陳煒瑤,王 華,林冬杰

(梧州市食品藥品檢驗(yàn)所,廣西 梧州 543002)

0 引言

T-2毒素屬于A類單端孢霉烯族毒素,是單端孢霉烯族毒素中毒性最強(qiáng)的毒素之一.T-2毒素?fù)p害肝、皮膚、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等,能夠使動物亞中毒甚至致死.[1]中藥材陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮,采摘成熟果實(shí),剝?nèi)」?曬干或低溫干燥而得.[2]陳皮在炮制及儲存過程中容易產(chǎn)生真菌毒素,《中國藥典》中就有對陳皮中黃曲霉毒素的限度要求,[2]但未有T-2毒素的檢測方法及限度要求,因此建立陳皮中T-2毒素的檢測方法十分有必要,經(jīng)查閱文獻(xiàn),食品中T-2毒素的檢查方法主要有免疫親和層析凈化液相色譜法、ELISA法等,[3]以上方法中ELISA法需要酶標(biāo)儀等設(shè)備及相應(yīng)試劑盒,存在重復(fù)性差、假陽性率高等缺點(diǎn),高效液相色譜法需要衍生等步驟,檢測結(jié)果受到影響的因素較多,經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)未見有用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測陳皮中T-2毒素的報(bào)道,該方法采液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測陳皮中的T-2毒素,方法簡便、結(jié)果重現(xiàn)性好,能準(zhǔn)確檢測陳皮中T-2毒素的殘留量.

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent1290-QQQ6490(美國),GR-202電子分析天平(日本).

1.2 試藥

T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品(來源：FERMENTEK公司,批號：110728-200506);乙腈為色譜純(天津歐姆尼基因科技有限公司);甲酸為分析純(廣東光華科技股份有限公司公司);PSA(德國CNW公司生產(chǎn)).

陳皮三批：市售飲片,產(chǎn)地：廣西,批號：20180102、180307、18122807.

試驗(yàn)所用陳皮所有批號樣品均經(jīng)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定,為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮.

2 方法

2.1 UPLC測定法色譜條件

色譜柱：UltraCore 2.5 C18 2.1×75 mm;流動相A為乙腈、流動相B為0.1%甲酸溶液,初始比例為(10∶90),使用梯度洗脫,梯度洗脫程序詳見表1,柱溫：35℃,流速：0.3 m L.min-1;進(jìn)樣量：2μL.

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution process

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源;正離子模式掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集;干燥氣溫度：150℃;干燥氣流速：18 L.min-1;霧化氣壓力：25 psi;鞘氣溫度：350℃;鞘氣流速：12 L.min-1;碎裂電壓：380 V;毛細(xì)管電壓：3500 V.T-2毒素保留時(shí)間、定性離子對、定量離子對、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表2.

表2 T-2毒素質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Condition parameters of mass spectrometry of T-2 Toxin

2.3 供試品溶液的制備

稱取樣品粉末(過二號篩)5.0 g(精確到0.1 g)于離心管中,加入20 ml乙腈-0.1%甲酸溶液(8∶2),混勻,旋渦混合5 min,在離心機(jī)中以8000轉(zhuǎn)/min離心5 min,取上清液置含有150 mg PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)的2 ml離心管中,旋渦混合5 min,取上清液置離心機(jī)中以15000轉(zhuǎn)/min離心5 min,過0.22 um濾膜,即得.

3 結(jié)果

3.1 精密度試驗(yàn)

取T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度：22.5μg.ml-1),按2.1、2.2項(xiàng)下條件,連續(xù)進(jìn)樣測定峰面積6次,RSD值為0.28%(n=6).結(jié)果表明,儀器精密度良好.

