朱香鎮(zhèn)， 雒珺瑜， 李笠坤,， 吳益東， 李春花， 崔金杰*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/昆蟲分子毒力學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095

近20年來，隨著轉(zhuǎn)基因棉花在我國(guó)大規(guī)模的商業(yè)化種植，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到迅猛發(fā)展，越來越多的新型基因被導(dǎo)入棉花中，轉(zhuǎn)基因棉花的種類也蜂擁出現(xiàn)(劉晨曦和吳孔明，2011)，其中復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)特殊基因棉花、轉(zhuǎn)融合基因棉花等新型轉(zhuǎn)基因棉花已成為商業(yè)化開發(fā)的一個(gè)重要趨勢(shì)。新型轉(zhuǎn)基因棉花和傳統(tǒng)轉(zhuǎn)單價(jià)基因棉花一樣，大規(guī)模的種植可能會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生潛在的影響，因此，在商業(yè)化種植前對(duì)新型轉(zhuǎn)基因棉花的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)顯得尤為重要。

環(huán)境安全性評(píng)價(jià)主要包括靶標(biāo)昆蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生的抗性、轉(zhuǎn)基因作物的雜草化趨勢(shì)、基因漂流、對(duì)有益昆蟲和天敵生物以及生物多樣性的影響等問題(錢迎倩等，2001； 吳孔明，2007； Hails,2000)。異色瓢蟲Harmoniaaxyridis(Pallas)作為一種捕食性很強(qiáng)的天敵生物廣泛存在于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中(王甦等，2007)，其捕食對(duì)象包括各種蚜蟲、葉螨和介殼蟲等同翅目昆蟲以及鞘翅目、膜翅目、雙翅目和鱗翅目昆蟲的幼蟲和蛹(Dixon,2000; Obrycki & Kring,1998)。捕食性天敵在維持田間生態(tài)平衡和復(fù)雜的生態(tài)鏈鎖方面起著重要作用；而當(dāng)轉(zhuǎn)基因作物種植后，植物體內(nèi)或組織上表達(dá)出異源蛋白或毒蛋白如花粉、花蜜、葉片等，被害蟲取食后，影響害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等，最終導(dǎo)致天敵生物獵物質(zhì)量與數(shù)量改變(Harwoodetal.,2005; Zwahlen & Andow,2005)。通過三級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物對(duì)天敵生物生長(zhǎng)發(fā)育影響以及對(duì)農(nóng)田害蟲的捕食和控制作用已在轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、棉花等作物上成為研究熱點(diǎn)(lvarez-Alfagemeetal.,2009; Hanetal.,2014; Romeisetal.,2004)。

丁瑞豐等(2016)以轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因抗蟲棉花及其親本為材料對(duì)棉花—棉蚜AphisgossypiiGlover —普通草蛉Chrysoperlacarnea(Stephens)三級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)普通草蛉捕食功能反應(yīng)和搜尋效應(yīng)沒有顯著的影響；施敏娟(2012)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對(duì)中華草蛉ChrysoperlasinicaTjeder的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖無不良影響，并且ELISA檢驗(yàn)的結(jié)果顯示,中華草蛉體內(nèi)不含Bt毒蛋白，說明Bt毒蛋白不會(huì)經(jīng)過棉蚜傳至其天敵中華草蛉體內(nèi)；對(duì)捕食性天敵草間小黑蛛Erigonidiumgraminicolum利用棉花—棉鈴蟲—草間小黑蛛三級(jí)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的研究表明，轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花對(duì)草間小黑蛛體重及其體內(nèi)外源蛋白含量的影響均不顯著，并且對(duì)草間小黑蛛體內(nèi)相關(guān)解毒酶和保護(hù)酶活性亦無顯著影響(雒珺瑜等，2013)；還有研究轉(zhuǎn)Bt基因棉花對(duì)煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)天敵昆蟲龜紋瓢蟲Propyleajaponica(Thunberg)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，龜紋瓢蟲對(duì)煙粉虱的捕食功能符合HollingⅡ型反應(yīng)，并且轉(zhuǎn)Bt基因棉花上的煙粉虱對(duì)龜紋瓢蟲的發(fā)育歷期和存活率沒有明顯的影響(周福才等，2013)。

