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(吉林醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,吉林 132013)

當(dāng)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生超出機(jī)體自身的清除能力,會(huì)造成ROS大量累積,機(jī)體正常的氧化/還原平衡狀態(tài)遭到破壞,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)氧化損傷和功能紊亂,影響機(jī)體正常代謝過程,這一系列異常應(yīng)激狀態(tài)稱為氧化應(yīng)激。天然植物中抗氧化活性成分常被用作食品抗氧化劑,這類天然抗氧化劑能夠協(xié)助機(jī)體抵抗ROS引起的氧化損傷,這一過程與調(diào)節(jié)抗氧化信號(hào)通路、激活Ⅱ相解毒酶以及上調(diào)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)有關(guān)[1]。研究表明,當(dāng)細(xì)胞受到外源或內(nèi)源氧化刺激時(shí),產(chǎn)生的ROS會(huì)激活多條信號(hào)通路[2]。核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)控抗氧化應(yīng)激相關(guān)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)以二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),二者解離,Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核并與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,參與某些細(xì)胞保護(hù)性蛋白的表達(dá),如Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶類,從而保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷[3-4]。

花青素又名花色素、花色苷,是一類具有抗氧化活性的水溶性天然化合物,廣泛存在于紫色和紅色的水果與蔬菜中,具有重要的生理功能和良好的開發(fā)利用前景[5-6]?；ㄇ嗨匾蚱淞己每寡趸钚郧液控S富,常被用作功能食品原料?；ㄇ嗨氐能赵⑻擒张潴w種類較多,目前已鑒定出自然界中的花青素有550余種,蔬菜和水果中的矢車菊素占50%[7,8]。矢車菊素-3-O-葡糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,C3G)是最普遍和研究最多的花青素之一,對(duì)預(yù)防人類多種慢性病具有潛在作用[9]。矢車菊素可通過多種途徑清除自由基,并且其還原力及抗氧化能力優(yōu)于其他花青素提取物。

本研究采用過氧化氫(H2O2)體外誘導(dǎo)人胚腎293(HEK-293)細(xì)胞損傷,建立HEK-293細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,基于細(xì)胞活力水平、ROS、丙二醛(MDA)水平考察C3G對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胚腎(HEK-293)細(xì)胞 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;矢車菊素-3-O-葡糖苷(≥ 98%) 中國藥品生物制品檢定所;DCFH-DA熒光染料 美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、FBS胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素 美國Gibco公司;MTS試劑盒、PCR試劑盒 美國Promega公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR染料 日本Takara公司;MDA、SOD、CAT、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所;抗體KEAP1、NFE2L2、GAPDH、二抗 武漢博士德生物工程有限公司。

Synergy HT多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司;MiniBIS Pro凝膠成像系統(tǒng) 以色列DNR公司;SDS-PAGE電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、PCR儀 美國Bio-Rad公司;HF90二氧化碳培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司;FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10% FBS,1%青霉素-鏈霉素和1%非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞,細(xì)胞接種后在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 C3G對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷細(xì)胞活力的影響 試驗(yàn)設(shè)三個(gè)組(6個(gè)平行/組),分別為對(duì)照組、H2O2損傷組和C3G保護(hù)組。接種細(xì)胞懸液密度為6.0×104個(gè)/mL,80 μL/孔,培養(yǎng)24 h;保護(hù)組加10 μL 1.25、5、20 μmol/L的C3G(終濃度),對(duì)照組和損傷組補(bǔ)充10 μL DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h;損傷組和保護(hù)組加入H2O210 μL/孔(終濃度0.4 mmol/L),對(duì)照組補(bǔ)充10 μL DMEM培養(yǎng)基,孵育6 h后檢測(cè)OD值,計(jì)算細(xì)胞活力[11]。

1.2.4 MTS法測(cè)定細(xì)胞活力 按1.2.2、1.2.3方法孵育完成的細(xì)胞置于96孔板中，每孔加入20 μL MTS[11],在37 ℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)1 h,采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(OD)值。以對(duì)照組為100%,計(jì)算公式如下:

