張 娜，孔德潤

胃癌是最常見的惡性胃腸癌之一，而我國是胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)之一[1]。胃癌患者死亡的主要原因是胃癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，通常在出現(xiàn)明顯癥狀時多已發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]，且患者術(shù)后五年生存率很低。了解胃癌病程進展和轉(zhuǎn)移的分子機制對胃癌的早期診斷和治療非常重要。

增殖阻斷蛋白1(block of proliferation 1，BOP1)基因由Pestov et al[3]于1998年從小鼠cDNA文庫中克隆出的一種基因，其序列高度保守，位于人類8q24.3[4]，屬于WD40蛋白家族[3]，與Pescadillo同源蛋白1(pescadillo homologue 1，PES1)和WD重復(fù)蛋白12(WD repeat domain 12，WDR12)形成穩(wěn)定的復(fù)合物PeBow Complex，參與核糖體60S亞基的成熟過程。目前研究[4-7]發(fā)現(xiàn)，BOP1的異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。然而，BOP1與胃癌之間的相關(guān)性研究卻鮮有報道。本實驗以胃癌細胞BGC823作為模型，siRNA特異性結(jié)合BGC823細胞BOP1的mRNA并將其沉默，研究BOP1對胃癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。實驗檢測了BOP1在人胃癌組織和細胞中的表達，并通過siRNA瞬時轉(zhuǎn)染抑制BGC823細胞中BOP1的表達，探討B(tài)OP1對胃癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年4月～2018年3月接受胃癌根治術(shù)的60例患者腫瘤組織和鄰近的非腫瘤組織。所有標本都在液氮中快速冷凍并儲存在-80 ℃冰箱中。每位患者均獲得知情同意書，研究方案已獲倫理委員會批準。手術(shù)前患者未接受過化療、放療或其他相關(guān)的抗腫瘤治療。人正常胃黏膜上皮細胞GES1和胃癌細胞BGC823均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)。

1.1.2主要試劑 轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECTTMTransfection Reagent購自美國Dharmacon；siRNA購自中國吉瑪公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti-BOP1抗體、兔抗人GAPDH購自美國Abcam公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 胃黏膜上皮細胞GES1和胃癌細胞BGC823在10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37 ℃下在含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中孵育，當這些細胞匯合80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2實時定量熒光PCR 采用TRIzol法提取組織和細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR循環(huán)擴增，GAPDH作為內(nèi)參照。BOP1上游引物：5′-GAGTATGCGGAGGACAGCTC-3′，下游引物：5′-TGCTCATCCGTCAGTCTCAG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，下游引物：5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3′。運用2-ΔΔCt法計算相對mRNA表達量。每次實驗重復(fù)3次。

1.2.3Western blot 用含2%磷酸酶抑制劑混合物和1% PMSF的RIPA裂解液在冰上提取組織和細胞總蛋白。蛋白樣品通過BCA法測定濃度并稀釋至相同濃度。將各組蛋白質(zhì)樣品與蛋白上樣緩沖液徹底混合后，將其在100 ℃下煮沸10 min以使蛋白質(zhì)變性并加入到SDS-PAGE中進行電泳分離。濃縮分離后的蛋白移至PVDF膜上并用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。 在 4 ℃孵育一抗過夜，并用TBST清洗后再室溫孵育二抗(1 ∶2 000)1 h，TBST清洗4次(8 min/次)后顯影印跡。應(yīng)用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4轉(zhuǎn)染實驗 收集對數(shù)生長期的BGC823細胞鋪在6孔板中過夜。將5 μl siRNA和195 μl不含血清的培養(yǎng)基混合液與5 μl DharmaFECTTM 轉(zhuǎn)染試劑和195 μl不含血清的培養(yǎng)基混合液各放置5 min后，再把這兩份混合液混合孵育20 min后加入6孔板中。實驗選用3條BOP1-siRNA分別為siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3，用1條無任何靶基因的siRNA作為陰性對照(negative control，NC)，用1條GAPDH-siRNA作為陽性對照(positive control，PC)，不做任何處理作為空白對照(blank control,BC)，實驗共分為6組，具體基因序列見表1。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，分別用Real-time PCR和Western blot法檢驗基因沉默效率。選擇具有最高沉默效率的BOP1-siRNA用于劃痕、Transwell小室遷移和侵襲實驗。

