王官勝 王曉彤 梁 丹 羅 旭

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

卵是鳥類生長發(fā)育的起點，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)等方面有較穩(wěn)定的特異性[1-2]，因此備受鳥類學(xué)家關(guān)注[3-7]。鳥卵殼是由 Ca、P、K 等元素構(gòu)成[2，5]，硬化的鈣質(zhì)硬殼為胚胎發(fā)育提供了一個安全舒適的場所[6，8]。卵殼橫截面由外向內(nèi)分為表面結(jié)晶層、柵欄層、錐體層和殼膜層[2，9]，各層之間相互連通[10]，胚胎通過氣孔與外界環(huán)境進行氣體交換、水分蒸發(fā)和調(diào)節(jié)胚內(nèi)溫度[11-12]。卵殼厚度越大，堅固性越好，抗壓能力越強[13-14]，越有利于水分保持，但較厚的卵殼卻不利于氣體交換；鳥類可通過增加氣孔數(shù)量，來減少厚卵殼對氣體交換所產(chǎn)生的負面影響[15-16]。卵殼結(jié)構(gòu)與特定的環(huán)境相關(guān)[12]，是長期進化過程中對環(huán)境壓力適應(yīng)的結(jié)果[17-18]。地面營巢的鳥類在卵殼外表面有一層透明蛋白質(zhì)的保護膜，以防止微生物和病菌侵襲[1，11]。在相同生境中營巢的鳥類，因巢址位置[18-19]、巢類型[20]、產(chǎn)卵數(shù)量[21]等存在差異，卵殼結(jié)構(gòu)也會不同。

高海拔地區(qū)一般具有氧氣稀薄、空氣濕度低等氣候特點[22]，鳥類的生存壓力較大[23]。已有研究發(fā)現(xiàn)，相較于低海拔地區(qū)繁殖鳥類，高海拔地區(qū)繁殖鳥類卵較大、窩卵數(shù)較小[24]。孫嘉辰等[12]對青藏高原高寒草甸繁殖鳥研究中發(fā)現(xiàn)預(yù)期氣孔率顯著高于氣孔率，Rahn等[25]在北美洛基山紅翅黑鸝(Agelaius phoeniceus)和喜馬拉雅山紅原雞(Gallus gallus)的卵殼研究中，發(fā)現(xiàn)低海拔個體的卵殼有效氣孔面積顯著高于高海拔個體。對家朱雀(Haemorhous mexicanus)的研究發(fā)現(xiàn)高濕度區(qū)域卵殼厚度和有效氣孔面積顯著高于低濕度區(qū)域，而且卵殼結(jié)構(gòu)受濕度的影響比溫度更為明顯[26]。

本研究卵殼樣品于2015年4、5月采自高黎貢山海拔3000 m以上的高山生境，因受印度洋暖濕季風(fēng)的影響，該地降雨充沛、空氣濕度非常大，年均降水量通常高于3000 mm[27]，與其他高海拔地區(qū)相較有顯著的高濕度的特征。本研究以該區(qū)域同域分布的高海拔雀形目鳥類為對象，通過掃描電鏡對鳥類卵殼顯微結(jié)構(gòu)特征進行觀察分析，探討物種間顯微結(jié)構(gòu)特征的差異，以及鳥卵顯微結(jié)構(gòu)特征和筑巢位置的關(guān)系。

1 材料與方法

研究共采集了10種鳥16枚鳥卵的卵殼材料，其中白眉林鴝（Tarsiger indicus）、淡背地鶇（Zoothera mollissima）、純色噪鹛（Trochalopteronsubunicolor）、火尾綠鹛（Myzornis pyrrhoura）、異色樹鶯（Horornis flavolivaceus）、火尾太陽鳥（Aethopyga ignicauda）各采集了2枚鳥卵；藍眉林鴝（Tarsiger rufilatus）、黑頂噪鹛（T. affine）、黃額鴉雀（Suthora fulvifrons）、紅嘴鴉雀（Conostoma aemodium）各采集了1枚鳥卵。所有鳥卵均采自幼鳥出巢之后或者天敵破壞后被親鳥遺棄的巢，收集巢中的鳥卵或卵殼，編號后放入自封袋中干燥保存。