3.2 線性關(guān)系考察

精確量取T-2毒素對照品儲備液用乙腈配制得到濃度為1、5、15、22.5、25μg.L-1的對照品溶液,按2.1、2.2項(xiàng)下條件測定.進(jìn)樣3μL,以峰面積為縱坐標(biāo)(y),濃度為橫坐標(biāo)(x),計(jì)算其回歸方程：y=531.9x+26.1,r=0.9995,表明T-2毒素在1～25μg.L-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取陳皮樣品(批號：20180102)粉末(過二號篩)按2.3方法平行制備6份供試品溶液,依據(jù)2.1、2.2條件檢測T-2毒素,結(jié)果均未檢出T-2毒素,RSD為0.1%,結(jié)果表明方法重復(fù)性良好.

3.4 樣品測定

分別取三批陳皮樣品(批號：20180102、180307、18122807)按2.3方法制備供試品溶液,按2.1、2.2項(xiàng)下條件測定T-2毒素殘留量.結(jié)果：三批陳皮樣品均未檢出T-2毒素.

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3.3項(xiàng)未檢出T-2毒素的供試品溶液,按照15μg.kg-1加入T-2毒素對照品溶液,分別在0,2,4,6,8 h依據(jù)2.1、2.2條件檢測T-2毒素,記錄峰面積并計(jì)算RSD值,RSD為1.9%,結(jié)果表明供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.6 檢出限試驗(yàn)

在陳皮(批號：20180102)粉末(過二號篩)中添加T-2毒素并按2.1、2.2項(xiàng)下條件檢測,依據(jù)特征離子色譜峰信噪比S/N＞3為方法檢測限,測得T-2毒素的檢測限為2.0μg.kg-1.

圖1 對照品圖譜、樣品圖譜Fig.1 UPLC-MS/MS chromatrogram

3.7 回收率試驗(yàn)

在陳皮(批號：180723)粉末(過二號篩)中分別添加2μg.kg-1、10μg.kg-1、20μg.kg-1三個(gè)濃度的藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn),按每一個(gè)濃度做3個(gè)平行,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算平均回收率及RSD見表3,顯示T-2毒素的回收率為91.86%,RSD為2.88%,滿足殘留量分析的要求.

表3 T-2毒素回收率測定結(jié)果(n=9)Tab.3 Determination results of T-2 Toxin recovery(n=9)

4 討論與小結(jié)

4.1 儀器條件優(yōu)化

參考食品中液相色譜法檢測T-2毒素的流動相,[3]選用乙腈-水(75∶25)作為液相色譜的流動相試驗(yàn),結(jié)果T-2毒峰峰型不好,和雜質(zhì)峰的不能完全分離,考慮到樣品雜質(zhì)干擾大,為了改善峰型,把水相由水改為0.1%的甲酸溶液,并加大了水相的比例,使用梯度洗脫,經(jīng)試驗(yàn),2.1項(xiàng)所使用的梯度條件能使T-2毒素峰型良好并能和雜質(zhì)峰完全分離,流動相中使用0.1%甲酸溶液也能使T-2毒素更易于離子化,UPLC-MS/MS中獲得更高的靈敏度.

在對T-2毒素優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)做全掃描時(shí)會出現(xiàn)加鈉峰和加銨峰,加鈉峰在做分析過程中容易不穩(wěn)定,主要是加鈉峰不容易打碎,能量過高易完全碎烈無特征,而加銨峰在精密度試驗(yàn)的RSD值更小,故該實(shí)驗(yàn)選擇加銨峰作為T-2毒素的母離子.

4.2 前處理方法的選擇

食品、[3]飼料[4]中高效液相色譜法檢測T-2毒前處理的方法均要使用免疫親和柱凈化,其專屬性強(qiáng),回收率高,但存在價(jià)格昂貴、儲存使用條件苛刻、保存期短等缺點(diǎn).本研究采用PSA作為吸附劑,其廣泛用于分析樣品處理,能去除有機(jī)酸,色素和金屬離子等成分,該方法中PSA可以吸附陳皮中的植物組織等各種干擾成分從而達(dá)到較好的除雜凈化的目的,不但節(jié)能環(huán)保,而且極大地提高了檢測效率.