表1 小干擾RNA基因序列

1.2.5劃痕實驗 將細胞鋪在6孔板上并生長至80%～90%融合換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，使用P-200一次性吸頭，將相同尺寸的劃痕施加于細胞單層，并用PBS洗滌兩次以除去細胞碎片。分別在0、24和48 h的劃痕時間點觀察和拍照以監(jiān)測傷口愈合過程，并收集圖像數(shù)據(jù)以分析實驗結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Transwell遷移實驗 收集細胞并用PBS洗滌兩次。將600 μl含有15% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液加入Transwell的下室，并將200 μl細胞濃度為5×105個/ml的待測細胞加入到上室中。培養(yǎng)36 h后，用棉簽去除上室中的基質(zhì)膠，并用4%多聚甲醛溶液將黏附于Transwell小室膜下的表面細胞固定30 min。然后風干，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，求其平均值。實驗重復(fù)3次。

1.2.7Transwell侵襲實驗 將基質(zhì)膠(Matrigel)和無血清培養(yǎng)基按1 ∶8稀釋并混合，在Transwell細胞培養(yǎng)室中包被50 μl稀釋的Matrigel。于37 ℃的培養(yǎng)箱中固化并放置一旁，其余的實驗步驟同遷移實驗。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織及鄰近正常胃組織中BOP1的表達水平如圖1所示，Real-time和Western blot檢測胃癌組織及癌旁正常胃組織中BOP1 mRNA及蛋白的表達。GraphPad Prism 6分析顯示，胃癌組織中BOP1 mRNA(t=2.990，P<0.05，圖1A)及蛋白(t=4.900，P<0.01，圖1B)的表達水平高于癌旁組織。

2.2BOP1在GES1及BGC823細胞中的表達水平與胃黏膜上皮細胞GES1相比，胃癌細胞BGC823中BOP1 mRNA和蛋白的表達水平分別為1.5倍和1.8倍。BOP1 mRNA(t=8.667，P<0.01，圖2A)和蛋白(t=19.68，P<0.01，圖2B)在胃癌細胞BGC823中的表達顯著高于胃黏膜正常細胞GES1。見圖2。

2.3siRNA靶向沉默BOP1基因的表達效果如圖3所示，按照DharmaFECTTMTransfection Reagent說明書轉(zhuǎn)染胃癌細胞BGC823，通過Real-time PCR和Western blot法檢測BC組、si-NC組、si-GAPDH組、siRNA-1組、siRNA-2組和siRNA-3組mRNA和蛋白表達水平情況。檢測結(jié)果顯示：si-GAPDH組GAPDH mRNA和蛋白表達水平顯著低于其他組。轉(zhuǎn)染48 h后si-RNA組中BOP1的mRNA(F=2 484，P<0.01，圖3A)及蛋白(F=1 533，P<0.01，圖3B)表達水平低于BC組、si-NC組和si-GAPDH組，其中siRNA-2組最明顯。選擇具有最高沉默效率的siRNA用于后續(xù)傷口愈合、Transwell小室遷移和侵襲實驗。

圖1 胃癌組織和鄰近正常胃癌旁組織中BOP1 mRNA和蛋白的表達水平

2.4沉默BOP1基因?qū)毎w移的影響在胃癌細胞BGC823沉默后，進行傷口愈合實驗。如圖4所示，BC組、si-NC組、si-BOP1組細胞劃痕愈合率在24 h的平均數(shù)分別為(39.63±5.84)%、(44.11±4.84)%、(18.66±2.98)%，在48 h的平均數(shù)分別為(70.60±3.94)%、(64.94±3.31)%、(26.34±3.40)%，si-BOP1組的細胞劃痕愈合率在24 h 和48 h組明顯低于BC組和si-NC組，表明劃痕24 h 和48 h后 si-BOP1組的遷移能力與BC組和si-NC組相比明顯降低(F=50.02，P<0.01；F=274.5，P<0.01)。

