方潤(rùn)東， 宋 娜， 周永東， 李鵬飛， 高天翔

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003; 2. 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021； 3. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021； 4. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316021)

細(xì)條天竺鯛(Apogonlineatus)屬鱸形目(Perciformes)、天竺鯛科(Apogonidae)、天竺鯛屬(Apogon)，主要分布于中國(guó)的黃渤海和東海，臺(tái)灣及南海亦有分布[1-4]，為底棲性小型魚類，多棲息于泥砂質(zhì)海底，為常見的小型魚類，是一些食肉型經(jīng)濟(jì)種類的重要食物來源。細(xì)條天竺鯛常棲息于近岸中下層，磷蝦、十足類和端足類是其主要攝食的對(duì)象[5]。由于細(xì)條天竺鯛很少被食用、沒有任何直接的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，和眾多小型魚類一樣，并未受到足夠重視。小型魚類既是食肉型經(jīng)濟(jì)魚種捕食的對(duì)象，又可以攝食其他魚類產(chǎn)的卵，可以在一定程度上調(diào)控某些經(jīng)濟(jì)魚類的種群規(guī)模[6]。因此隨著當(dāng)前漁獲物組成的明顯改變，這類小魚對(duì)于維持海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈正常有序的能量流動(dòng)和物質(zhì)交換具有不可替代的重要作用[6-8]。因此，開展對(duì)細(xì)條天竺鯛種質(zhì)資源狀況及現(xiàn)有遺傳豐富度的調(diào)查研究，能夠正確了解并有效保護(hù)這一重要的海洋魚類。迄今為止，有關(guān)細(xì)條天竺鯛的研究?jī)H僅局限于耳石形態(tài)、食性、資源分布及生態(tài)價(jià)值等基礎(chǔ)工作[9-13]。雖然細(xì)條天竺鯛具有較高的生態(tài)價(jià)值，但尚未見其群體遺傳學(xué)方面的研究報(bào)道。

為了實(shí)現(xiàn)漁業(yè)資源開發(fā)的可持續(xù)性，需要建立有效的漁業(yè)管理制度。根據(jù)群體建立不同的單元可提高漁業(yè)管理效率，而群體遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)漁業(yè)管理單元的劃分具有關(guān)鍵作用[14]。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)作為分子標(biāo)記對(duì)檢測(cè)群體遺傳結(jié)構(gòu)非常敏感，而且線粒體DNA呈母性遺傳且不發(fā)生重組，其中控制區(qū)進(jìn)化速度較快，是研究遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)較為理想的工具[15-17]。目前利用mtDNA控制區(qū)基因檢測(cè)海洋生物遺傳多樣度組成及群體遺傳特征已成為顯著有效的方法，曾先后被應(yīng)用于日本鳀(Engraulisjaponicus)、斑尾復(fù)蝦虎魚(Synechogobiusommaturus)、香魚(Plecoglossusaltivelis)[18-20]等海水魚的遺傳豐富度和遺傳特征的探討。除此以外，核苷酸序列中的變異個(gè)數(shù)和分布方式能幫助我們推測(cè)魚類種群的進(jìn)化歷程，進(jìn)而探討產(chǎn)生和維持這些多態(tài)的機(jī)制[19]。進(jìn)入更新世冰期后，全球劇烈的氣候波動(dòng)導(dǎo)致海平面下降，海洋環(huán)境變化明顯[21]。海洋魚類適宜的棲息環(huán)境大量減少導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降，幸存下來的個(gè)體集中到避難所。冰期過后，氣溫的回升使海平面回升到之前高度，幸存者在度過冰期后由原有避難所重新移殖到其他適宜生存的環(huán)境中[22]。由此可認(rèn)為冰期氣候波動(dòng)對(duì)海洋環(huán)境的改變深刻影響到海洋魚類的群體遺傳特征[23]。本研究利用mtDNA控制區(qū)序列檢測(cè)細(xì)條天竺鯛群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，探討影響其種群遺傳結(jié)構(gòu)形成和變化的因素，從而為保護(hù)細(xì)條天竺鯛現(xiàn)有生物資源及適度的開發(fā)利用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本研究所用的細(xì)條天竺鯛群體分別采自威海乳山、青島膠南、上海以及舟山近海海域，共114尾細(xì)條天竺鯛個(gè)體，基本覆蓋了中國(guó)沿海細(xì)條天竺鯛的主要分布范圍(黃渤海到東海，見表1、圖1)。物種的鑒定依據(jù)Mabuchi等[4]。

表1 細(xì)條天竺鯛的采樣信息以及一些遺傳多樣性指數(shù)Table 1 Sample information of Apogon lineatus including several genetic diversity indices