細(xì)胞活力(%)=(A損傷組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100

1.2.5 細(xì)胞ROS測(cè)定 試驗(yàn)分組同1.2.4(24孔板,3個(gè)平行/組),細(xì)胞接種密度為5.0×104個(gè)/孔,H2O2孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基,清洗2次,加入含有10 μmol/L DCFH-DA的空白培養(yǎng)基37 ℃孵育20 min,PBS清洗3次后置于激光掃描共聚焦顯微鏡下收集熒光圖像,酶標(biāo)儀讀取熒光值,激發(fā)/發(fā)射波長488/525 nm[12]。以對(duì)照組為1按如下公式計(jì)算相對(duì)ROS含量：

相對(duì)ROS含量=(F損傷組/保護(hù)組-F空白組)/(F對(duì)照組-F空白組)

1.2.6 細(xì)胞MDA水平測(cè)定 試驗(yàn)分組同1.2.4(3個(gè)平行/組)，細(xì)胞以1.0×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板，H2O2孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，各孔加入500 μL含有PMSF的裂解液冰浴裂解10 min，收集裂解液4 ℃下1000 r/min 離心5 min，收集上清液，根據(jù)試劑盒測(cè)定各組蛋白和MDA含量。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞Nrf2和Keap1的蛋白表達(dá) 細(xì)胞懸液接種密度5×106個(gè)/10 cm培養(yǎng)皿,接種體積8 mL/培養(yǎng)皿,分組與加樣操作同1.2.4(加樣體積1 mL),PBS稀釋至2 mg/mL,加入loading buffer和DTT于沸水浴加熱5 min,上樣量20 μg/孔,12% SDS-PAGE膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;1∶1000比例稀釋一抗,4 ℃孵育過夜,TBST清洗后以1∶4000比例稀釋二抗,室溫孵育1 h[11];TBST清洗后ECL顯色,成像系統(tǒng)采集Nrf2,Keap1和GAPDH的蛋白圖像,采用密度分析軟件Image J對(duì)蛋白條帶圖像進(jìn)行定量分析。

1.2.8 qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞Nrf2和Keap1的mRNA表達(dá) Trizol提取總RNA,測(cè)定RNA和DNA含量,將RNA含量調(diào)整一致,試劑盒去除DNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行基因擴(kuò)增,反應(yīng)條件[13]:95 ℃、3 min,95 ℃、15 s(40 cycles),51.6 ℃(Nrf2)或58 ℃(Keap1)、20 s,72 ℃、30 s;在NCBI上下載Nrf2、Keap1和GAPDH全序列,采用DNAMAN找出基因片段,Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物,Nrf2引物序列(F:3′-GACTCTACCACTGTTCCCAA-5′,R:3′-CCATTC TTATTTCACCGACG-5′);Keap1引物序列(F:3′-TTCAAGCCGCAGTTGCTCA-5′,(R:3′-TTAGTCA CCAGCGGGACG-5′);GAPDH引物序列(F:3′-CCTTCTACCACTACCCTA-5′,R:3′-TTTGACAC CGCACTACC-5′)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;通過One Way ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定各組間的差異顯著性,分析結(jié)果概率值小于0.05被認(rèn)為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(不同字母表示p<0.05);SPSS 21.0軟件用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 C3G對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷細(xì)胞活力的影響

HEK-293細(xì)胞是一種永生化的正常細(xì)胞,與癌細(xì)胞相比其具有更接近體內(nèi)正常細(xì)胞的生理特性,能夠真實(shí)反映氧化應(yīng)激狀態(tài)。H2O2是一種穩(wěn)定的自由基來源,是建立氧化應(yīng)激模型常用的誘導(dǎo)劑之一[14]。外源性H2O2可以穿過細(xì)胞膜,引起ROS的產(chǎn)生和積累,并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)金屬離子,造成DNA和線粒體損傷,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。如圖1所示,0.4 mmol/L H2O2處理后細(xì)胞活力下降為53.8%±3.4%。與H2O2損傷組相比,1.25～20 μmol/L C3G保護(hù)組的細(xì)胞活力顯著增加(p<0.05),分別提高到63.2%±2.5%、69.4%±3.8%、77.2%±5.1%。結(jié)果表明1.25～20 μmol/L C3G孵育后能明顯提高氧化應(yīng)激細(xì)胞活力,呈濃度依賴效應(yīng),C3G能抑制H2O2誘導(dǎo)的HEK-293細(xì)胞氧化損傷,對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。相關(guān)研究表明,矢車菊素能抵抗過氧化氫自由基[16],Lee等[17]也通過H2O2誘導(dǎo)胰腺β-細(xì)胞氧化損傷,并且考察了C3G對(duì)氧化損傷細(xì)胞活力影響,結(jié)果表明C3G提高了損傷細(xì)胞的細(xì)胞活力,說明C3G對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺β-細(xì)胞具有保護(hù)作用,這與本試驗(yàn)結(jié)果是一致的。