圖2 GES1細胞和BGC823細胞中BOP1 mRNA和蛋白的表達水平

圖3 轉(zhuǎn)染前后各組BGC-823細胞中BOP1 mRNA和蛋白的表達水平

圖4 沉默BOP1基因?qū)GC823細胞遷移的影響

2.5沉默BOP1基因?qū)毎w移和侵襲的影響用沉默后的胃癌細胞BGC823做Transwell遷移實驗，如圖5所示，BC組、si-NC組、si-BOP1組穿透Transwell基底膜的細胞數(shù)的平均數(shù)分別為(573.50±23.05)、(555.80±32.12)、(88.83±28.52)，si-BOP1組穿透Transwell基底膜的細胞數(shù)顯著低于BC組和si-NC組，表明si-BOP1組的遷移能力與BC組和si-NC組相比明顯降低(F=572.2，P<0.01)。

Transwell侵襲實驗用于分析沉默胃癌細胞BGC823中穿過基底膜的細胞數(shù)量的差異。如圖5所示，BC組、si-NC組、si-BOP1組細胞侵襲穿過小室底膜的細胞數(shù)的平均數(shù)分別為(604.30±29.53)、(618.00±41.96)、(115.80±27.18)，BC組和si-NC組細胞侵襲穿過小室底膜的細胞數(shù)明顯高于si-BOP1組的細胞數(shù)，表明si-BOP1組的侵襲能力與BC組和si-NC組相比明顯降低(F=436.9，P<0.01)。

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜而持續(xù)的過程，涉及多種機制，其嚴重影響患者生命和治療效果[8]。雖然手術(shù)治療、化療和放療可以大大提高胃癌患者的生存率，但胃癌的早期癥狀并不典型，大多數(shù)患者在晚期被診斷為淋巴結(jié)/遠處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[9]。因此，對于胃癌早期病變指標的探究和尋找胃癌細胞遷移和侵襲能力影響因素的研究尤為重要。

已有研究指出，BOP1在大腸癌[4-5]、肝細胞癌[6]和小鼠骨肉瘤模型中[7]過表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。BOP1基因位于8q24.3，而8q24位點與多種腫瘤關(guān)系密切[10-11]。BOP1又是核糖體RNA前體向成熟RNA轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵分子，而核糖體合成異常在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。BOP1可促進結(jié)腸直腸癌[5]和肝癌[6]中腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，與腫瘤細胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。因此，本研究旨在探討B(tài)OP1在胃癌中的表達和作用。

圖5 BOP1沉默對BGC823細胞遷移和侵襲的影響 結(jié)晶紫染色×100

術(shù)后胃癌患者手術(shù)標本檢測結(jié)果顯示BOP1在胃癌組織中mRNA和蛋白的表達水平明顯高于癌旁組織。siRNA是一種可以結(jié)合RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)并用Argonaute 2( RISC的催化核心)解開siRNA雙鏈，轉(zhuǎn)錄后沉默目的基因的小干擾RNA[13]。在本實驗中，BGC823細胞中BOP1基因的表達被siRNA干擾；通過劃痕24 h組和48 h組與對照組相比較的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BOP1沉默組BGC823細胞遷移能力顯著下降，提示沉默BOP1基因具有抑制胃癌細胞BGC823遷移能力的功能；同時，Transwell遷移實驗和侵襲實驗顯示BOP1沉默組的遷移和侵襲能力顯著低于對照組。上述結(jié)果表明沉默BOP1基因顯著降低了胃癌細胞BGC823遷移和侵襲的能力。提示BOP1可能在胃癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中具有重要作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是惡性腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中的關(guān)鍵媒介,其與胃腸道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[14]。EMT是一個復(fù)雜的過程，需要細胞黏附和形態(tài)的廣泛變化以及信號通路的激活。Chung et al[6]研究發(fā)現(xiàn)BOP1敲低的細胞中EMT的表型明顯消退，而上皮標志物(E-鈣粘蛋白，細胞角蛋白18和γ-連環(huán)蛋白)的上調(diào)和間充質(zhì)標志物的下調(diào)提示BOP1可能是誘導(dǎo)EMT 的上游分子并激活RhoA鳥苷三磷酸酶(GTP酶)促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。Qi et al[5]證明Wnt /β-連環(huán)蛋白靶基因BOP1等過表達可降低結(jié)腸直腸癌(CRC)EMT發(fā)生的細胞黏附分子E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達，促進CRC細胞的遷移。E-鈣粘蛋白可以通過螯合β-連環(huán)蛋白(beta-catenin)與LEF(淋巴增強因子)/ TCF(T細胞因子)結(jié)合激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路[15]。提示BOP1可能激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號途徑，降低細胞相關(guān)黏附分子的表達，從而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。