, ,,Clint Taonaishe Chimbangu,,*

(1.錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001;2.大連市農產品質量監(jiān)測中心,遼寧大連 116037)

紅樹莓(RubusidaeusL.)懸鉤子植物,柔嫩多汁,香氣獨特。樹莓含有豐富的鐵、銅、鎂、鉀等微量元素及SOD、VE、VC和多酚等抗氧化類物質[1-2]。花色苷是樹莓中重要的功能性成分[3],其含量遠高于蘋果、草莓、葡萄等水果[4]?；ㄉ站哂星宄杂苫?、抗炎、抗氧化、抗血栓,預防心血管疾病、抗癌、減肥、改善視力、延緩衰老等生理活性[5-6],目前對于抗氧化活性研究較為深入。樹莓花色苷有抗氧化、降血脂、抑菌活性,并對癌癥、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖[7-8]等具有預防作用。近些年來關于漿果類抗衰老方面的報道較多,例如沙棘、葡萄、藍莓、櫻桃等的多糖、色素、多酚等在延緩衰老、提高記憶力、增強機體體質等有很好的效果[9-12],同時發(fā)現(xiàn)樹莓糖蛋白[13]也有一定的抗衰老作用,但關于樹莓花色苷干預衰老過程研究并不多見,所以這為紅樹莓的加工利用提供了新思路。

衰老是由多方面因素相互作用的結果,表現(xiàn)為一系列機體變化和功能紊亂。通過持續(xù)注射一定量D-半乳糖模擬自然衰老過程,是公認的衰老研究的方法之一[14]。D-半乳糖在小鼠體內氧化產生大量自由基,迅速與細胞組分例如蛋白質、氨基酸、脂質等反應產生氧化產物,導致細胞膜通透性發(fā)生改變,使細胞代謝和功能形態(tài)發(fā)生改變,從而引起細胞衰老和死亡[14]。脂質過氧化作用還會導致膠原蛋白產生交聯(lián),而使皮膚松弛、色素沉積等[15]。

因此本實驗預以D-半乳糖使小鼠為亞急性衰老模型,用紅樹莓花色苷(red raspberry anthocyanins,RRA)對其進行灌胃,通過觀察小鼠器官指數(shù)、抗氧化酶活力及心臟和腎臟結構形態(tài)變化,評價樹莓花色苷對機體衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹莓品種為費爾杜德(cv.Fertod Zamatos) 錦州七里河樹莓種植基地,無損果迅速去除田間熱、單體速凍后,置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?D-半乳糖粉劑 上海國藥集團化學試劑有限公司;抗壞血酸(VC) 濟南匯錦川化工有限公司;生理鹽水 江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司;甲醇 分析純,天津市大茂化學公司;SOD測試盒、CAT測試盒、GSH-Px測試盒、MDA測試盒、HYP測試盒 南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅染料 沈陽萬類生物有限公司;二甲苯 濟南匯豐達化工有限公司;SPF級雄性昆明(KM)小鼠60只 錦州醫(yī)科大學動物實驗中心,許可證號:SCXK(遼)2014-0004。

恒溫水浴鍋 上海雷韻試驗儀器制造有限公司;FA2104電子天平 上海雷韻試驗儀器制造有限公司;渦旋混合器 美國LABNET公司;高速組織搗碎機 上海標本模型廠;UV-1200紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;PHS-25 pH計 上海雷磁儀器有限公司;RE-1002旋轉蒸發(fā)器 西安禾普生物科技有限公司;DS-040ST功率可調超聲波清洗機 浙江東森電器有限公司;高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;組織研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;組織包埋機 美國Thermo公司;CUT4062石蠟切片機 德國SLEE公司;光學顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樹莓花色苷提取 紅樹莓凍果與含0.05% HCl的甲醇溶液[16]按質量與體積比1∶15室溫下用組織搗碎機破碎至無完整種子,再置于50 ℃、超聲功率為500 W超聲條件下提取1.5 h,抽濾去渣。重復超聲提取2次,合并濾液,過硅藻土去除脂溶性雜質,45 ℃旋轉蒸發(fā)至甲醇揮發(fā)完全,-80 ℃冷凍備用。

1.2.2 大孔樹脂AB-8純化紅樹莓花色苷粗提物 將1.2.1樣品用2 mol/L HCl調節(jié)pH2,濃度調節(jié)為上樣質量濃度2.3 mg/mL,上樣流速1.7 mL/min,上樣體積200 mL,樹脂動態(tài)吸附達到飽和狀態(tài)。60 mL 60%乙醇2 mL/min進行洗脫,45 ℃旋轉蒸發(fā)去除乙醇,-80 ℃冷凍備用?；ㄉ蘸繙y定[17]采用pH示差法:

花色苷含量(mg/100 g)=[(A515-A700)pH1-(A515-A700)pH4.5]×MW×DF×1000×V/(ε×1×m)×100

式(1)