本研究以轉(zhuǎn)Cry1Ac/1Ab基因棉花為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以其常規(guī)親本棉為對(duì)照，研究飼喂不同棉花的初孵棉鈴蟲對(duì)天敵生物異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以及不同齡期異色瓢蟲對(duì)初孵棉鈴蟲的捕食功能，旨在探索我國(guó)轉(zhuǎn)新型基因棉花的環(huán)境安全評(píng)價(jià)理論與方法，同時(shí)為我國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)天敵生物安全性評(píng)價(jià)提供更多的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試棉花

轉(zhuǎn)Cry1Ac/1Ab基因棉花品系(A26-5)和其親本常規(guī)棉花品系(J14)由創(chuàng)世紀(jì)種業(yè)公司提供，種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)實(shí)驗(yàn)田內(nèi)，供試棉花葉片為直接在實(shí)驗(yàn)田塊A26-5和J14采集的倒三葉。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中田間未使用任何化學(xué)農(nóng)藥。

1.2 供試?yán)ハx及飼養(yǎng)方法

異色瓢蟲采集于非轉(zhuǎn)基因棉田，在室內(nèi)經(jīng)人工飼養(yǎng)至產(chǎn)卵后，將瓢蟲卵放在透明并帶有透氣孔的塑料盒內(nèi)(直徑9 cm，高10 cm)，置于光照培養(yǎng)箱[溫度(26±1) ℃，濕度 60%～70%，L/D=14/10]待孵化；棉鈴蟲由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，在室內(nèi)利用人工飼料飼養(yǎng)多代且未使用任何農(nóng)藥。

1.3 飼喂轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴蟲對(duì)異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育及體重的影響

在第二代棉鈴蟲發(fā)生期(棉花生長(zhǎng)的蕾期)，采集不同棉花品種的上部倒三葉，飼喂初孵棉鈴蟲幼蟲后備用。選擇體型大小一致的棉鈴蟲幼蟲用于異色瓢蟲捕食功能實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉鈴蟲幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育具有抑制作用，因此，幼蟲飼喂轉(zhuǎn)基因棉花24 h,飼喂對(duì)照葉片12 h。初孵異色瓢蟲幼蟲每20頭為一組，瓢蟲幼蟲在20 mm × 100 mm小試管中單頭飼養(yǎng)，重復(fù)3次。瓢蟲用初孵棉鈴蟲飼喂，每天更換棉鈴蟲初孵幼蟲；小試管內(nèi)事先放入清潔紙條和保濕的棉球，每天更換一次。觀察其生長(zhǎng)發(fā)育，記錄蛻皮情況，用1/100000的天平對(duì)蛻皮后的瓢蟲稱重，直到所有供試瓢蟲產(chǎn)卵結(jié)束為止。

1.4 飼喂轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴蟲對(duì)異色瓢蟲捕食功能反應(yīng)的影響

異色瓢蟲的捕食功能反應(yīng)以取食不同轉(zhuǎn)基因棉花的棉鈴蟲初孵幼蟲為獵物，并在室內(nèi)統(tǒng)一饑餓12 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；在5個(gè)塑料盒中分別放置5、10、15、20、25頭棉鈴蟲初孵幼蟲，然后分別放入1頭異色瓢蟲1齡幼蟲，每個(gè)密度設(shè)置5個(gè)塑料盒為1次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次；透明塑料盒的直徑為9 cm，高為10 cm，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)于異色瓢蟲2、3和4齡幼蟲的捕食功能反應(yīng)模型，實(shí)驗(yàn)步驟同異色瓢蟲1齡幼蟲，只是設(shè)置的初孵棉鈴蟲的密度不同。對(duì)于異色瓢蟲2齡幼蟲，設(shè)置的5個(gè)棉鈴蟲初孵幼蟲密度分別為10、20、30、40和50頭；對(duì)于異色瓢蟲3齡幼蟲，設(shè)置的5個(gè)棉鈴蟲初孵幼蟲密度分別為15、30、45、60和75頭；對(duì)于異色瓢蟲4齡幼蟲，設(shè)置的5個(gè)棉鈴蟲初孵幼蟲密度分別為30、45、60、75和90頭。24 h后記錄取食棉鈴蟲幼蟲個(gè)數(shù)，并建立捕食功能反應(yīng)模型——HollingⅡ型反應(yīng)模型。功能反應(yīng)圓盤方程為：1/Na=1/(aT)×1/N+Th/T。式中：Na為被捕食的獵物數(shù)量；N為獵物密度；a為瞬時(shí)攻擊率；T為實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(1 d)；Th為處置1頭獵物時(shí)間。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One-way analysis，ANOVA)和Duncan′s 差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育及體重的影響

