平衡，生物富集因子也小幅波動(dòng)，到192 h后，斑馬魚體內(nèi)的啶氧菌酯濃度為0.527 mg·kg-1，BCF8 d值為99.42。

農(nóng)藥等化學(xué)品的生物富集性，一般認(rèn)為是與其Kow相關(guān)。通常Kow越大，生物累積性越高，如蒽的logKow= 4.45，其在斑馬魚體內(nèi)的生物累積大約是2.48×104～6.14×104 [11-13]。啶氧菌酯的logKow=4.48，雖然與蒽接近，但其在斑馬魚體內(nèi)的富集效應(yīng)在80.00～99.43之間，相差達(dá)2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。此結(jié)果表明，一方面，啶氧菌酯可以在生物體內(nèi)富集；另外一方面，其在生物體內(nèi)存在代謝過程，使其在富集平衡時(shí)，生物富集因子遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于多環(huán)芳烴的富集因子。

3 討論(Discussion)

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，啶氧菌酯對(duì)斑馬魚有劇毒。啶氧菌酯在水體中水解緩慢，而在生物體內(nèi)也具有比較高的穩(wěn)定性，同時(shí)，其疏水性強(qiáng)，在生物體內(nèi)的降解速度比累積速度慢，容易在生物體內(nèi)累積。經(jīng)過8 d暴露，在低濃度下，生物富集因子可以達(dá)到80.00，而在比較高的環(huán)境濃度下，生物富集因子也可以達(dá)到99.42。根據(jù)GB/T 31270.7—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第7部分：生物富集試驗(yàn)》中農(nóng)藥生物富集性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在10

圖2 斑馬魚體內(nèi)啶氧菌酯富集系數(shù)(BCF)的變化規(guī)律Fig. 2 Variation of picoxystrobin bioconcentration factor (BCF) in Brachydanio rerio