程守夢 李琬婷 程小毛 黃曉霞

( 西南林業(yè)大學(xué)園林與園藝科學(xué)學(xué)院，國家林業(yè)局西南風(fēng)景園林工程研究中心，云南 昆明，650224)

隨著我國工業(yè)化進(jìn)程的加快，大量礦物金屬被采伐利用，導(dǎo)致進(jìn)入土壤中大量重金屬并未得到妥善治理，造成了嚴(yán)重的土壤重金屬污染[1]，土壤重金屬污染毒性大、難察覺、難降解[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國耕地重金屬污染超標(biāo)率約占全國耕地的30%以上，其中以鎘污染超標(biāo)率最高，鎘污染農(nóng)田面積達(dá)1.3萬hm2，約占總污染農(nóng)田的7.0%[3-4]，涉及我國大部分地區(qū)，主要分布在我國東南、西南地區(qū)[5]。鎘污染會(huì)影響土壤的理化性質(zhì)；阻礙植物根系對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收[6]，損害植物細(xì)胞滲透和生理代謝能力，抑制生長，降低產(chǎn)量，甚至引起植物死亡[7]。近幾年來我國類似“鎘米”的糧食安全問題頻發(fā)[8]，因此，進(jìn)一步對(duì)植物修復(fù)技術(shù)研究，對(duì)于重金屬污染土壤的治理及農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義[9]。

洋常春藤（Hedera helix），五加科（Araliaceae）常春藤屬（Hedera），多年生常綠藤本，耐蔭、抗旱[10-11]，易繁殖且生長迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，在園林中多用作地被及坡面墻體綠化等。目前關(guān)于洋常春藤研究主要有對(duì)其栽培品種藥用質(zhì)量評(píng)價(jià)[12]、皂苷類物質(zhì)的藥理應(yīng)用[13]、干旱研究[11，14]及扦插栽培[15-16]等方面，而關(guān)于其對(duì)土壤重金屬污染的抗性研究較少。本研究以洋常春藤為供試材料，通過人工控制試驗(yàn)，研究不同鎘濃度對(duì)洋常春藤的生長及部分生理特性的變化。通過研究不同濃度鎘脅迫下洋常春藤的生長生理指標(biāo)的變化，探討洋常春藤的耐鎘性，以期為植物修復(fù)重金屬污染土壤技術(shù)奠定一定的理論基礎(chǔ)，并為鎘污染地區(qū)綠化植物的科學(xué)選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2016年4月初選取當(dāng)年生洋春藤半木質(zhì)化枝條扦插于營養(yǎng)袋中，生根后于6月中旬移栽至不含蔗糖和瓊脂的MS培養(yǎng)基的組培瓶中，進(jìn)行水培培養(yǎng)，pH值為5.5～6.5，同時(shí)用黑色的聚乙烯膜包裹組培瓶外部，防止光對(duì)根系的影響，培養(yǎng)液隔天更換1次。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

待植株生長穩(wěn)定后，將生長勢一致的幼苗放于人工氣候箱中培養(yǎng)，進(jìn)行Cd2+脅迫，設(shè)定5個(gè)Cd2+脅迫濃度，分別為 CK(0 μmol/L)、Cd1(20 μmol/L)、Cd2(80 μmol/L)、Cd3(200 μmol/L)、Cd4(400 μmol/L)，溫度25/20 ℃（晝/夜），相對(duì)濕度80%，日照時(shí)數(shù)為 12 h/天（光強(qiáng)≥56.6 μmol/（m2·s））。每個(gè)濃度10株，每株1瓶，重復(fù)3次。處理60 d后測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測定方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定

脅迫結(jié)束后，選取長勢一致的幼苗，用游標(biāo)卡尺（精確到0.02 mm）和卷尺（精確到1 mm）測定株高、節(jié)間距、節(jié)間數(shù)、葉片數(shù)；洗凈根系，量取根長，后將根、莖、葉分別放入80 ℃的烘箱烘至質(zhì)量恒定，用分析天平（精確到0.0001 g）稱量根、莖、葉及總生物量，每個(gè)處理重復(fù)測定5次。

