李繼紅，王小莉，霍吉爾，吳秀明

(1.吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000；2.張家界市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 張家界 427000)

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)學“藏象學說”中的重要理論，認為肺與大腸通過經(jīng)脈的互為絡(luò)屬而構(gòu)成表里關(guān)系，在功能上相互聯(lián)系，在病變上揭示了人體臟腑之間相互影響、相互作用的關(guān)系[1-2].支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為主要特征并反復(fù)發(fā)作的呼吸道常見疾病.近年來，腸道功能與哮喘的相互關(guān)系研究很受關(guān)注[3-4].中醫(yī)學理論認為，哮喘可因肺失肅降和氣機潴滯而影響大腸的傳導功能，導致腑氣不通.另外,腸腑滯實，以致濁氣不降而上逆，進而影響肺的肅降功能，加重哮喘發(fā)病[5].研究表明，腸道細菌不同類群的構(gòu)成與嬰幼兒的過敏易感性增強和哮喘發(fā)生有關(guān)[6-7]，提示哮喘發(fā)病與腸道功能存在相互影響、相互作用的關(guān)系，但探究肺與腸道之間共同粘膜免疫物質(zhì)聯(lián)系的研究較少，哮喘發(fā)病時肺與大腸相關(guān)性的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，具體發(fā)病機制仍不明確.筆者以大承氣湯通腸利肺作用為切入點，在大承氣湯方藥干預(yù)下，觀察哮喘及肺腸合病大鼠動物模型肺與大腸之間共同免疫物質(zhì)TH17/Treg的變化，從而探討“肺與大腸相表里”的免疫機制.

1 材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠75只，SPF級，體質(zhì)量(180±20)g.購自成都達碩生物科技有限公司，物合格證號：scxk(m)2008-15.

1.2 藥物及試劑

1%卵清蛋白(OVA，Sigma產(chǎn)品)；氫氧化鋁(成都市科龍化工試劑廠，批號20080807)；復(fù)方地芬諾酯片(焦作市博愛藥業(yè)有限公司，批號09033001).

1.3 儀器及設(shè)備

稱重天平(ACS-3C型，廣州中山市新和基科技開發(fā)有限公司)；超聲霧化器(WH-203型，廣州粵華醫(yī)療器械有限公司).

2 方法

2.1 建立哮喘組/肺腸合病組/大承氣湯干預(yù)組哮喘動物模型

將75只大鼠隨機分為對照組(A)、哮喘組(B)、肺腸合病組(過敏性哮喘合便秘) (C)、大承氣湯哮喘干預(yù)組(哮喘干預(yù)組)(D)與大承氣湯肺腸合病干預(yù)組(肺腸合病干預(yù)組)(E)5組，每組大鼠15只.

(1)哮喘組.將1 mg OVA和200 mg氫氧化鋁溶于1 mL生理鹽水中,配制成新鮮的凝膠致敏劑,分別于第1天和第7天在大鼠雙側(cè)胸部及腹股溝4點皮下注射各0.15 mL,同時腹腔注射0.4 mL,共計1 mL進行致敏. 第14天開始將大鼠置于有機玻璃盒內(nèi),超聲霧化吸入1% OVA誘發(fā)哮喘,每天1次,每次30 min,共計1周,以大鼠出現(xiàn)煩躁、打噴嚏、咳嗽、腹肌強烈收縮、呼吸急促等典型哮喘樣發(fā)作癥狀為標準.對照組給予生理鹽水.

(2)肺腸合病組.灌胃給予復(fù)方地芬諾酯(劑量10 mg/kg),隔天1次.同樣,第1天和第7天注射上述致敏劑,第14天開始霧化,具體方法同哮喘組.以糞便干燥、粒形縮短、排出費力，日排出量低于正常參考值范圍(4.28～11.18 g) 為診斷大鼠便秘的標準[8].

(3)大承氣湯哮喘干預(yù)組(哮喘干預(yù)組)：15只大鼠同哮喘組處理，大鼠每次激發(fā)前30 min以大承氣湯灌胃，連續(xù)7天.

(4)大承氣湯肺腸合病干預(yù)組(肺腸合病干預(yù)組)：15只大鼠同肺腸合病組處理，大鼠每次激發(fā)前30 min以大承氣湯灌胃，連續(xù)7天.

2.2 觀察各組大鼠及其體內(nèi)Th17/Treg免疫失衡狀態(tài)

用免疫磁珠法分別提取大鼠外周血淋巴細胞，CD4+CD25+Foxp3+標記Treg細胞，CD4+抗IL-17A +標記Th17細胞，用流式細胞術(shù)測定2種細胞的數(shù)量與比例.用ELISA法檢測外周血清中 IL-17,IL-6,IL-2的水平.