圖1 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.1 Protective effect of C3G on HEK-293 Cells注:圖中標(biāo)注的不同字母表示組間差異顯著,p<0.05,圖2～圖5同。

2.2 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞ROS水平的影響

ROS如過氧化物、過氧化氫、羥基自由基等,能夠損傷核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及其它生物大分子。細(xì)胞調(diào)控ROS水平的能力能夠反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài),ROS產(chǎn)生和消除的不平衡導(dǎo)致ROS大量累積,是導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激的一個(gè)重要因素。如圖2A所示,對(duì)照組的綠色熒光強(qiáng)度較弱,說明對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平比較穩(wěn)定,氧化還原處于平衡狀態(tài);而經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷組其熒光強(qiáng)度增強(qiáng);與H2O2損傷組相比,不同濃度C3G預(yù)處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸減弱。由圖2B可知,H2O2損傷組ROS相對(duì)量顯著提高,增加到近2倍(p<0.05),經(jīng)過C3G預(yù)處理的細(xì)胞ROS相對(duì)含量隨濃度增大呈依賴性降低(p<0.05),但均高于對(duì)照組,可見C3G預(yù)處理可以顯著抑制由H2O2引起的ROS產(chǎn)生和累積,但無法使細(xì)胞恢復(fù)到未損傷前的正常狀態(tài)。相關(guān)研究表明花青素提取物能清除過量產(chǎn)生的ROS自由基，從而減輕由氨基甲酸乙酯誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞毒性作用[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),C3G預(yù)處理H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞后,其ROS水平呈濃度依賴性降低,說明H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基,ROS大量累積,C3G預(yù)處理后ROS相對(duì)含量顯著降低,這與Lee等[17]關(guān)于C3G能清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的試驗(yàn)結(jié)果是一致的,說明C3G可以通過抑制ROS產(chǎn)生和累積從而抑制HEK-293細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。還有類似研究表明,C3G通過靶向ROS,減輕棕櫚酸引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,從而可以預(yù)防由氧化應(yīng)激引起的幾種疾病[19]。這些研究都說明了C3G抑制HEK-293細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的部分作用機(jī)制是通過清除/抑制細(xì)胞ROS而實(shí)現(xiàn)的。

圖2 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞ROS水平的影響Fig.2 Effects of C3G on the generation of ROS in HEK-293 cells.注:A:激光共聚焦顯微鏡采集的DCF熒光圖像;B:由DCFH-DA熒光探針計(jì)算出的ROS相對(duì)含量。

2.3 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞MDA水平的影響

細(xì)胞的MDA水平可以用來評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化損傷情況。一些體外研究表明花青素發(fā)揮抗氧化作用不僅依賴于清除自由基,而且與激活和改善細(xì)胞內(nèi)生抗氧化系統(tǒng)有關(guān)[20]。如圖3所示,對(duì)照組MDA水平較低,約為(4.8±0.3) nmol/mg protein,說明正常細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)比較穩(wěn)定,脂質(zhì)過氧化程度很低,但H2O2處理后MDA水平顯著提高到(16.6±1.0) nmol/mg protein(p<0.05),與此相比，不同濃度C3G預(yù)處理后細(xì)胞MDA水平顯著降低(p<0.05),并隨C3G濃度增大而呈濃度依賴性降低(13.6～8.7 nmol/mg protein)。有研究表明桑葚中提取的C3G能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[17],同樣的,本研究發(fā)現(xiàn)C3G預(yù)處理后細(xì)胞MDA水平呈濃度依賴性降低,說明C3G能顯著降低過氧化氫自由基誘導(dǎo)的MDA升高,通過抑制細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生和累積從而改善細(xì)胞氧化損傷。相關(guān)研究也同樣證明了C3G能夠通過降低MDA水平來保護(hù)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激[13,19,21]。

