(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院,福建漳州 363000)

黃槿(Hibiscustiliaceus)又名糕仔樹(shù)、海麻桐、木麻、黃木槿和桐花等，為錦葵科木槿屬植物[1]。黃槿耐堿、耐熱、耐瘠、耐旱、抗風(fēng)、萌芽強(qiáng)、易移植,主要生長(zhǎng)于我國(guó)的廣東、福建、臺(tái)灣、海南和廣西等沿海省區(qū)的沿海岸或潮水能到達(dá)的河岸上[2-3]。黃槿葉是一種潛在的食用和藥用植物,逐漸受到了人們的關(guān)注,張小坡等[4]采用柱色譜對(duì)黃槿枝葉70%乙醇提取物進(jìn)行了分離,得到14個(gè)化合物,李曉菲等[5]利用氣-質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)黃槿葉片的揮發(fā)油和脂肪酸進(jìn)行了測(cè)定,得到酚類(lèi)、醛酮類(lèi)、醇類(lèi)等54種化合物。黃酮是一種廣泛存在于植物體中含有C6-C3-C6基本骨架的一類(lèi)天然高分子化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂、治療心腦血管疾病等多種生理與保健功能[6]。迄今為止,尚未有對(duì)黃槿葉總黃酮的提取工藝及活性的系統(tǒng)研究。本文以漳州產(chǎn)黃槿葉為原料,研究了黃槿葉的超聲波輔助提取工藝,并對(duì)總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除作用進(jìn)行了探討,以期為漳州黃槿葉資源的開(kāi)發(fā)與利用提供可行性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃槿葉 采于漳州市九湖公園;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 上海滬宇生物試劑公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ-100DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-7504型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取 用蒸餾水將采摘的黃槿葉洗凈,在25 ℃的室溫下晾干,后于50 ℃的干燥箱中干燥至恒重,用粉碎機(jī)粉碎,篩選60～80目的粉末備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g的備用的黃槿葉粉末,裝入100 mL的圓底燒瓶中,加入一定體積和一定濃度的乙醇并搖勻,后置于超聲波清洗器中,在一定的溫度下,超聲提取一定的時(shí)間,提取結(jié)束后,定容至50 mL。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7],在波長(zhǎng)510 nm下繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并線(xiàn)性回歸得方程y=7.6142x+0.0003,R2=0.9998。取在不同條件下所得的提取液進(jìn)行顯色并測(cè)試,代入回歸方程,求出黃槿葉總黃酮的得率。

式中:b為黃槿葉總黃酮質(zhì)量濃度,mg/L;V為提取液體積,L；m為稱(chēng)取的黃槿葉質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響 以超聲時(shí)間30 min、乙醇濃度60%(v/v,下同)和液料比30∶1 mL/g為固定水平,分別考察超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃時(shí)對(duì)黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 以超聲溫度70 ℃、乙醇濃度60%和液料比30∶1 mL/g為固定水平,分別考察超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min時(shí)對(duì)黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.3.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 以超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間30 min和液料比30∶1 mL/g為固定水平,分別考察乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%時(shí)對(duì)黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.3.4 液料比對(duì)總黃酮得率的影響 以超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間30 min和乙醇濃度60%為固定水平,分別考察液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g時(shí)對(duì)黃槿葉總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)影響黃槿葉總黃酮得率的超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)四因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素編碼與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface methodology

1.2.5 總黃酮對(duì)亞硝酸鹽清除率的測(cè)定 分別在25 mL的具塞比色管中配制0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/L的黃槿葉總黃酮溶液,分別加入10.0 mL pH為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1.0 mL 50 g/mL的NaNO2溶液,并置于37 ℃的水浴鍋中保溫1 h,保溫結(jié)束后,加入2.0 mL 0.4%(w/v)的對(duì)氨基苯磺酸,靜置5 min,再加入1.0 mL 0.2%(w/v)的鹽酸萘乙二胺,定容至25 mL,靜置15 min,在540 nm處測(cè)得吸光度A,黃槿葉總黃酮溶液濃度為0時(shí)的吸光度為A0,并以VC為對(duì)照,分別計(jì)算亞硝酸鹽的清除率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel 2003、Origin 7.5和Design-Expert 8.05b進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響 由圖1可知,當(dāng)超聲溫度在40～70 ℃時(shí),隨著溫度升高,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)闇囟壬?加快了溶劑與黃槿葉黃酮分子之間的溶解與滲透能力,使得總黃酮得率增大;但當(dāng)超聲溫度大于70 ℃時(shí),過(guò)高的超聲溫度會(huì)破壞部分不穩(wěn)定的黃酮分子結(jié)構(gòu)[8],造成得率降低。因此超聲溫度選擇為70 ℃。

