孔水仙,白洪越,王 宇,侯熙彥,呂 俠

(1. 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 遼寧 大連 116027 )

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(Uridine 5'-diphospho-glucuronosyltransferase,UGTs)是一種重要的II相代謝酶，介導(dǎo)各類葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)[1]。UGTs酶活性升高、降低及活性消失，無疑會直接導(dǎo)致UGTs參與代謝清除為主的物質(zhì)在人體內(nèi)的血漿藥物濃度降低或升高，進而導(dǎo)致藥效的缺失/減少或毒性作用的產(chǎn)生。N-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺(NBHN)能夠被UGTs酶廣泛快速代謝，生成單一的代謝產(chǎn)物N-正丁基-4-羥基-1,8-萘酰亞胺葡萄糖醛酸苷(NBHNG)，該產(chǎn)物具有較好的熒光屬性，使得NBHN能夠作為UGTs酶廣譜熒光探針底物，進行各個亞型UGTs酶活性的同時檢測[2]。再者NBHNG也被作為探針底物用于β-葡萄糖醛酸苷酶的活性檢測[3]。本文首先考察了不同種屬動物肝微粒體催化NBHN發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率,篩選出能夠高效轉(zhuǎn)化NBHN的酶源。 同時,應(yīng)用固相陰離子交換柱實現(xiàn)了目標(biāo)產(chǎn)物的特異性收集、高效分離及純化，并對其結(jié)構(gòu)進行了表征，獲得了純度大于95%的NBHN葡萄糖醛酸苷產(chǎn)物單體。

1 實驗部分

1.1 試劑

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸鈉鹽(UDPGA)、聚氧乙烯十六烷基醚(Brij58)、MgCl2和三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購自Sigma公司; 人肝微粒體(HLM)、食蟹猴肝微粒體(CyLM)、大鼠肝微粒體(RLM)、小鼠肝微粒體(MLM)、豚鼠肝微粒體(GLM)、比格狗肝微粒體(DLM)、豬肝微粒體(PLM)、牛肝微粒體(BLM)和兔肝微粒體(RaLM)均購自瑞德肝臟疾病研究有限公司;C18WAX 陰離子交換固相色譜柱購自大連思譜有限公司。

1.2 實驗過程

1.2.1 NBHNG的制備與鑒定

在UGTs反應(yīng)體系中依次加入猴肝微粒體(0.5 mg/mL)，NBHN(500 μmol/L),Tris-HCl(50 mmol/L),及MgCl2(50 mmol/L)，再加入UDPGA(40 mmol/L)起始反應(yīng)。37 ℃下孵育 5 h 后,在上述反應(yīng)體系中加入乙腈終止反應(yīng),于高速冷凍離心機中離心20 min(4℃，20，000×g)。取上清液于UPLC-UV-ESI-MS分析NBHN生成NBHN葡萄糖醛酸苷產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率?；旌弦杭尤隒18WAX固相萃取柱進行富集、分離和純化。采用UPLC-UV-MS對洗脫液中目標(biāo)產(chǎn)物進行鑒定、監(jiān)測及純度分析。含有NBHN葡萄糖醛酸苷的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得單體目標(biāo)產(chǎn)物。所得產(chǎn)物通過紫外，質(zhì)譜和核磁共振進行結(jié)構(gòu)表征。

1.2.2 NBHNG紫外光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制

將目標(biāo)產(chǎn)物配置成濃度為10μmol/L的Tris-HCl-乙腈混合液(1∶1)，分別吸取200 μL置于96孔透明酶標(biāo)板和黑色酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀分別測定NBHN葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的紫外吸收光譜(300～800 nm)和熒光發(fā)射光譜(400～800 nm)。