卵殼實驗處理參照常崇艷等[2]、蔣愛伍等[28]的方法，用鑷子在相同部位取下幾小塊卵殼，用雙蒸水浸泡24 h，然后自然風(fēng)干。將樣品編號后粘在日立TM3030型掃描電鏡載物臺上，觀察卵殼的外表面、橫截面、柵欄層、殼膜后并拍照，得到卵殼表面光滑度、裂紋、乳突、殼膜纖維、芽突等描述性特征。測量性特征在軟件Motic Images Advanced 3.2中進行測量，包括卵殼厚度（μm）、各層厚度（μm）、卵殼表面氣孔孔徑（μm）、柵欄層蜂窩小孔孔徑（μm）、殼膜纖維直徑（μm），為獲取每個卵卵殼厚度、各層厚度及孔徑和直徑數(shù)據(jù)，本研究選擇5個不同視野進行觀察，每個視野分別拍一張照片取6組數(shù)據(jù)，每項特征樣本量n=30，卵殼厚度為表面結(jié)晶層、柵欄層和錐體層之和。統(tǒng)計表面氣孔密度（100 μm2內(nèi)的個數(shù)）、柵欄層蜂窩小孔密度（100 μm2內(nèi)的個數(shù)）、殼膜纖維的密度（100 μm2內(nèi)的條數(shù)）。而每個卵的密度數(shù)據(jù)，本研究選擇5個不同視野進行觀察，每個視野分別拍一張照片取4組數(shù)據(jù)，每項特征樣本量n=20。測量性特征數(shù)據(jù)統(tǒng)計值采用平均值±標準差表示。

不同營巢位置卵殼微觀結(jié)構(gòu)可能存在差異，本研究將10個物種分為地面營巢和樹上營巢兩組。對不同營巢位置的鳥卵顯微特征進行比較分析，用單樣本K-S檢驗對數(shù)據(jù)樣本進行正態(tài)性檢驗。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行獨立樣本的T檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用2個獨立樣本的K-S檢驗，上述統(tǒng)計分析在SPSS17.0中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 描述性特征比較

對10種雀形目鳥類卵殼的顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，顯微結(jié)構(gòu)大體特征相同，卵殼都是由表面結(jié)晶層、柵欄層、錐體層和殼膜層構(gòu)成。在觀察鳥卵殼表層時，純色噪鹛、黑頂噪鹛、淡背地鶇、黃額鴉雀、紅嘴鴉雀、藍眉林鴝卵殼上未觀察到表層有透明蛋白質(zhì)的保護膜，在火尾太陽鳥、火尾綠鹛、異色樹鶯、白眉林鴝的表層上觀察到透明蛋白質(zhì)的保護膜。純色噪鹛、黑頂噪鹛、淡背地鶇及白眉林鴝的卵殼表面平滑，而火尾太陽鳥、火尾綠鹛等其他6種鳥類卵殼表面不平滑。在每種鳥卵殼的表面都觀察到有裂紋，均呈不規(guī)則分布，不同物種之間存在裂紋數(shù)量、裂紋長短的差異。純色噪鹛、火尾綠鹛、異色樹鶯、紅嘴鴉雀的柵欄層結(jié)構(gòu)為平板狀結(jié)構(gòu)，其余6種為巖層片狀結(jié)構(gòu)。觀察到的乳錐形狀大致有3種，黑頂噪鹛和火尾綠鹛的卵殼乳錐為球狀，白眉林鴝、黃額鴉雀的卵殼乳錐形狀為塊狀，純色噪鹛、異色樹鶯、淡背地鶇、紅嘴鴉雀、藍眉林鴝、火尾太陽鳥的卵殼乳錐形狀均為花朵狀。孵化后卵殼中乳錐形狀均為不規(guī)則的晶體狀，如火尾太陽鳥和火尾綠鹛。在黑頂噪鹛、火尾太陽鳥、火尾綠鹛的殼膜纖維上未見球狀芽突，其余7種都具有芽突（見圖1、表1）。

