黃順楷，郭昱嵩，汪 淳，張海瑞，王淑如，董忠典

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江，524088）

雌激素是性類固醇激素的一員，其他還包括雄激素和孕激素[1]。雌激素在所有脊椎動物及一些昆蟲體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)[2-3]。動物含有3種內(nèi)源性雌激素：雌酮(Estrone)、雌二醇(Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol)。其中，雌二醇雌激素效力最強，且最為普遍。除在許多器官中起調(diào)節(jié)作用外，雌激素還參與生殖細胞發(fā)生和促性腺激素調(diào)節(jié)等方面的調(diào)控[4]。雖然在雄性動物體內(nèi)雌激素水平明顯低于雌性，但雌激素對雄性動物也同樣具有重要生理作用[5]。

雌激素受體(Estrogen Receptor, ER)是核受體超家族的一員，具有介導雌激素調(diào)節(jié)轉錄的作用。雌激素一旦進入細胞，很快與 ER結合，并激活 ER二聚化，使其與靶基因結合調(diào)控相關基因轉錄[6]。在大多脊椎動物中，er家族包括2種亞型erα和erβ。在魚類中，由于特有的基因組復制事件，使得眾多的er亞型被發(fā)現(xiàn)[7-11]。一些系統(tǒng)發(fā)育上較為古老的魚類，只發(fā)現(xiàn)2種er亞型[12]。

雌激素受體功能的差異性表現(xiàn)在同一組織中er有不同表達水平。在小鼠卵泡細胞中發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞增加與er表達量有關，其中erβ顯著高于erα，可能表明erβ參與顆粒細胞增殖和分化[13]。雌激素受體敲除模型構建，為研究雌激素受體功能提供了極大便利。分別對雌性[14]和雄性[15]小鼠(Mus musculus)進行er敲除，發(fā)現(xiàn)雌鼠不育，卵巢在排卵前停止發(fā)育；而雄鼠則出現(xiàn)睪丸萎縮等生殖能力降低現(xiàn)象。在大黃魚(Larimichthys crocea)中，Chen等[16]發(fā)現(xiàn)erα和erβ2在肝中有明顯高表達，推測其在肝中起介導雌激素效應作用；同時，在不同卵泡細胞、濾泡細胞和不同精子發(fā)育階段中，er各亞型有差異的表達特征，Chen等[16]認為不同er受體類型可能在參與性腺發(fā)育和排卵過程中起不同作用。研究魚類雌激素受體功能，將有助于進一步了解受體介導雌激素機制，為完善雌激素調(diào)控理論提供基礎。

弓背青鳉(Oryzias curvinotus)又稱海南青鳉，具有繁殖力強、世代周期短、廣鹽性等特點，具有開發(fā)為模式生物的潛力[17]。弓背青鳉與日本青鳉(Oryzias latipes)發(fā)育非常相似，胚胎呈透明狀，且每個發(fā)育階段均有其明顯特征，在出膜前各器官已發(fā)育完全。對弓背青鳉的資源普查方面已有報道[18]，廖健等[19]以弓背青鳉作為模型，探究了魚類對壬基酚等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的響應。

本研究克隆弓背青鳉3種ocuer亞型，并對其介導雌激素調(diào)控機制和參與機體功能進行初步探究，旨在進一步為雌激素作用機理及對生物體調(diào)節(jié)功能的研究提供基礎理論資料。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚培育、水體暴露與材料采集

實驗用弓背青鳉 F3代為本實驗室所繁育，親本采自廣東省湛江市高橋紅樹林保護區(qū)。成魚飼養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，養(yǎng)殖溫度條件為：(26 ± 2)℃，晝夜光照比為14 h∶10 h。

取性成熟雄、雌弓背青鳉各6尾，分別解剖取眼、肌肉、腦、肝臟、性腺和鰓組織，液氮速凍，用于RNA提取。

收集親本弓背青鳉所產(chǎn)的已受精魚卵，胚胎發(fā)育溫度條件為(26 ± 2) ℃，晝夜光照比為14 h∶10 h，過程中每日更換水。弓背青鳉的胚胎發(fā)育分期參考日本青鳉胚胎發(fā)育分期劃分[20]，選取胚胎發(fā)育的10個階段：1細胞期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、16肌節(jié)期、發(fā)眼期、脊索空泡化完成期、心包腔完成期、脾發(fā)育期、孵化期。每階段設置3組平行，16～20枚胚胎作為一個取樣組，用于RNA提取。