1.2.3 NBHNG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

首先，配制一系列不同濃度的NBHNG標(biāo)準(zhǔn)溶液(0,3.9,7.8,15.6,31.25,62.5,125,250,500,1000,2000,8,16,2500和3750 nmol/L),取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL于pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中(200 μL)并加入等體積乙腈。然后，吸取200 μL置于96孔黑色酶標(biāo)板中，使用多功能酶標(biāo)儀測定NBHNG的熒光強度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)置為362 nm和450 nm。最后，以NBHNG標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，NBHNG的熒光強度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 種屬差異實驗結(jié)果

9種動物肝微粒體催化NBHN發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)的高效液相色譜分析結(jié)果如圖 1(a)所示,當(dāng)?shù)孜颪BHN終濃度為500 μmol/ L，各種屬肝微粒體蛋白終濃度為0.5 mg/mL時，通過5h的孵育后，9種動物肝微粒體均能夠催化NBHN發(fā)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)，且轉(zhuǎn)化效率均超過50%。CyLM,RLM,MLM,GPLM,PLM,DLM,RaLM,BLM和HLM的轉(zhuǎn)化率分別為97.6%,70.6%,72.0%,89.1%,86.9%,78.1%,83.4%,93.9%和52.9%。結(jié)果如圖 1(b)所示,在正離子模式下掃描,其代謝產(chǎn)物準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,m/z:446.15,表明該代謝產(chǎn)物的分子量為445.15,比底物NBHN的分子量增加了176,初步確定該產(chǎn)物為NBHN的單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

2.2 NHBNG結(jié)構(gòu)表征

NBHNG淺黃色粉末(乙腈)，紫外最大吸收波長為240 nm和360 nm，結(jié)合核磁共振氫譜和碳譜推測其分子式為C22H23NO9。從13C NMR 中發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)6個新的葡萄糖醛酸的碳信號(δ100.1,73.3,75.7,71.5,75.7,170.0)。從遠程相關(guān)譜圖HMBC譜中看到(δ5.40) 的葡萄糖醛酸的端基氫信號與C-4(δ157.8)有相關(guān)。1H NMR 中產(chǎn)物的葡萄糖醛酸特征信號端基質(zhì)子 H(δ5.40,J=7.2Hz)偶合常數(shù)大于7,再次證實其為β構(gòu)型糖苷鍵。因此,可確定NBHN在猴肝微粒體的催化下生成了NBHN-β-D-葡萄糖醛酸苷結(jié)合物。

2.3 NBHNG紫外光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制

結(jié)果表明,NBHN在UGTs酶的催化作用下可生成具有較好熒光屬性的產(chǎn)物NBHNG. 通過在單位時間內(nèi)檢測NBHNG熒光信號強度的變化,可實現(xiàn)復(fù)雜生物體系中多種UGTs亞型酶活性的高通量檢測及其各亞型UGTs酶抑制劑的快速篩選.

Fig.2 Absorption (a) and emission (b) spectrum of NBHNG

2.4 NBHNG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

借助多功能酶標(biāo)儀熒光檢測法構(gòu)建了NBHNG的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 3所示,可見NBHNG在 0 ～3.75 μmol/ L 濃度范圍內(nèi)其熒光強度與濃度呈線性關(guān)系,回歸方程為y=21.64x+700.8,R2=0.9997。NBHNG的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制對于后續(xù)多種UGTs亞型酶活性的定量檢測、酶動力學(xué)實驗及各亞型UGTs酶抑制劑的抑制常數(shù)的測定具有重要意義。

Fig.3 Calibration curve of NBHNG

3 結(jié)論

本文利用猴肝微粒體能夠高效轉(zhuǎn)化NBHN生成NBHN的單葡萄糖醛酸苷(NBHNG)產(chǎn)物，實現(xiàn)了NBHNG的高效生物合成。同時，借助C18WAX固相萃取柱實現(xiàn)了NBHNG的特異性收集、高效分離及純化。該生物合成法轉(zhuǎn)化效率高、目標(biāo)化合物純度高、產(chǎn)物后處理及制備過程較為簡單,為NBHNβ-D-葡萄糖醛酸苷的高效制備提供了新方法.