3 結(jié)果

3.1 各組肺組織的病理切片(HE)染色

正常對照組氣道結(jié)構(gòu)清晰，氣道內(nèi)未見粘液分布及粘液栓形成；氣道纖毛上皮排列整齊，粘膜皺襞無水腫，無明顯的炎癥及膠原纖維沉積.哮喘組及肺腸合病組大鼠支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤；肺間質(zhì)及肺泡中可見中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞浸潤；氣道上皮損傷，結(jié)構(gòu)紊亂，氣道內(nèi)杯狀細胞肥大增生；氣道內(nèi)分泌大量粘液，粘液栓形成，粘膜下膠原纖維沉積，氣道平滑肌細胞增生.大承氣湯干預(yù)后，哮喘干預(yù)組與肺腸合病干預(yù)組大鼠氣管及血管周圍炎性細胞浸潤程度明顯減輕，氣道內(nèi)分泌物減少，粘膜下膠原纖維沉積與氣道平滑肌細胞增生減輕.

圖1 大鼠肺組織的病理切片(HE)染色Fig. 1 Pathological Section of Rat Lung Tissue (HE) Staining

3.2 Th17/Treg亞群分布測定

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2所示.由圖2可知：與對照組(A)比較，哮喘組(B)及肺腸合病組(C)大鼠外周血淋巴細胞中Th17細胞比例升高，Treg細胞比例降低，且肺腸合病組(C)大鼠更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).在大承氣湯干預(yù)下，哮喘干預(yù)組(D)與肺腸合病干預(yù)組(E)Th17細胞比例降低，Treg細胞比例升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

圖2 大鼠外周血淋巴細胞中Th17細胞比例與Treg細胞比例Fig. 2 Proportion of Th17/Treg in Lymphocytes of Rat Serum

3.3 外周血清中 IL-17,IL-6,IL-2水平

實驗結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：與對照組(A)及大承氣湯組干預(yù)(D，E)比較，哮喘組(B)及肺腸合病組(C)大鼠血清中IL-6,IL-17水平升高，IL-2水平降低；肺腸合病組(C)大鼠血清中IL-6，IL-17水平升高，IL-2水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).與哮喘組(B)及肺腸合病組(C)比較，哮喘干預(yù)組(D)與肺腸合病干預(yù)組(E)血清中IL-6，IL-17水平下降,IL-2水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).

圖3 大鼠血清中IL-17，IL-6，IL-2水平Fig. 3 Levels of IL-17, IL-6, and IL-2 in Rat Peripheral Blood

4 討論

Th17/Treg 細胞失衡是哮喘發(fā)病的重要原因，也是目前研究的熱點[9-10].Th17細胞及IL-17與哮喘關(guān)系密切,哮喘患者的血清、肺泡灌洗液及支氣管活檢免疫組化均表明IL-17和(或)IL-17 mRNA增加,并且與患者氣道高反應(yīng)性的嚴重程度相關(guān)[11].在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)，與哮喘組大鼠相比較，肺腸合病組大鼠支氣管肺組織中炎癥細胞浸潤明顯，外周血中Th17細胞升高比例與Treg細胞降低比例較哮喘組更明顯.血清IL-17，IL-6水平明顯增加，提示在哮喘發(fā)病，尤其是當腸道菌群及其功能變化導致腸道的微生態(tài)及其免疫變化時,大量的細菌穿過腸道粘膜，進一步激發(fā)T細胞，T17和Treg的分化失衡，免疫反應(yīng)向呼吸道粘膜等部位遷移,在粘膜淋巴細胞的“歸巢”作用下，呼吸道產(chǎn)生強而廣泛的粘膜免疫應(yīng)答，誘發(fā)機體免疫紊亂，使得支氣管哮喘的炎癥反應(yīng)得以發(fā)生、發(fā)展以致加重.

筆者認為，肺腸合治需調(diào)節(jié)肺腸氣機的升降平衡，大承氣湯可宣發(fā)肺之肅降，承順大腸腑之氣.現(xiàn)代藥理研究認為大承氣湯具有顯著的抗炎、抗菌、解熱、抗氧化、提高機體免疫力，抑制內(nèi)毒素產(chǎn)生致炎因子，通腑保肺等作用.本實驗中，在大承氣湯干預(yù)下，哮喘干預(yù)組和肺腸合病干預(yù)組Th17細胞比例明顯降低，Treg細胞比例升高，IL-6，IL-17水平下降，IL-2水平升高，提示大承氣湯通過調(diào)節(jié)哮喘發(fā)病中的TH17/Treg平衡來調(diào)節(jié)各種細胞因子，控制體內(nèi)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)肺腸氣機的升降平衡，宣肺(升清)通腑(降濁)，升降臟腑氣機的出入，以順應(yīng)肺主宣發(fā)肅降，促邪外出，調(diào)整肺腸氣機清濁升降逆亂，使痰飲積滯得以降泄，從而有利于恢復(fù)肺之宣肅功能，是治療哮喘發(fā)作的一種有效方法.

筆者以大承氣湯通腸利肺作用為切入點，研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)病可影響腸道TH17/Treg的變化，腸道功能紊亂也可反過來影響到哮喘發(fā)病，大承氣湯通過調(diào)節(jié)TH17/Treg的免疫作用，提高黏膜屏障功能，降低淋巴細胞的“歸巢”作用，減輕哮喘發(fā)病.總而言之，本研究結(jié)論可為肺腸合病相關(guān)理論的分子機制研究提供了一條可行的途徑，為哮喘的整體治療提供實驗依據(jù).