圖1 細(xì)條天竺鯛的采樣地點(diǎn)Fig.1 Sampling location of Apogon lineatus

1.2 DNA提取與目的片段擴(kuò)增

剪取樣本一小塊背部肌肉，并采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法提取基因組DNA。擴(kuò)增所用引物為控制區(qū)通用引物[19]，正向序列為5’-CCCACCACTAACTCCCAAAGC-3’，反向序列為5’-CTGGAAAGAACG-CCCGGCATG-3’。

PCR反應(yīng)在體系包括： 1 μL DNA模板，17.25 μL去離子水，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL的dNTPs，0.15 μL Taq聚合酶，正反向引物物各1 μL。熱反應(yīng)循環(huán)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 共35次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。為防止樣品污染，每次試驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照。將純化、回收后的PCR產(chǎn)物送到上海桑尼生物技術(shù)有限公司，采用ABIPrism3700自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)通產(chǎn)物序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用 Dnastar 軟件包下的Seqman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析并加以校正；遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算在ARLEQUIN 3.11軟件上完成[24]。遺傳多樣性指數(shù)包括：?jiǎn)伪缎投鄻佣?Haplotype diversity)，群體多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(No of polymorphic sites)，核苷酸多樣度(Nucleotide diversity)和平均兩兩堿基差異數(shù)(Mean pairwise nucleotide differences)。計(jì)算單倍型之間的關(guān)系和核苷酸之間的差異數(shù)，并手工構(gòu)建分支網(wǎng)絡(luò)樹。以斑鰭天竺鯛(Apogoncarinatus)為外群，使用Mega3.0軟件基于K2P模型構(gòu)建系統(tǒng)樹。

使用群體間分化指數(shù)Fst值衡量?jī)蓛扇后w間遺傳分化程度[25]。在計(jì)算兩兩群體間Fst值時(shí)，進(jìn)行10 000次重抽樣檢測(cè)其顯著性。當(dāng)進(jìn)行多重比較時(shí)，在Excel中使用Bonferroni方法校準(zhǔn)P值[26]。采用確切P檢驗(yàn)，檢查不同群體間能否發(fā)生隨機(jī)交配。

核苷酸不配對(duì)分布分析和中性檢驗(yàn)用來檢測(cè)細(xì)條天竺鯛群體歷史動(dòng)態(tài)。中性檢驗(yàn)包括Tajima’sD檢驗(yàn)[27]和Fu’Fs檢驗(yàn)[28]。D值和Fs為顯著的負(fù)值，通常表明群體經(jīng)歷過擴(kuò)張事件。核苷酸不配對(duì)分布分析同樣用來檢測(cè)是否存在群體擴(kuò)張[29]。使用廣義非線性最小方差法估算群體擴(kuò)張時(shí)間τ值和群體擴(kuò)張參數(shù)θ0，θ1。τ值是用突變單位表示的群體擴(kuò)張的時(shí)間。利用公式τ=2ut可把τ值換算成真實(shí)的擴(kuò)張時(shí)間，其中t為群體擴(kuò)張實(shí)際經(jīng)歷的時(shí)間，u為整個(gè)基因片段的變異速度。θ0代表擴(kuò)張前的群體擴(kuò)張參數(shù) ，θ1反之。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

細(xì)條天竺鯛所有個(gè)體經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得長(zhǎng)504 bp的目的片段。對(duì)所有測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行比對(duì)校正、剔除轉(zhuǎn)運(yùn)RNA后，獲得4個(gè)群體共114個(gè)個(gè)體長(zhǎng)度為476 bp的控制區(qū)第一高變區(qū)序列，作為用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的目的序列。在所有目的序列中發(fā)現(xiàn)10處簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和26處變異位點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)換23處，顛換3處。4種堿基在目的序列中占比分別為：A為32.39%，C為18.62%，G為17.19%，T為31.80%， A+T占比(64.19%)高出C+G占比(35.81%)很多，表現(xiàn)為AT偏好。細(xì)條天竺鯛控制區(qū)A+T含量較高，與其他海洋魚類控制區(qū)A+T占比高，C+G占比低的特征類似。除此之外，114條控制區(qū)序列共包含了30個(gè)單倍型，其中僅有4個(gè)單倍型被不同群體共享，其余26個(gè)均為各群體所獨(dú)有(見表2)。綜合單倍型多樣度及核苷酸多樣度來看，上海和舟山群體的遺傳多樣性高于乳山和膠南群體的遺傳多樣性。

表2 細(xì)條天竺鯛4個(gè)地理群體的單倍型分布Table 2 Haplotypes in four Apogon lineatus populations