將 β-雌二醇(E2)(Macklin)溶于無水乙醇中，母液濃度為 10 mg/mL，4 ℃下保存?zhèn)溆?。取同批次出膜時間小于6 h的弓背青鳉健康仔魚576尾，進行 E2暴露實驗。實驗分為：溶劑對照組(VAbsoluteethanol∶Vwater=1∶5 000)和 E2暴露組(2 μg/L、20 μg/L、200 μg/L)。每個濃度組設3個平行，每平行組 48尾仔魚，整個暴露實驗過程不飼喂仔魚，暴露24 h后將各組存活仔魚提取RNA。

1.2 RNA提取和基因克隆

用Trizol(Invitrogen) 法提取胚胎、仔魚及成魚各組織總 RNA，并檢測其濃度和完整性。用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)合成第一鏈cDNA，所得cDNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考本實驗室已有的弓背青鳉肝臟轉錄組中ocuer序列進行引物設計（表1）。以肝cDNA為模板擴增ocuer基因片段，產(chǎn)物電泳檢測合格后純化連接到 pMD18-T(Takara)載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α)，取陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 生物信息學分析

檢查峰型圖確定測序質(zhì)量合格，去接頭并于MEGA7.0拼接，經(jīng) BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)確定序列準確后，Clustal W進行氨基酸比對。進一步采用鄰位連接法(Neighbor-Joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹，各節(jié)點置信度采用bootst重抽樣1 000次獲得。

1.4 實時熒光定量PCR

根據(jù)克隆測序結果設計熒光定量PCR引物（表1），檢測ocuer3種亞型在不同組織與不同胚胎發(fā)育時期的表達量，雌二醇暴露后各濃度組ocuer3種亞型表達量和ocuvtg表達量。內(nèi)參基因選擇參考Dong等[21]方法。定量 PCR儀為 LightCycler? 96 PCR system (Roche, Basel, Switzerland)，反應程序為94 ℃預變性 3 min；94 ℃，5 s；60 ℃，退火 5 s；72 ℃，延伸10 s，循環(huán)數(shù)為 40。根據(jù)結果顯示的Ct值，用 2-ΔΔCt計算出ocuer的相對表達量。利用SPSS17.0進行單因素方差分析統(tǒng)計顯著性。

2 結果與分析

2.1 弓背青鳉雌激素受體基因的克隆及序列分析

本研究克隆得到弓背青鳉的3個雌激素受體亞型基因（圖1-3），分別為ocuerα、ocuerβ1、ocuerβ2。3個基因的編碼區(qū)序列長分別為1 971、2 006、2 365 bp，最長開放閱讀框(ORF)序列分別為1 860、1 689、2 007 bp，編碼的氨基酸個數(shù)相應為619、562和688，預測蛋白分子質(zhì)量分別為67 715.32、62 321.47、73 342.92 u。

ocuErα/Erβ1/Erβ2 蛋白序列有 6 個基本功能域（圖4），分別為A/B區(qū)（轉錄激活區(qū)）、C區(qū)（DNA結合區(qū)，DBD）、D區(qū)（鉸鏈區(qū)）、E區(qū)（配體結合區(qū)，LBD）和F區(qū)。弓背青鳉3種受體的A/B區(qū)中均含MAPK激酶磷酸化位點（AF-1）；C區(qū)長度也較一致，均含有8個半胱氨酸殘基構成的2個鋅指結 構 Znf1(Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys)和Znf2(Cys-X4-Cys-X9-Cys-X2-Cys)；D區(qū)含有核受體家族所保守的P-box(EGCKA)和D-box(PATNQ/A)；E區(qū)含有轉錄激活區(qū)AF-2(DLLLEMLDA)。

2.2 弓背青鳉雌激素受體編碼氨基酸系統(tǒng)進化分析

系統(tǒng)進化樹顯示 ERβ亞型聚為一類（圖5），ocuErα亞型與哺乳類、鳥類和兩棲類ER聚為一類；斑馬魚(Danio rario)Erγ亞型分為一支。無論是哪種亞型，弓背青鳉雌激素受體與日本青鳉和海水青鳉(Oryzias melastigma)的具有最高親緣性，與底鳉(Fundulus heteroclitus)、食蚊魚(Gambusia affinis)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)和波紋絨須石首魚(Micropogonias undulatus)的有較高親緣性。