圖1 卵殼顯微結(jié)構(gòu)示意Fig. 1 Eggshell ultrastructures of the study birds

表1 十種雀形目鳥類卵殼顯微結(jié)構(gòu)特征對比Table 1 The eggshell ultrastructure traits in 10 passerine species

2.2 可量性特征的比較

對10種鳥類表層孔徑和密度、蜂窩小孔孔徑和密度，殼膜纖維直徑和密度進行測量，結(jié)果顯示：表層氣孔孔徑在0.70～1.46 μm之間，表層氣孔密度在1.20～7.80 個/100 μm2之間；樹上營巢和地面營巢的鳥類表層氣孔孔徑（P＞0.05）和表層氣孔密度（P＞0.05）無顯著差異。蜂窩小孔的孔徑在0.54～1.01 μm之間，蜂窩小孔密度在12.80～18.86 個/100 μm2之間；樹上營巢和地面營巢的鳥類蜂窩小孔密度（P＞0.05）無顯著差異，而樹上營巢的鳥類蜂窩小孔孔徑顯著大于地面營巢的鳥類（P＜0.01）。殼膜纖維直徑在1.28～2.18 μm之間，殼膜纖維密度在 2.12～4.05 個/100 μm2之間；地面營巢的鳥類殼膜纖維直徑（P＜0.01）和殼膜纖維密度（P＜0.01）顯著高于樹上營巢的鳥類（表2）。

表2 十種雀形目鳥類卵殼特征Table 2 The eggshell traits of 10 passerine species

對10種雀形目鳥類卵殼厚度和各層厚度進行測量，結(jié)果顯示：黑頂噪鹛卵殼厚度最大，為（87.06±1.31）μm（n=30），藍眉林鴝卵殼厚度最小，為（33.65±0.51）μm（n=30）（圖2）；淡背地鶇表層厚度最大，為（18.68±0.84）μm（n=60），火尾太陽鳥的表層厚度最小，為（6.87±0.84）μm（n=60）；紅嘴鴉雀柵欄層厚度最大，為（38.44±1.41）μm（n=30），黃額鴉雀柵欄層厚度最小，為（11.10±1.41）μm（n=30）；淡背地鶇錐體層厚度最大，為（31.87±2.76）μm（n=60），黃額鴉雀錐體層厚度最小，為（7.40±0.88）μm（n=30）（圖 3）。

圖2 十種雀形目鳥類卵殼厚度對比Fig. 2 The eggshell thickness of 10 passerine birds

圖3 十種雀形目鳥類卵殼各層厚度對比Fig. 3 The eggshell thickness of each layer of 10 passerine bird

3 結(jié)論與討論

3.1 鳥卵顯微結(jié)構(gòu)的個體差異

對同種鳥類不同個體的顯微結(jié)構(gòu)進行觀察，純色噪鹛和淡背地鶇的表面光滑程度、表面裂紋、乳錐形狀、柵欄層結(jié)構(gòu)和芽突等各特征均呈現(xiàn)出一致性，但是火尾綠鹛和火尾太陽鳥的乳錐形狀和芽突在不同個體間表現(xiàn)出差異性，異色樹鶯的表面裂紋和柵欄層結(jié)構(gòu)在不同個體間存在差異，白眉林鴝表面光滑程度和乳錐形狀在不同個體間也存在差異。這種情況前人研究[2，9]也有發(fā)現(xiàn)，說明同種不同個體的卵殼顯微特征并非完全一致，某些卵殼顯微結(jié)構(gòu)可能會因個體不同或者孵化過程的不同而有特征上的變化，因而選用哪些卵殼顯微結(jié)構(gòu)可以對物種進行鑒定，或者說哪些卵殼顯微特征具有穩(wěn)定的物種特異性，還需要更多研究來歸納。如乳錐形狀這一特征，常崇艷等[2]研究發(fā)現(xiàn)孵化后乳錐形狀會由規(guī)則的晶體狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘枷萸也灰?guī)則的晶體狀，本研究中在火尾太陽鳥和火尾綠鹛也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，孵化中的卵殼乳錐形狀為塊狀和花朵狀，而雛鳥出殼后乳錐形狀變?yōu)椴灰?guī)則的晶體狀，這至少說明乳錐這一特征在孵化結(jié)束后改變很大，在今后的研究中應(yīng)盡可能采集孵化前期的鳥卵，或者，如果鳥卵采自孵化結(jié)束的巢，在進行顯微結(jié)構(gòu)觀察時可以忽略該項特征。