式中:A515和A700分別為515和700 nm處的吸光度;MW為相對分子質量,以矢車菊-3-葡萄糖苷為標準449.4;DF為稀釋倍數(shù);ε為消光系數(shù),26900 L·cm-1·mg-1;1為光程(1 cm)。V為提取液的總體積(mL);m為樣品的質量(g)。

1.2.3 動物分組及給藥 選擇健康昆明小鼠60只,適應性飼養(yǎng)7 d,隨機分6組:空白對照組、D-半乳糖模型組、VC陽性對照組、紅樹莓花色苷低劑量組(RRA-L)、中劑量組(RRA-M)和高劑量組(RRA-H),每組10只。于每日下午2點,空白對照組頸背部注射生理鹽水,其余各組注射D-半乳糖400 mg/kg;空白對照組和模型組灌胃雙蒸水,陽性對照組灌胃VC溶液100 mg/kg,花色苷低、中、高劑量組分別灌胃花色苷含量為20、100、500 mg/kg體重。每天進行注射及灌胃給藥,持續(xù)8周。每周稱量體重一次,調節(jié)注射及灌胃劑量。

1.2.4 檢測樣品的采集 末次給藥,禁食24 h,自由飲水,并用10% Na2S涂于各組小鼠背部兩肩胛處皮膚脫毛。第二天摘眼球取血(斜面靜置20 min,于4 ℃、2000 r/min,離心10 min,取上清,即為血清),斷頸處死,剪下脫毛皮膚,表2～表4同。鋪平用打孔器取4塊直徑為1.4 cm左右的皮膚(去除結締組織和皮下脂肪),并取心臟、肝臟、腎臟、胸腺和脾臟組織,剔去周圍結締組織。

表4 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠皮膚SOD、CAT、GSH-Px活力和HYP含量的影響Table 4 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of HYP in skin of mice

表2 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 2 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of MDA in liver of mice

1.2.5 器官指數(shù)的測定 將胸腺、脾臟、肝臟和腎臟組織于4 ℃生理鹽水中洗去浮血,濾紙吸干水分,稱重,計算器官指數(shù):

器官指數(shù)(mg/g)=器官質量(mg)/小鼠體重(g)

式(2)

1.2.6 生化指標的測定 按照試劑盒測定血清和肝臟組織的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;檢測皮膚SOD、CAT、GSH-Px活性和羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。

1.2.7 組織切片觀察 取小鼠心臟和腎臟組織,置于福爾馬林中固定,再經過80%、90%、95%、100%梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片機切片,蘇木素-伊紅染色,中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠器官指數(shù)的影響

由表1可知，與空白對照組相比,模型組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著降低(p<0.05),模型組小鼠胸腺和脾臟萎縮,說明造模成功。脾臟和胸腺作為生命體重要的免疫器官,隨著生命體的衰老,胸腺和脾臟出現(xiàn)體積縮小、功能減退,生命質量下降[18-19]。與模型組相比,樹莓花色苷各劑量組胸腺和脾臟指數(shù)都有所提高,RRA-L胸腺指數(shù)提高,但差異不顯著(p>0.05),RRA-M胸腺指數(shù)極顯著提高(p<0.01),RRA-H胸腺指數(shù)顯著提高(p<0.05);RRA-L脾臟指數(shù)與模型組比較顯著提高(p<0.05),RRA-M、RRA-H脾臟指數(shù)與模型組比較極顯著提高(p<0.01)。RRA-L、RRA-M、RRA-H胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與陽性對照組相比,差異不顯著(p>0.05),說明對于胸腺和脾臟指數(shù)而言,紅樹莓花色苷延緩衰老作用與VC接近。肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)較模型組都有一定的提高,但是結果差異不顯著(p>0.05)。

表1 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of RRA on organ indexes of mice

2.2 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影響

2.3 樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力及對MDA含量的影響

根據(jù)表3,小鼠血清情況:模型組各種酶活性顯著低于空白對照組(p<0.05),MDA含量模型組顯著高于空白對照組(p<0.05)。RRA-L中SOD活性顯著高于模型組(p<0.05);RRA-M中SOD、CAT活性顯著高于模型組(p<0.05),GSH-Px活性極顯著高于模型組(p<0.01),MDA含量顯著低于模型組(p<0.05);RRA-H的SOD、GSH-Px活性極顯著高于模型組(p<0.01),MDA含量極顯著低于模型組(p<0.01)。另外,RRA-H中SOD、CAT和GSH-Px活性顯著高于陽性對照組(p<0.05),RRA-M中CAT活性和RRA-H中MDA含量與陽性對照組相比,差異不顯著(p>0.05),說明高劑量的紅樹莓花色苷對衰老小鼠保護作用良好。在以往研究中發(fā)現(xiàn):將“黑美人”土豆花色苷、黑米花色苷及黑豆花色苷[23-25]作用于衰老小鼠,結果都顯示小鼠血清及器官中SOD、GSH-Px活性顯著提高,MDA含量下降,有本實驗有著類似的結果。