圖3 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞丙二醛(MDA)水平的影響Fig.3 Effects of C3G on MDA level in HEK-293 Cells

2.4 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞Nrf2/Keap 1通路的調(diào)節(jié)作用

食物中的外源抗氧化物質(zhì)能抑制或減輕ROS引起的氧化損傷,在維持體內(nèi)的氧化還原平衡中發(fā)揮顯著作用,目前,以信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗氧化應(yīng)激研究是其機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。如圖4A和4B所示,H2O2損傷組Nrf2的mRNA表達(dá)量大于對(duì)照組,但結(jié)果不顯著(p>0.05),而蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(p<0.05);1.25～20 μmol/L C3G處理后,Nrf2的mRNA表達(dá)量顯著增大(p<0.05),并且呈濃度依賴性升高,同樣,蛋白表達(dá)量也呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性升高趨勢(shì)。

圖4 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響Fig.4 Effects of C3G on protein and mRNA expressions of Nrf2 in HEK-293 Cells

如圖5A和5B所示,與對(duì)照組相比,H2O2損傷組Keap1的mRNA表達(dá)量略有降低,結(jié)果并不顯著(p>0.05),H2O2損傷組Keap1的蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(p<0.05);1.25 μmol/L C3G處理后,Keap1的mRNA表達(dá)量下調(diào)不明顯,5和20 μmol/L C3G處理后,Keap1的mRNA表達(dá)量顯著低于H2O2損傷組(p<0.05),1.25～20 μmol/L C3G預(yù)處理后Keap1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著下調(diào),但1.25與5 μmol/L組間的mRNA和蛋白表達(dá)量差異均不顯著(p<0.05)。有研究表明某些多酚類化合物和黃酮類化合物也可能激活一些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,如Nrf2通路,調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)和活性,以延長細(xì)胞防御反應(yīng)[22-24]。通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),C3G呈濃度依賴性地上調(diào)HEK-293細(xì)胞中Nrf2的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá),說明C3G可能是通過促進(jìn)Nrf2表達(dá)從而提高抗氧化酶類的活力,進(jìn)而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。Speciale等[13]的體外試驗(yàn)同樣表明,C3G能通過激活Nrf2通路來保護(hù)人體內(nèi)皮細(xì)胞,從而激活抗氧化和解毒酶,對(duì)抗氧化應(yīng)激。此外,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C3G可以濃度依賴性地下調(diào)Keap1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá),說明C3G可能通過下調(diào)Keap1表達(dá)促進(jìn)Nrf2與Keap1解離,使更多釋放的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合啟動(dòng)抗氧化相關(guān)基因表達(dá),從而抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。相關(guān)研究還表明,桑葚花青素提取物有助于恢復(fù)HepG2細(xì)胞的氧化還原狀態(tài),通過靶向MAPKs和Nrf2通路減輕過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[22],其部分作用機(jī)制與本試驗(yàn)結(jié)果是一致的。

圖5 C3G對(duì)HEK-293細(xì)胞Keap1表達(dá)的影響Fig.5 Effects of C3G on protein and mRNA expressions of Keap1 in HEK-293 Cells

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷具有細(xì)胞保護(hù)作用,并且其保護(hù)作用與促增殖無關(guān),C3G可通過降低ROS和MDA水平抑制HEK-293細(xì)胞氧化損傷,其可能是通過激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路、調(diào)節(jié)抗氧化相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)的抗氧化應(yīng)激作用。氧化應(yīng)激是一個(gè)涉及多條信號(hào)通路及相關(guān)蛋白的復(fù)雜病理過程,所以除Nrf2/Keap1以外,是否還有其它通路參與了C3G抑制氧化應(yīng)激過程還需進(jìn)一步研究。本研究為C3G的抗氧化活性研究提供了一定參考,為植物源性食品的應(yīng)用提供了一些理論依據(jù)。