續(xù)表2

單倍型Haplotypes乳山(RS)膠南(JN)上海(SH)舟山(ZS)Hap 180010Hap 210010Hap 220010Hap 230010Hap 240001Hap 250001Hap 260001Hap 270001Hap 280001Hap 290001Hap 300001

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

以斑鰭天竺鯛為外群，利用30個(gè)細(xì)條天竺鯛控制區(qū)單倍型構(gòu)造鄰接關(guān)系樹(Neighbor-joining tree，NJ樹)，結(jié)果表明不同群體的單倍型均無規(guī)律地散布到單倍型NJ樹上。不存在與地理群體顯著對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)分支，由此我們認(rèn)為細(xì)條天竺鯛不同地理群體間并無顯著的譜系結(jié)構(gòu)。細(xì)條天竺鯛與斑鰭天竺鯛遺傳差異顯著(見圖2)。

(比例尺為0.01，代表遺傳距離遠(yuǎn)近，分支處數(shù)字為超過50%的自展支持率。Scale bar=0.01 substitutios per site. Numbers at notes are bootstrap values.The numbers lower than 50% are not shown.)

圖2 基于細(xì)條天竺鯛30個(gè)控制區(qū)單倍型構(gòu)建的鄰接關(guān)系樹， 所用外群為斑鰭天竺鯛A.carinatus
Fig.2 NJ tree forA.lineatusbased on 30 haplotypes with an outgroupA.carinatus

由30個(gè)單倍型構(gòu)成的分支網(wǎng)絡(luò)樹(見圖3)，其分支結(jié)構(gòu)與NJ樹的構(gòu)造相類似，沒有發(fā)現(xiàn)某一單倍型分支都來自同一地理群體的現(xiàn)象。分支網(wǎng)絡(luò)樹的構(gòu)造為星爆形，由此可推測(cè)細(xì)條天竺鯛群體歷史上曾發(fā)生擴(kuò)張事件。

細(xì)條天竺鯛兩兩群體間Fst值的范圍為-0.015到0.067(見表3)，并且不同群體間遺傳差異都不顯著(經(jīng)校正的P值大于0.05)，同時(shí)確切P檢驗(yàn)的分析提示隨機(jī)交配現(xiàn)象廣泛存在于這4個(gè)群體之間。

圖3 細(xì)條天竺鯛控制區(qū)單倍型分支網(wǎng)絡(luò)樹Fig.3 Minimum spanning trees showing genetics relationship in A. lineatus

乳山(RS)膠南(JN)上海(SH)舟山(ZS)乳山(RS)—0.8660.0200.117膠南(JN)0.017—0.0110.045上海(SH)0.0340.067—0.607舟山(ZS)0.0180.062-0.015—

2.3 群體歷史動(dòng)態(tài)

較低的核苷酸多樣度和單倍型分支網(wǎng)絡(luò)樹的星爆形構(gòu)造，暗示了細(xì)條天竺鯛群體歷史上可能發(fā)生過擴(kuò)張事件。核苷酸不配對(duì)分布分析的結(jié)果(見圖4)表明，細(xì)條天竺鯛核苷酸不配對(duì)分布表現(xiàn)為近正態(tài)分布單峰形，同時(shí)觀測(cè)值的分布與群體擴(kuò)張模型預(yù)期分布較好地重合。利用中性檢驗(yàn)對(duì)這一推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證(見表4)，Tajima’sD值和FS值均小于0，并且所有群體的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著(P<0.05)。因此綜合以上兩種方法的驗(yàn)證，我們認(rèn)為細(xì)條天竺鯛群體歷史上發(fā)生過擴(kuò)張事件。

圖4 細(xì)條天竺鯛控制區(qū)單倍型核苷酸不配對(duì)分布Fig.4 Mismatch distributions of control region haplotypes of A. lineatus

τ值(圖4中的峰值)是用突變單位表示的群體擴(kuò)張的時(shí)間，利用公式τ=2ut可換算成真實(shí)的擴(kuò)張時(shí)間t，其中u為整個(gè)基因片段的變異速度。本研究根據(jù)5%～10%/MY的控制區(qū)分歧速率和τ值2.973，估算出細(xì)條天竺鯛的群體擴(kuò)張時(shí)間大約為62 450～124 900 a前，處于更新世晚期。

3 討論

具有較高遺傳多樣性的物種，生存能力和對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)[30]。對(duì)物種遺傳多樣性的研究可以幫助預(yù)測(cè)物種的發(fā)展動(dòng)向和分析物種的進(jìn)化潛力。

表4 細(xì)條天竺鯛群體Tajima’s D、Fu’Fs統(tǒng)計(jì)值和核苷酸不配對(duì)分布分析結(jié)果Table 4 Tajima’s D, Fu’Fs and mismatch distribution parameter of A. lineatus