表3 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的影響Table 3 Effect of RRA on the activities of SOD,CAT,GSH-Px and the content of MDA in serum of mice

2.4 樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠皮膚SOD、CAT、GSH-Px活力及對HYP含量的影響

根據(jù)表4,模型組各酶類活性顯著低于空白對照組(p<0.05),HYP是膠原纖維和膠原蛋白中主要的非必需氨基酸[26-27],是檢測機體膠原代謝的重要指標,也是評價皮膚衰老的重要指標。HYP含量可以間接反映真皮內膠原蛋白含量的變化情況。與空白對照組相比,模型組SOD、CAT、GSH-Px活性和HYP含量顯著降低(p<0.05);RRA-L中SOD、GSH-Px活性和HYP含量顯著高于模型組(p<0.05);RRA-M中SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著高于模型組(p<0.05),HYP含量極顯著高于模型組(p<0.01);RRA-H中SOD、CAT活性和HYP含量極顯著高于模型組(p<0.01),另外RRA-H中CAT、GSH-Px活性及HYP含量與陽性對照組相比,差異不顯著(p>0.05),SOD活性甚至優(yōu)于VC陽性組作用(p<0.05),說明紅樹莓花色苷對延緩皮膚衰老、增加皮膚彈性起到一定的作用。與本結論類似的研究有:黑果腺肋花楸花色苷對紫外輻射所致人皮膚成纖維細胞有保護作用[28],黑果枸杞原花青素和紫薯花色苷[29-30]都可以修復皮膚氧化損傷。另外關于植物花色苷延緩衰老的研究還有:周波[31]等利用玉米紫色色素研究對黑腹果蠅影響,發(fā)現(xiàn)其延長黑腹果蠅壽命、增加最高壽命,并提高體內SOD活性;李亞巍[32]發(fā)現(xiàn)越橘花色苷對衰老小鼠學習記憶能力有提高作用。這說明植物花色苷在預防衰老方面有很廣闊的前景,為紅樹莓資源的開發(fā)利用及消費者健康生活提供了更多的選擇。

2.5 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠心臟組織的影響

圖1a所示,正常心肌細胞數(shù)量多,排列規(guī)則,形態(tài)大小正常,細胞核呈卵圓形,核仁清晰,肌漿呈粉紅色;圖1b中模型組心肌細胞細胞明顯減少,有出血點、見輕度固縮狀細胞核,在組織中分布不均勻,有空泡;圖1c中陽性對照組心肌細胞形態(tài)接近于空白組,排列整齊,細胞數(shù)量多;圖1d、1e、1f中,低、中、高組小鼠較模型對照模型組有很大的改善,有少量出血,細胞排列混亂,心肌細胞呈短柱狀、有分叉,細胞結構清晰,細胞數(shù)量增加。結果說明紅樹莓花色苷能緩解心臟衰老,對心肌細胞氧化損傷具有預防作用。

圖1 小鼠心臟組織切片(HE,×400)Fig.1 Histopathology of heart tissues(HE,×400)注:a～c分別為:空白對照組、模型組、陽性對照組;d～f分別為:RRA-L組、RRA-M組、RRA-H組,圖2同。

2.6 紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟組織的影響

如圖2a所示,正常腎小球分布密集,圓形或橢圓形,外觀規(guī)整,腎小囊囊腔正常,腎小管管腔正常。在圖2b中模型組腎小球體積增大,分布稀少,不規(guī)整,腎小囊囊腔明顯增大,基底膜增厚,腎小管管腔增大,結構不清晰。圖2d、2e、2f各劑量組相比于模型組腎小球數(shù)量明顯增多,腎小囊囊腔有所減小,基底膜增厚不明顯。隨著劑量的增加,花色苷對于衰老損傷的腎細胞具有修復作用越來越好,本實驗說明紅樹莓花色苷對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟損傷具有抑制作用。

圖2 小鼠腎臟組織切片(HE,×400)Fig.2 Histopathology of kidney tissues(HE,×400)

3 結論

本研究通過注射D-半乳糖建立小鼠衰老模型,觀察紅樹莓花色苷對衰老的干預作用。結果表明:紅樹莓花色苷對衰老造成的胸腺和脾臟指數(shù)的下降有一定的改善作用,使衰老小鼠肝臟和血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著提高(p<0.05)、降低MDA含量(p<0.05),同時也顯著提高皮膚組織中SOD、CAT、GSH-Px活力及HYP含量(p<0.05),對改善皮膚衰老狀況起到積極的作用;通過病理切片觀察到,紅樹莓花色苷對心肌細胞氧化損傷起到緩解作用,使小鼠腎小球結構逐漸恢復接近于正常狀態(tài),結構規(guī)整、數(shù)量增加,腎小管結構清晰,說明紅樹莓花色苷對于自由基造成的衰老有一定的抑制作用。