2.1.1 轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)異色瓢蟲幼蟲發(fā)育歷期的影響 如表1所示，與常規(guī)親本棉相比，取食飼喂轉(zhuǎn)基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲幼蟲的異色瓢蟲幼蟲發(fā)育至2齡時(shí)間縮短0.33 d，差異不顯著(P>0.05)，但發(fā)育至3、4齡、蛹期時(shí)間均被延長(zhǎng)，分別延長(zhǎng)0.30、0.57、0.23 d，差異均不顯著(P>0.05)；異色瓢蟲幼蟲從1齡發(fā)育至化蛹期時(shí)間延長(zhǎng)0.77 d，但差異不顯著(P>0.05)。

2.1.2 轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)異色瓢蟲幼蟲體重的影響 如表2所示，與常規(guī)親本棉相比，取食飼喂轉(zhuǎn)基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲的異色瓢蟲幼蟲，除1齡幼蟲體重增加0.0773 mg外，其余各齡期幼蟲體重均有所下降，但差異均不顯著(P>0.05)。

表1 不同棉花品種對(duì)異色瓢蟲幼蟲發(fā)育歷期的影響Table 1 Response of developmental duration of H.axyridis larvae to the varieties of cotton

表2 不同棉花品種對(duì)不同齡期異色瓢蟲幼蟲體重的影響Table 1 Body weight of H.axyridis larvae fed with the two cotton varieties

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)異色瓢蟲捕食功能反應(yīng)的影響

異色瓢蟲1、2、3、4齡幼蟲對(duì)初孵棉鈴蟲捕食量均隨棉鈴蟲密度的增加而增加，當(dāng)棉鈴蟲密度達(dá)到一定限度后不再增加(圖1)。各齡期異色瓢蟲幼蟲對(duì)飼喂不同棉花品種的初孵棉鈴蟲捕食功能均符合HollingⅡ型反應(yīng)。通過捕食功能反應(yīng)模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(表3)，不同齡期的異色瓢蟲幼蟲對(duì)初孵棉鈴蟲的功能反應(yīng)相關(guān)系數(shù)均高于0.9284，達(dá)顯著相關(guān)水平，說明實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)模型能反應(yīng)不同齡期異色瓢蟲在不同棉鈴蟲密度下的捕食規(guī)律。隨著異色瓢蟲齡期的增長(zhǎng)，其對(duì)飼喂2種棉花的棉鈴蟲瞬間攻擊率加快，即異色瓢蟲1齡時(shí)對(duì)飼喂A26-5和J14棉花的棉鈴蟲攻擊率分別為0.8818和0.8173，而至4齡時(shí)瞬間攻擊率達(dá)到0.9521和0.9992；隨著異色瓢蟲齡期的增長(zhǎng)，其對(duì)棉鈴蟲的處理時(shí)間逐漸縮短，即異色瓢蟲取食飼喂A26-5和J14棉花的棉鈴蟲的處理時(shí)間從1齡的0.0161和0.0172 h減少到4齡的0.0026和0.0043 h，但異色瓢蟲對(duì)飼喂2種棉花的棉鈴蟲的瞬間攻擊率和處理時(shí)間差異均不顯著(P>0.05)。

3 討論

轉(zhuǎn)基因作物的出現(xiàn)，一方面使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本大幅度降低并且有效地提升了品質(zhì)和產(chǎn)量，另一方面卻給生態(tài)環(huán)境安全帶來不確定性和不穩(wěn)定性。研究表明，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)生態(tài)環(huán)境安全的影響最為重要的是其對(duì)非靶標(biāo)生物的影響(Conneretal.,2003; Paul,2002)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與常規(guī)親本棉相比，轉(zhuǎn)Cry1Ac/1Ab基因棉對(duì)異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育歷期無顯著影響，取食飼喂轉(zhuǎn)基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲的異色瓢蟲幼蟲，除1齡幼蟲體重增加外，其余各齡期幼蟲體重均有所下降，但差異均不顯著，與雒珺瑜等(2013)、Hanetal.(2014)、Zhuetal.(2006)的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)是捕食性天敵通過三級(jí)營(yíng)養(yǎng)間接取食轉(zhuǎn)基因作物，因此直接或間接取食轉(zhuǎn)基因作物是否增加或減輕捕食性天敵的體重還需進(jìn)一步研究(Sayyedetal.，2003)。

圖1 不同齡期異色瓢蟲對(duì)飼喂不同棉花初孵棉鈴蟲的捕食功能反應(yīng)曲線Fig.1 The response curves of H.axyridis larvae preying on bollworms feeding in different cotton varieties A：異色瓢蟲1齡幼蟲；B：異色瓢蟲2齡幼蟲；C：異色瓢蟲3齡幼蟲；D：異色瓢蟲4齡幼蟲。 A: 1st instar H.axyridis larva; B: 2nd instar H.axyridis larva; C: 3rd instar H.axyridis larva; D: 4th instar H.axyridis larva.