3.2 蜂窩小孔孔徑較大的解釋

蜂窩小孔的孔徑與鳥類生活的環(huán)境密切相關(guān)，Becking[17]發(fā)現(xiàn)鳥類卵殼內(nèi)蜂窩小孔的孔徑及密度隨緯度的升高而下降，并提出熱帶地區(qū)的鳥類蜂窩小孔比高緯度地區(qū)的鳥類孔徑大，數(shù)量多，孔徑一般在0.6～1.2 μm之間。本研究中10種鳥類蜂窩小孔孔徑多在0.6～1.0 μm之間，與Becking[17]提出的熱帶鳥類孔徑數(shù)值相當(dāng)，應(yīng)是高黎貢山高山雀形目鳥類應(yīng)對高濕度環(huán)境的一種適應(yīng)特征。

將本研究與采自同一區(qū)域的白尾梢虹雉（Lophophorus sclateri）和血雉（Ithaginis cruentus）的蜂窩小孔的孔徑進行比較[14]，發(fā)現(xiàn)雀形目鳥類的孔徑大于同區(qū)域的雉類。這2種雉類以及其他一些雉類的孔徑均在0.23～0.36 μm之間，如哈曼馬雞（Crossoptilon harmani）、白冠長尾雉（Syrmaticus reevesii）、白鷴（Lophura nycthemera）等[2，5，19]?？赡苡袃煞N原因：一是雞形目和雀形目在系統(tǒng)演化上的差異所致；二是與雞形目鳥類的孵化行為有關(guān)。雉類通常是雌性孵蛋，會有較長時間的離巢間隔，比如血雉，離巢時間可達6.6 h[29]。雀形目鳥類雙親孵化較多，比如火尾綠鹛，卵幾乎不會暴露[30]；或者單親孵化，雌鳥離巢時間也相對較短，比如火尾太陽鳥，平均離巢時間6.49 min[31]。雞形目鳥類具有較小的孔徑可能減緩因雌鳥長時間離巢導(dǎo)致的失溫和水分散失。

3.3 筑巢位置和鳥卵顯微結(jié)構(gòu)

關(guān)于筑巢位置和鳥卵結(jié)構(gòu)的關(guān)系，有研究指出地面營巢鳥的鳥卵易受微生物和病菌的侵襲，因此外表面有透明蛋白質(zhì)的保護膜，而樹上營巢的鳥類受微生物侵襲的機會稍少，外表面無透明蛋白質(zhì)的保護膜；在殼膜纖維特征上，樹上筑巢的鳥類比地面筑巢的鳥類纖維更致密[1，20]。本研究檢驗了筑巢位置的不同可能對鳥卵顯微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果和前述研究存在差異：比如地面筑巢的淡背地鶇、藍眉林鴝[32]，卵殼外表面上未見到保護膜，反而是在樹上筑巢的火尾太陽鳥[31]，外表面上有保護膜；對于殼膜纖維密度，本研究中是地面營巢鳥類顯著高于樹上營巢鳥類，顯得更為致密(表2)。筑巢位置和鳥卵顯微結(jié)構(gòu)的關(guān)系，還需作更多的研究。

致謝：感謝西南林業(yè)大學(xué)邵施苗、吳新然和高歌在卵殼的采集和數(shù)據(jù)分析中給予的幫助！