圖1 弓背青鳉erα的cDNA序列及預測氨基酸序列Fig.1 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in erα genes in Oryzias curvinotus

圖2 弓背青鳉erβ1的cDNA序列及預測氨基酸序列Fig.2 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in erβ1 genes in Oryzias curvinotus

圖3 弓背青鳉erβ2的cDNA序列及預測氨基酸序列Fig.3 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in erβ2 genes in Oryzias curvinotus

圖4 弓背青鳉3種雌激素受體氨基酸序列與不同物種雌激素受體序列比較Fig.4 Amino acid sequences of three ocuEr aligement with ER sequences of other species

續(xù)圖4（Continued）

2.3 弓背青鳉雌激素受體基因表達特性分析

圖6表明，ocuerα在弓背青鳉雌性的肝臟中表達量最高，但在雄性肝臟中表達量較低，雌、雄肝臟間有顯著性差異(P＜0.05)；其次在精巢和卵巢中有較高表達，在雌、雄的眼、肌肉、腦、鰓等其他組織中也有表達，但在眼、肌肉和鰓中表達量相對較低，且各組織間差異不顯著(P＞0.05)。ocuerβ1在卵巢、雄性肝臟中表達量相對較高且具有性別差異，在其他組織中也有表達，在眼、腦和雄鰓中表達量較低。ocuerβ2在青鳉的肝臟、精巢和卵巢中高表達，且肝臟中的表達量顯著高于性腺(P＜0.05)，且肝臟的表達量具有雌雄差異，其他組織中的表達量相對較低，且各組織間差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 弓背青鳉與其他物種的ER氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic analysis of ER amino acid sequence with some other species by neighbor-joining

圖6 熒光定量PCR檢測弓背青鳉組織中erα、erβ1和erβ2表達量Fig.6 The expression of ocuer in various tissues of adult Oryzias curvinotus by RT-qPCR

從圖7可以看出，ocuerα在胚胎發(fā)育早期（1細胞期、卵裂期和囊胚期）表達量較低，原腸胚開始表達量逐漸升高，在脾發(fā)育期達到最高(P＜0.05)，在器官發(fā)育階段維持一個相對較高的表達水平。在早期胚胎發(fā)育階段，ocuerβ1保持較高表達水平，在原腸胚階段出現(xiàn)峰值(P＜0.05)，隨后表達水平降低，在后期器官發(fā)育階段緩慢上升。ocuerβ2在 1細胞期和卵裂期維持在一個較高水平，隨后表達量逐漸下降，從脊索空泡化完成后，表達量逐漸上升，且保持一個較高表達水平至孵化。

圖7 熒光定量PCR檢測弓背青鳉胚胎發(fā)育各時期中erα、erβ1和erβ2表達量Fig.7 The expression of ocuer in embryonic development stage of Oryzias curvinotus by RT- qPCR

2.4 E2暴露下弓背青鳉仔魚雌激素受體基因的表達特性

圖8 熒光定量PCR檢測不同濃度的雌激素E2暴露后基因表達量Fig.8 The expression of relative gene in larva of Oryzias curvinotus by RT- qPCR

對剛出膜的弓背青鳉仔魚進行不同濃度的 E2暴露處理，結果如圖8顯示。相對于對照組，經(jīng)過不同濃度下的E2暴露處理，ocuerα在20 μg/L組中顯著上調(diào)6.7倍(P＜0.001)，且呈現(xiàn)出低濃度強誘導，高濃度較弱誘導的表達上調(diào)趨勢；ocuerβ1僅在20 μg/L 組中顯著上調(diào)(P＜0.05)；ocuerβ2表達受到抑制，在高濃度組中表達量顯著下調(diào)(P＜0.01)；雌激素效應分子標記物ocuvtg表達量也呈上調(diào)趨勢，應答模式為中低濃度強上調(diào)，高濃度受到較弱的誘導表達。