圖1 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on yield of total flavonoids

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 由圖2可知,當(dāng)超聲時(shí)間為10～30 min時(shí),隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng),總黃酮得率也增大,這是因?yàn)槌晻r(shí)間的延長(zhǎng),黃槿葉總黃酮能夠更充分地溶出,使得得率增大;但當(dāng)超聲時(shí)間大于30 min時(shí),過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間作用下,黃槿葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損,胞內(nèi)其它雜質(zhì)溶出,并與黃酮產(chǎn)生溶出競(jìng)爭(zhēng)[9],使得得率下降。因此超聲時(shí)間選擇為30 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 由圖3可知,當(dāng)乙醇濃度在40%～60%時(shí),隨著乙醇濃度增大,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)橐掖紳舛鹊脑龃?溶劑的極性降低,使得溶劑極性與黃槿葉總黃酮的極性更加接近,促進(jìn)了黃槿葉總黃酮在溶劑中的溶解,使得得率增大;但當(dāng)乙醇濃度過(guò)大時(shí),極性較小的一些醇溶性雜質(zhì)會(huì)與黃酮產(chǎn)生溶出競(jìng)爭(zhēng)[10],導(dǎo)致了總黃酮得率的下降。因此乙醇濃度選擇為60%。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

2.1.4 液料比對(duì)總黃酮得率的影響 由圖4可知,當(dāng)液料比在10∶1～30∶1 mL/g時(shí),隨著液料比增大,總黃酮得率也增大,這是因?yàn)橐毫媳鹊脑龃?增加了黃槿葉總黃酮的絕對(duì)溶解能力,使得得率增大;但當(dāng)液料比過(guò)大時(shí),黃槿葉顆粒內(nèi)其他非黃酮類(lèi)成分溶出量增大[11],導(dǎo)致了總黃酮得率的下降。因此液料比選擇為30∶1 mL/g。

圖4 液料比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on yield of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型與方差分析 以黃槿葉總黃酮得率為響應(yīng)值,應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)為影響因素,得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2,超聲波輔助提取黃槿葉總黃酮得率數(shù)據(jù)模型的方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.2.2 模型的建立與分析 利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到以超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)為工藝參數(shù),黃槿葉總黃酮得率為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)式回歸方程:

Y=37.61+3.0A-0.46B-1.50C-1.18D-0.71AB-0.23AC+0.075AD-0.23BC-0.54BD+2.64CD-3.97A2-6.18B2-4.75C2-6.02D2

根據(jù)表3的響應(yīng)面方差分析可知,該回歸模型p<0.0001,說(shuō)明該模型達(dá)到了極顯著水平;失擬項(xiàng)p=0.1241>0.05,不顯著,說(shuō)明該模型的可信度較高,擬合度好。模型的決定系數(shù)R2=0.9181,說(shuō)明該模型可靠,有91.81%的實(shí)驗(yàn)值可以利用預(yù)測(cè)值來(lái)描述。由方差F值及p值可知,影響黃槿葉總黃酮得率的因素中,其主次順序?yàn)槌暅囟?A)>乙醇濃度(C)>液料比(D)>超聲時(shí)間(B),其中超聲溫度的一次項(xiàng)A,超聲溫度的二次項(xiàng)A2、超聲時(shí)間的二次項(xiàng)B2、乙醇濃度的二次項(xiàng)C2和液料比的二次項(xiàng)D2對(duì)總黃酮得率影響極顯著(p<0.01);乙醇濃度的一次項(xiàng)C、乙醇濃度與液料比的二次交互項(xiàng)CD對(duì)總黃酮得率影響顯著(p<0.05);其他項(xiàng)對(duì)總黃酮得率影響不顯著(p>0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖可以直觀(guān)地反映出黃槿葉總黃酮得率與所考察的超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)和液料比(D)四因素中兩兩交互作用之間的關(guān)系。利用Design-Expert 8.05b軟件繪制的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of interactive of various factors on yield of total flavonoids注:(A,a):超聲時(shí)間和超聲溫度;(B,b):超聲溫度和乙醇濃度;(C,c):超聲溫度和液料比;(D,d):超聲時(shí)間和乙醇濃度;(E:e):超聲時(shí)間和和液料比;(F,f):乙醇濃度和和液料比。