1.3.2 生理指標(biāo)測定

丙二醛（MDA）含量測定參照Hodges等[17-18]的方法，脯氨酸（Pro）含量測定參照Bates等[19]的方法，可溶性蛋白含量測定參照Bradford[20]的方法，超氧陰離子產(chǎn)生速率測定參考孫勝等[21]的方法。

取0.2 g葉片于5 mL提取緩沖溶液（50 mmol Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH為7.0，含1 mmol EDTA，體積分?jǐn)?shù)為0.05%的Trion X-1，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2%的不溶性聚乙烯比咯烷酮）中研磨成勻漿，經(jīng)過1000 r/min離心20 min，取上清液測定抗氧化酶活性[22]。過氧化物酶（POD）活性參照Lin等[23]的方法測定（酶活單位μmol/(min·g)）；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法[24]測定（酶活單位U/g）；抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性參照Nakano等[25]的方法測定（酶活單位 μmol/(min·g)）；超氧化物歧化酶（SOD）活性參照 Giannopolitis等[18，26]的方法測定（酶活單位U/g），每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一元方差分析，Ducan’s檢驗(yàn)法對(duì)平均數(shù)進(jìn)行多重比較，EXCEL繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤生長指標(biāo)的影響

從表1可知，隨著Cd2+濃度的增大，株高逐漸降低。CK的株高最高，最矮為Cd4，與CK相比顯著降低28.68%（P＜0.05）。Cd1節(jié)間距，比CK增加了10.9%，差異不顯著，而Cd4的節(jié)間距最短，比CK顯著減少了22.5%（P＜0.05）。Cd2洋常春藤節(jié)間數(shù)最少，比CK下降了37.5%（P＜0.05）。Cd1、Cd2和Cd3的葉片數(shù)量分別比CK顯著降低了24%、20.6%和29%。與其他指標(biāo)不同，Cd2+脅迫會(huì)促進(jìn)洋常春藤根系增長，其中Cd2的根系最長，比CK長1.5倍。

表1 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤生長指標(biāo)的影響Table 1 Effects of different Cd2+ concentrations on the index of growth of H.helix

2.2 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤生物量的影響

由表2可知，隨著Cd2+脅迫濃度的升高，洋常春藤根系的生物量呈先降后升再降的趨勢。Cd3根系生物量最高，比CK顯著高了約86%（P＜0.05）。莖、葉、總生物量隨著脅迫濃度增加而下降。Cd4莖、葉、總生物量均達(dá)到最低，莖生物量比CK降低20%，差異不顯著，而葉生物量比CK降低了83.0%，總生物量與CK比總生物量顯著降低36.13%（P＜0.05）。

表2 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤生物量的影響Table 2 Effects of different Cd2+concentrations on biomass of H.helix

2.3 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤葉片生理指標(biāo)的影響

從圖1可知，Cd2+處理下，洋常春藤的含量均高于CK，呈增加的趨勢，其在中、低Cd2+脅迫下變化不大，在高Cd2+脅迫下變化顯著（P＜0.05），Cd4的值最大，比 CK高 72.3%；MDA含量比CK增加56.2%；而Cd3的MDA含量最少，差異不顯著。隨著Cd2+濃度的增大，可溶性蛋白含量也增加，Cd3和Cd4的可溶性蛋白含量分別比CK增加了約158.1%和202.1%；脯氨酸含量也呈上升趨勢，Cd1的脯氨酸含量增加不明顯，Cd3、Cd4的脯氨酸含量分別比CK增加了約4倍和6倍。