齡期Stages棉花品種Cotton variety瞬時(shí)攻擊率(a)Instantaneous attack rate處理時(shí)間(Th)Handling time/s功能方程Function equationR21齡A26-50.8818±0.07610.0161±0.0025Na=0.8818N/(1+0.1446N)0.95941st instarJ140.8173±0.09690.0172±0.0047Na=0.8173N/(1+0.0156N)0.94202齡 A26-51.1580±0.02560.0136±0.0004Na=1.1580N/(1+0.2223N)0.99282nd instar J141.2069±0.01610.0152±0.0007Na=1.2069N/(1+0.2122N)0.99313齡 A26-51.0058±0.02450.0039±0.0007Na=1.0058N/(1+0.0040N)0.93243rd instar J141.0361±0.02390.0069±0.0012Na=1.0361N/(1+0.0072N)0.92844齡 A26-50.9521±0.02370.0026±0.0004Na=0.9521N/(1+0.0025N)0.96704th instar J140.9992±0.05250.0043±0.0010Na=0.9992N/(1+0.0045N)0.9716

攝取轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的生物可能將未改變的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物從植物傳遞給捕食者，而且生物能夠通過自身的代謝潛在改變其生物化學(xué)活性并對(duì)捕食者產(chǎn)生某些不利的影響(Andow & Hilbeck，2004)，其中包括對(duì)捕食性天敵捕食能力及功能反應(yīng)的影響。功能反應(yīng)(functional response)是捕食者對(duì)獵物的捕食效應(yīng)，指環(huán)境中獵物密度的變化使獵物捕食率發(fā)生改變的一種反應(yīng)，可用于鑒別捕食者對(duì)獵物的選擇性以及生物防治中對(duì)敵害控制作用和轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的指標(biāo)(Fernandez-arhex & Corley,2003; Murdochetal.,2003)。謝修慶等(2012)利用轉(zhuǎn)Bt基因棉花、轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因棉花、常規(guī)棉為材料，研究了取食不同棉花品種的棉蚜對(duì)龜紋瓢蟲1～4齡幼蟲功能反應(yīng)的影響，結(jié)果表明龜紋瓢蟲對(duì)不同品種棉花上棉蚜的捕食量隨獵物密度的增加而增大，均符合HollingⅡ圓盤方程，但對(duì)來自轉(zhuǎn)基因棉田蚜蟲的捕食量大多高于常規(guī)棉田，表明龜紋瓢蟲對(duì) Bt棉上的棉蚜并不存在排斥性。中華草蛉對(duì)取食轉(zhuǎn)基因棉的甜菜夜蛾的捕食功能反應(yīng)研究結(jié)果表明，與常規(guī)棉相比，中華草蛉對(duì)用轉(zhuǎn)基因棉處理的甜菜夜蛾的捕食量和捕食效率均高于對(duì)照，但其捕食功能反應(yīng)均符合HollingⅡ型(施敏娟等，2011)。

本研究表明，各齡期異色瓢蟲幼蟲對(duì)飼喂不同棉花初孵棉鈴蟲捕食功能反應(yīng)均符合HollingⅡ圓盤方程，與常規(guī)棉相比，飼喂取食轉(zhuǎn)Cry1Ac/1Ab基因棉花棉鈴蟲對(duì)異色瓢蟲捕食功能無顯著差異。但本研究是在室內(nèi)條件下進(jìn)行的，由于棉田自然環(huán)境因素復(fù)雜，害蟲種類繁多，溫度、濕度、光周期等多種因子在天敵捕食害蟲過程起到某些干擾作用。因此，需進(jìn)一步在棉田環(huán)境條件下研究異色瓢蟲對(duì)棉鈴蟲的捕食能力；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因棉對(duì)其他天敵的影響還應(yīng)進(jìn)一步研究與完善。