本研究中，細(xì)條天竺鯛作為其分布區(qū)主要小型魚類優(yōu)勢(shì)種和肉食性經(jīng)濟(jì)魚類的重要餌料魚種，與已研究報(bào)道的魚類相比其遺傳多樣性屬于中等偏低的水平[19-20]。鑒于高有效種群尺度是維持物種高水平遺傳多樣性的原因[31]，有效種群較小是造成其低遺傳多樣性的重要原因，細(xì)條天竺鯛資源量可能較少，因此其資源狀況需要引起漁業(yè)資源管理部門的重視。

海洋生態(tài)系統(tǒng)由于其開放性缺乏明顯的地理和物理障礙，并且廣泛存在的洋流運(yùn)動(dòng)能夠使魚卵、幼體和成魚擴(kuò)散到更遠(yuǎn)的范圍。海洋魚類群體間的基因交流一般不會(huì)因?yàn)榈乩砭嚯x增大而中斷，這保證了不同地理群體仍有相似的遺傳結(jié)構(gòu)[31-34]。Fst值又稱群體分化指數(shù)，用來描述群體間遺傳差異大小，差異越大則該值越大，反之越小。細(xì)條天竺鯛4個(gè)群體的遺傳分化指數(shù)Fst值介于-0.015～0.067之間，同時(shí)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)不顯著，因此可以判斷不同地理群體間遺傳結(jié)構(gòu)非常相近。本研究通過對(duì)細(xì)條天竺鯛線粒體DNA控制區(qū)序列分析，表明細(xì)條天竺鯛分布在我國(guó)黃海和東海的4個(gè)群體間沒有明顯的地理分化，可能是由一個(gè)大而穩(wěn)定的種群經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化而來。出現(xiàn)這種情況的原因可能是：乳山海域到舟山海域之間不存在影響細(xì)條天竺鯛基因交流的明顯地理障礙，雖然細(xì)條天竺鯛成體不作長(zhǎng)距離遷移，但是其漂浮卵、浮游幼體和成體都可能因?yàn)橹袊?guó)沿岸流活動(dòng)而擴(kuò)散較遠(yuǎn)的距離[21,35]。我國(guó)近海的黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)和臺(tái)灣海峽的斑鰶(Konosiruspunctatus)等也被證實(shí)在較大區(qū)域內(nèi)沒有明顯的地理分化[36-37]。

更新世全球氣候波動(dòng)表現(xiàn)為冰期和間冰期相互更迭。以大概10萬a為一次間隔，這樣的氣候更替持續(xù)了80萬a，海平面也隨之發(fā)生升降[38]。第四紀(jì)末冰盛期，海平面下降了120～140 m，細(xì)條天竺鯛的群體數(shù)量和分布受到了巨大影響，適宜其棲息的環(huán)境大量消失導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降，幸存下來的個(gè)體集中在避難所。冰期過后，氣溫的回升使海平面回升到之前高度，細(xì)條天竺鯛在度過冰期后由原有避難所重新移殖到其他適宜生存的環(huán)境中，之前孤立的種群也隨著隔離海域的重新連接開始逐漸交流[39-40]。細(xì)條天竺鯛上海、舟山群體的單倍型多樣度及核苷酸多樣度顯著高于乳山、膠南群體，我們推測(cè)可能是因?yàn)橹袊?guó)東海海盆是其在更新世冰期的避難所之一[18]。核苷酸不配對(duì)分布在經(jīng)歷過近期群體擴(kuò)張事件的群體中一般會(huì)呈現(xiàn)明顯的單峰分布[29,41]。核苷酸不配對(duì)分布的結(jié)果提示細(xì)條天竺鯛發(fā)生了群體擴(kuò)張，Tajima’sD值和FS值均小于0，并且所有群體的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著(P<0.05)，亦驗(yàn)證了這一推測(cè)。我們將5%～10%/MY的控制區(qū)分歧速率用于細(xì)條天竺鯛控制區(qū)，得出其群體擴(kuò)張事件大約發(fā)生在在62 450～124 900年前，屬于晚更新世冰期。由此可以推測(cè)細(xì)條天竺鯛的群體擴(kuò)張事件與更新世氣候的波動(dòng)有關(guān)。

本研究涉及的地理群體只有乳山、膠南、上海和舟山共4個(gè)群體，而鑒于細(xì)條天竺鯛在我國(guó)是分布于黃渤海及東海的常見小型魚類，因此想要探討細(xì)條天竺鯛在中國(guó)沿海分布范圍內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)我們還需要分析更多的群體以及樣本并利用包括核基因等分子標(biāo)記方法，以期更好地了解這一物種的遺傳分化，為評(píng)估其資源狀況及在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。