2.4 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤葉片抗氧化酶活性的影響

由圖2可見，在Cd2+脅迫下，洋常春藤葉片中的CAT表現(xiàn)為先增后降的趨勢，但均高于CK，在Cd2下CAT活性達(dá)到最高，比CK增加4倍，而在Cd4脅迫下CAT活性出現(xiàn)一定程度的下降，但仍比CK的CAT活性增加了約2倍。POD活性隨著Cd2+濃度的增加而增加，呈不斷上升的線性關(guān)系，Cd4的POD活性最高，比CK顯著高14.7倍（P＜0.05）。APX除在Cd2下活性出現(xiàn)下降，低于CK外，大體呈上升趨勢；Cd2的APX活性最低，但與CK比較，差異不顯著；Cd4的APX活性最高，比CK高約2倍。Cd4的SOD活性與CK比較無顯著差異，而在低、中Cd2+脅迫下SOD活性均顯著低于CK（P＜0.05）。

圖1 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤 、MDA可溶性蛋白、脯氨酸含量的影響Fig. 1 Effects of different Cd2+ concentrations on superoxide anion， MDA soluble protein and proline content of H.helix

圖2 不同鎘濃度對(duì)洋常春藤抗氧化酶活性的影響Fig. 2 Effects of different Cd2+ concentrations on antioxidant enzymes activities of H.helix

3 結(jié)論與討論

鎘脅迫下的植物體通常具有植株矮小、生物量減少、滲透調(diào)節(jié)失衡和保護(hù)酶活性下降等特點(diǎn)[27-28]。植株生長和生物量的變化是鎘脅迫下的最易觀察的表觀性狀。本試驗(yàn)中，在20 μmol/L和80 μmol/L Cd2+脅迫下，Cd2+對(duì)洋常春藤莖、葉、總生物量影響微弱，并略微促進(jìn)根系生物量的累積和根系增長；在 200 μmol/L 和 400 μmol/L Cd2+脅迫下，洋常春藤各生物量都減少，尤其是葉片數(shù)明顯減少，葉生物量顯著下降；說明高Cd2+會(huì)阻礙其正常的生長。李冬琴等[29]的研究中，耐鎘性弱的玉豆（Phaseolus vulgaris），其株高和生物量隨著Cd2+濃度的增加而顯著下降；施寵等[30]的研究中，低Cd2+能夠促進(jìn)野燕麥（Awena fatua）幼苗株高、葉長、根長、莖粗的增加以及生物量的積累，高Cd2+則表現(xiàn)出抑制作用，其適于修復(fù)Cd2+濃度小于8 mg/L的污染土壤；在劉柿良等[31]的研究中表明，白車軸草（Tritolium repens）對(duì)Cd2+污染具有較強(qiáng)耐性，較低Cd2+處理對(duì)白車軸草無明顯影響，而較高Cd2+則顯著抑制其生物量與養(yǎng)分積累量分配；這說明Cd2+脅迫對(duì)不同植物生長和生物累積量的影響不同，本試驗(yàn)中洋常春藤表現(xiàn)出一定的耐鎘性，葉對(duì)的鎘的敏感程度大于莖、根。

可溶性蛋白可降低細(xì)胞滲透勢，能與游離的重金屬離子結(jié)合形成金屬結(jié)合蛋白，減輕重金屬的毒害作用，且含量越高，其生理生化代謝活動(dòng)就越旺盛[32-35]。脯氨酸具有強(qiáng)親水性，可調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡，增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，阻止氧自由基的產(chǎn)生，對(duì)植物體中的酶具有保護(hù)作用[36-39]。在植物受到高Cd2+脅迫時(shí)會(huì)通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高細(xì)胞滲透勢以減輕受損程度。在楊葉萍等[40]的研究中160 mg/L Cd2+處理苧麻幼苗49 d，可誘導(dǎo)苧麻（Boehmeria nivea）體內(nèi)大量形成可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等，而陳晶等[41]的研究中發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/L Cd2+處理會(huì)略降低玉米（Zea mays）幼苗葉片脯氨酸含量，有研究用25 μmol/L Cd2+處理2個(gè)箭筈豌豆（Vicia stativa）品種7 d，鎘敏感箭筈豌豆品種ZM葉中脯氨酸的含量較CK顯著上升；鎘耐性品種L3葉中脯氨酸含量較CK增加不顯著[42]。本試驗(yàn)中，低Cd2+脅迫下，可溶性蛋白、脯氨酸含量增加不明顯，在400 μmol/L Cd2+處理下兩者的含量均極顯著增加，說明洋常春藤葉片對(duì)低Cd2+脅迫不敏感，在高Cd2+脅迫下，則引起葉片內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積極響應(yīng)。Cd2+脅迫程度越大，其葉片在一定程度下會(huì)通過增加大量的可溶性蛋白、脯氨酸來平衡細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，緩減損傷，表現(xiàn)出一定的抗鎘性。