3 討論

3.1 弓背青鳉雌激素受體序列分析

本研究克隆弓背青鳉 3種雌激素受體基因(ocuerα/erβ1/erβ2)，3 種亞型分別與各自的 ER 亞型聚為一類，提示雌激素受體基因在物種進化上具有較高的保守性。序列分析顯示，弓背青鳉雌激素受體與日本青鳉、海水青鳉、斑馬魚、智人(Homo sapiens)及小鼠氨基酸序列相似，屬于典型的核受體超家族的一員。在ocuEr氨基酸序列的A/B區(qū)中，同時含有潛在的MAPK磷酸化位點，但序列比對顯示差異性較大，在轉錄激活功能上，三種亞型可能具有較大差異[22]。C區(qū)含有P-box和D-box，E區(qū)含有依賴配體的轉錄激活區(qū)域AF-2，且氨基酸序列高度相似，這與以往文獻報道結果符合[23]。F區(qū)比對顯示差異性較大，可能在促進 ERα/Sp1激活過程[24]，控制基因轉錄大小[25]，與E區(qū)相互作用抑制受體二聚化[26]上有較大差異性。

3.2 弓背青鳉雌激素受體組織表達特征

組織分布顯示，弓背青鳉雌激素受體在眼、肌肉、腦、肝臟、性腺和鰓均有不同程度的表達，與以往研究類似（表2）。各亞型在不同性別或不同組織間表達豐度不同，表明其在不同組織可能參與不同的生理功能。在斑馬魚肝臟中，依賴于E2的卵黃生成素基因的轉錄調(diào)控可能與Erα和Erβ2的協(xié)同作用有關[30]。ER受體與E2結合，誘導肝臟合成卵黃蛋白原[39]，合成的卵黃蛋白原被釋放到血液中，轉運到發(fā)育中的卵母細胞。在大菱鲆卵黃蛋白基因的轉錄調(diào)控中，erα起重要作用，因為外源的E2暴露可上調(diào)肝erα的表達，但erα并不是唯一調(diào)節(jié)卵黃蛋白基因表達的er亞型；erβ亞型的介導也被認為是E2促進卵黃蛋白合成的重要因素[9]?；诮痿~研究，Nelson等[40]提出這3種ER在肝臟的功能假設：17β-雌二醇誘導卵黃原蛋白在包括金魚在內(nèi)的卵生動物肝臟中產(chǎn)生，erα上調(diào)是由雌二醇通過激活erβ亞型而誘導的，這種誘導使雌二醇對肝臟刺激進一步放大，增加肝臟對雌二醇的敏感性；erα的上調(diào)能促進細胞生長、生殖發(fā)育和卵黃發(fā)生，erβ1和erβ2參與維持Erα的正常水平。弓背青鳉3種er亞型在肝臟的表達特征，推測3種亞型在肝臟中可能共同行使著介導合成卵黃蛋白原功能，這為Nelson的假說添加佐證。

表2 不同物種的雌激素受體組織分布特征Table 2 The tissue distribution of er genes in different species

除在肝臟中參與卵黃蛋白合成外，在魚類中ER有著介導卵母細胞生長和成熟相關信號通路的功能[37,41]。日本青鳉卵母細胞生長過程中卵泡顆粒細胞erα表達水平較高[10]。大菱鲆卵巢中er3種亞型均表現(xiàn)出高表達水平，以調(diào)節(jié)卵泡卵黃發(fā)生成熟[9]。弓背青鳉3種亞型在卵巢的高表達情況符合前人報道，然而ocuerα和ocuerβ2在精巢中也表現(xiàn)出較高表達。以往認為雌激素是雌性特有的內(nèi)源性激素，然而越來越多的研究揭示雌激素在雄性動物的生長發(fā)育與性成熟中起重要調(diào)節(jié)作用[42]。在哺乳類中，雌激素對雄性小鼠的肝臟再生和器官對胰島素敏感性有正向調(diào)節(jié)作用[43-45]；通過讓介導雌激素轉導的Er突變，突變小鼠表現(xiàn)出更低的攻擊行為[46]，雄性突變體由于睪丸體細胞和外生導管系統(tǒng)的雌激素作用中斷而不育，影響雄性生殖能力[47]。