由圖5(A,a)可知,超聲溫度和超聲時(shí)間的二次交互項(xiàng)AB對(duì)總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲溫度的升高和超聲時(shí)間的延長(zhǎng)均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖5(B,b)可知,超聲溫度和乙醇濃度的二次交互項(xiàng)AC對(duì)總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲溫度的升高和乙醇濃度的增加均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖5(C,c)可知,超聲溫度和液料比的二次交互項(xiàng)AD對(duì)總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲溫度的升高和液料比的增加均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖5(D,d)可知,超聲時(shí)間和乙醇濃度二次交互項(xiàng)BC對(duì)總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和乙醇濃度的增大均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖5(E,e)可知,超聲時(shí)間和液料比二次交互項(xiàng)BD對(duì)總黃酮得率的影響不顯著,總黃酮得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和液料比的增大均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。由圖5(F,f)可知,乙醇濃度和液料比的二次交互項(xiàng)CD對(duì)總黃酮得率的影響顯著,當(dāng)乙醇濃度料小時(shí),液料比對(duì)總黃酮得率的影響較大,最初隨著乙醇濃度的增加,總黃酮得率迅速增大,而后隨著乙醇濃度的增加反而又開(kāi)始下降。

2.2.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面方程進(jìn)行分析得到黃槿葉總黃酮的最佳提取工藝為:超聲溫度73.87 ℃,超聲時(shí)間29.50 min,乙醇濃度57.96%,液料比28.62∶1 mL/g,預(yù)測(cè)的總黃酮得率為38.43 mg/g。為了方便對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證,將優(yōu)化條件修正為超聲溫度74 ℃,超聲時(shí)間29 min,乙醇濃度58%,液料比29∶1 mL/g,并進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得到黃槿葉總黃酮的得率為38.15 mg/g,與預(yù)測(cè)的相對(duì)誤差為0.73%,說(shuō)明該回歸方程對(duì)黃槿葉總黃酮得率的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高,可靠性強(qiáng),可推廣到實(shí)際生產(chǎn)中。

2.3 黃槿葉總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除能力

由圖6可知,在0.2～3.0 mg/L范圍內(nèi),隨著濃度的增加,黃槿葉總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除率逐漸增加,其IC50為1.87 mg/L,當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時(shí),清除率達(dá)到69.58%,說(shuō)明黃槿葉總黃酮與亞硝酸鹽的清除率之間存在量效關(guān)系,黃槿葉總黃酮具有較好的亞硝酸鹽清除能力,但效果弱于VC。

圖6 總黃酮和VC對(duì)亞硝酸鹽的清除率Fig.6 Nitrite scavenging rates of total flavonoids and VC

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響黃槿葉總黃酮得率的因素進(jìn)行了分析,確定了合適的提取條件,結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助黃槿葉總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明,影響黃槿葉總黃酮得率的各因素主次順序?yàn)槌暅囟?乙醇濃度>液料比>超聲時(shí)間,最佳提取工藝條件為:超聲溫度74 ℃,超聲時(shí)間29 min,乙醇濃度58%,液料比29∶1 mL/g,在此條件下黃槿葉總

黃酮的得率為38.15 mg/g,與預(yù)測(cè)的相對(duì)誤差為0.73%,說(shuō)明該回歸方程對(duì)黃槿葉總黃酮得率的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高,可靠性強(qiáng),且得到的黃槿葉總黃酮對(duì)具有較好的亞硝酸鹽清除能力。