植物在逆境下可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來緩解或消除破壞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的膜脂過氧化物。其中SOD、POD、CAT能夠歧化成H2O2和O2，APX則將H2O2分解成H2O和O2；4種酶協(xié)調(diào)作用清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基、過氧化物[43-44]，防止細(xì)胞內(nèi)過量的自由基對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)生物大分子的破壞，避免細(xì)胞內(nèi)大量積累的過氧化物損傷細(xì)胞[45]。本試驗(yàn)中，洋常春藤中各抗氧化酶的活性隨著處理濃度的增大而出現(xiàn)不同的變化，但大體呈上升趨勢，有研究發(fā)現(xiàn)，野燕麥（Awena fatua）具有一定的耐鎘能力，隨著Cd2+濃度的增加，其幼苗體內(nèi)的POD、APX、CAT活性也相應(yīng)增加了；SOD活性則表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象[30]，何梨香等[46]研究報(bào)道，在低濃度下圓葉決明（Chamaecrista rotundifolia）幼苗葉片內(nèi)SOD活性雖有所降低，但由于其POD和CAT被激活，其幼苗的生長發(fā)育未受顯著影響。有報(bào)道抗鎘性差的土沉香（Aquilaria sinensis）幼苗，隨著Cd2+脅迫濃度的增加，其葉片中SOD和CAT活性均出現(xiàn)不同程度的下降[47]，表明鎘脅迫下植株各抗氧化酶的具體調(diào)節(jié)是復(fù)雜多變的，本試驗(yàn)中的洋常春藤能夠通過有效協(xié)調(diào)抗氧化酶活性來減緩低Cd2+脅迫下氧自由基和過氧化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的損傷。

本試驗(yàn)中，低Cd2+脅迫時(shí)，洋常春藤的生長發(fā)育未受顯著影響，大多數(shù)生長指標(biāo)與CK的差異不顯著；雖然MDA含量升高，SOD酶活性值低，但由于可溶性蛋白和脯氨酸的含量升高且POD、CAT和APX酶被誘導(dǎo)激活，緩解了鎘脅迫對(duì)其的毒害作用。高Cd2+脅迫時(shí)，特別是400 μmol/L Cd2+脅迫下，洋常春藤的葉、莖生物量受到顯著影響，鎘毒害作用加強(qiáng)，各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶雖有不同程度的顯著增加，但不足以消除脅迫損傷，導(dǎo)致其正常的生長發(fā)育受到阻礙，生物量累積減少?？傊虲d2+脅迫會(huì)引起洋常春藤細(xì)胞發(fā)生氧化毒害作用，葉片中的和MDA沒有顯著積累，此時(shí)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)沒有顯著增加，主要通過刺激POD和CAT活性顯著上調(diào)減緩氧化損傷。400 μmol/L Cd2+脅迫下，洋常春藤葉片氧化毒害及滲透受損明顯，葉片中顯著增加大量和MDA，POD、CAT和APX活性顯著上調(diào)，且滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性蛋白也顯著增加減緩氧化損傷，但其葉片數(shù)及生物量急劇減少，未能很好的減緩鎘毒害。綜上所述，洋常春藤具有一定的耐鎘能力，能夠通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白、脯氨酸含量以及CAT、POD和APX活性等來抵抗低Cd2+脅迫，可作為低鎘污染土壤地區(qū)園林綠化植物及生態(tài)修復(fù)植物推廣應(yīng)用。