在魚類中，已有多個研究發(fā)現(xiàn)至少有1種雌激素受體存在精巢中[45,48]，并有相對較高的表達[10,28,35,49]。Senarat等發(fā)現(xiàn)在短體羽鰓鮐(Rastrelliger brachysoma)的精巢和精子發(fā)生中存在Gnrh、Gths和 Erα[50]。對虹鱒精子研究發(fā)現(xiàn)，er介導雌激素調(diào)控與早期精子發(fā)生、成熟和排出[51]。弓背青鳉er在精巢的表達特征與眾多的研究相似，提示在精子發(fā)生、成熟等方面，可能er起著重要介導作用，并且這種現(xiàn)象在脊椎動物中具有較高保守性[52]。

3.3 弓背青鳉胚胎發(fā)育雌激素受體的表達特征

雌激素通過雌激素受體的介導，參與胚胎的生長調(diào)控。弓背青鳉胚胎中，er不同發(fā)育時期表達量結果顯示，ocuerα早期表達量較低，經(jīng)囊胚發(fā)育后隨著細胞數(shù)目增多、各部位器官發(fā)育表達量逐漸上升，這與李丹丹等[53]報道的小鼠胚胎發(fā)育中，erα表達特征相似。推測弓背青鳉胚胎發(fā)育的早期是先由母源mRNAs和蛋白質(zhì)調(diào)控，隨著卵裂進行，細胞數(shù)目增多，需要新的合子型 RNA和蛋白質(zhì)調(diào)控后續(xù)的發(fā)育過程，但合子型基因需要時間激活，所以囊胚后才檢測到erα表達。對斑馬魚胚胎發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)[29]，3種亞型在胚胎發(fā)育的早期有強烈表達變化，erα和erβ1隨著胚胎發(fā)育表達量逐漸上升；erβ2表現(xiàn)為早期高表達，隨后顯著降低，后期又逐漸上升。斑馬魚胚胎在24 hpf前，erα無明顯表達；erβ1和erβ2由于從母源繼承，表達量高，隨后被消耗或降解表達量下降；48 hpf時，erβ1表達量高于erβ2[54]。Feist等人[55]測量了虹鱒胚胎中包括雌激素在內(nèi)的類固醇濃度，發(fā)現(xiàn)在整個孵化周期中類固醇濃度呈雙峰型，隨著母源的類固醇消耗，類固醇濃度在發(fā)育的早期逐漸下降；隨后在孵化前濃度增加。ocuerβ亞型在胚胎發(fā)育中顯示出前期高水平，隨后表達降低，而后水平逐漸升高，這可能是ocuerβ亞型在胚胎發(fā)育中，起著與其他物種類似功能，且表達量變化可能與雌激素水平有關。

3.4 E2暴露對弓背青鳉仔魚雌激素受體的表達影響

卵黃蛋白(Vitellogenin,vtg)是卵黃的前體蛋白，通常存在于雌性動物的血液中，常被用作脊椎動物中環(huán)境雌激素暴露的生物標記物[56]。魚類er對于雌激素的響應，不同的er亞型具有不同的表達特征，這取決于物種、組織、性別、繁殖狀態(tài)和發(fā)育階段[22,57-59]。Marlatt等[60]對虹鱒研究發(fā)現(xiàn)，對剛孵化的仔魚進行1 μg/L的E2暴露，相對于對照組，erβ1和erβ2表達量均下降。也有研究報道[61]，在外源 E2作用下，erα和vtg水平同時升高，但erβ亞型則呈現(xiàn)減少或沒有變化。弓背青鳉仔魚er在E2暴露后表現(xiàn)出不同的變化情況，可能如 Nelson等[62]所推測，各亞型雌激素受體組成調(diào)控整體，彼此之間相互調(diào)節(jié)，使其在介導雌激素轉導和調(diào)控機體生長發(fā)育中能發(fā)揮充分的作用。

4 結語

本研究克隆出弓背青鳉3種亞型er序列，定量結果表明3種er亞型主要在成魚的肝臟和雌雄性腺表達，且ocuerα和ocuerβ1存在肝臟的表達呈性別二態(tài)性，支持er在兩性生殖中的重要性和雌雄分化。在仔魚早期發(fā)育階段E2暴露會抑制ocuerβ1、ocuerβ2表達，揭示ocuerβ亞型的表達在介導魚類對E2敏感性中具有重要作用。此外，弓背青鳉雌激素受體間調(diào)節(jié)功能尚需通過基因定位、過表達和敲除等技術進一步研究。