蔣宇峰，朱堯焓，陳 剛，何立群*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021；2.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）是目前臨床上常見疾患，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，全球成人慢性腎臟病的男女發(fā)病率分別高達(dá)10.4%和11.8%，可見積極防治CKD有重要現(xiàn)實(shí)意義。慢性腎臟病到終末期腎衰主要病理基礎(chǔ)就是腎纖維化，其確切的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確。MicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性非編碼短RNA，它通過在轉(zhuǎn)錄之前抑制靶mRNA 達(dá)到抑制基因表達(dá)的能力。在腎臟疾患中miRNA 與腎臟病變、穩(wěn)態(tài)及生理功能等緊密相連[2]。在腎纖維化研究中TGF-β/Smad 信號(hào)通路是最經(jīng)典主要的通路，據(jù)文獻(xiàn)研究[3]提示 miRNA 在 TGF-β介導(dǎo)的纖維化中起重要作用。本研究試通過阿霉素腎病大鼠這個(gè)平臺(tái)，來探討miRNA在抗腎纖維化中的作用，提供中藥復(fù)方抗纖靈的治療靶點(diǎn)和機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量（200±20）g，清潔級(jí)，上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房提供，實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 抗纖靈方組成：丹參15 g，制大黃15 g，黃芪15 g，牛膝15 g，桃仁15 g，淫羊藿15 g組成。藥物購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房，按比例稱取，水煎濃縮，冰箱保存?？扑貋啠?.1 g/片，默沙東公司提供，灌胃前用蒸餾水配制成混懸液。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及分組方法 48只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，其中8只為假手術(shù)對(duì)照組，僅以打開腹腔，切除右腎，注射同等量生理鹽水對(duì)照為主。余下采用右腎摘除加重復(fù)注射阿霉素的腎衰竭腎纖維化動(dòng)物模型。常規(guī)手術(shù)右腎摘除術(shù)后一周，予阿霉素5 mg/kg尾靜脈注射，術(shù)后4周重復(fù)注射阿霉素3 mg/kg。術(shù)后6周內(nèi)采血，然后根據(jù)肌酐水平隨機(jī)分成5組：模型組，科素亞組，抗纖靈組低劑量組，中劑量組，高劑量組，每組各8只大鼠。

2.2 給藥方法 假手術(shù)對(duì)照組，模型組給予2 mL生理鹽水灌胃，抗纖靈組低，中，高劑量組分別灌服抗纖靈藥液2 mL，低，中，高劑量大鼠分別分別以60 kg體質(zhì)量成人單位劑量的10倍，20倍，30倍，給藥劑量相當(dāng)于 15 g/（kg·d）、30 g/（kg·d）、45 g/（kg·d），對(duì)照組科素亞2 mL，劑量33.3 mg/（kg·d），灌胃1次/d，共56 d。

2.3 收集腎組織標(biāo)本和血、尿標(biāo)本 6組大鼠連續(xù)給藥56 d后，在處死前1 d收集24 h尿量，統(tǒng)計(jì)尿蛋白定量。處死大鼠時(shí)，通過采血腹主動(dòng)脈3～5 mL后，摘除左腎，清洗后，放入液氮保存，便于后序相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 檢測(cè)指標(biāo) 大鼠腎組織TGF-β，Smad3的表達(dá)水平采用熒光定量PCR法。取大鼠腎臟組織，以Trizol法抽提RNA。逆轉(zhuǎn)錄操作生成cDNA，進(jìn)行熒光定量操作，循環(huán)參數(shù)如下：95℃，5 min預(yù)變性；95℃，5 s變性，60℃退火30 s，40次循環(huán)。所得CT值以2-△△Ct計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

Trizol試劑盒提取大鼠腎臟RNA，根據(jù)SMARTer smRNA-Seq Kit for Illumina說明書進(jìn)行文庫(kù)制備，將樣品送至蘇州金唯志生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用FastQC來對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，比對(duì)大鼠miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（Rnor_mir/rno.gff3），對(duì)miRNA進(jìn)行表達(dá)定量。對(duì)差異表達(dá)的基因（DEGs）數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，生成主成分分析圖（PCA）和熱圖（HCA）。

Keywords:Kangxianling Decoction；renalfibrosis；adriamycin nephropathy；profiles of miRNA expression

3 結(jié)果

3.1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 見圖1。

圖1 Smad3和TGF-β1結(jié)果比較

由圖1可見，與假手術(shù)組相比，模型組及治療組腎臟組織中TGF-β1、Smad3基因表達(dá)均有明顯升高，差異具有顯著意義（P＜0.05）。與模型組相比，科素亞治療組和抗纖靈治療組腎臟中TGF-β1、Smad3表達(dá)量降低，其中科素亞治療組具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），抗纖靈隨著用藥劑量的增加，差異開始顯現(xiàn)（P＞0.05，P＜0.05，P＜0.001）。

3.2 主成分分析/聚類分析 見圖2。

圖2 主成分分析

在PC1層面，假手術(shù)組（NC）和模型組（OC）相距最遠(yuǎn)，表示NC組和OC組樣本的生物學(xué)差異較大，其他組（治療組）則介于NC和OC的中間位置，高抗纖靈組（HK）與假手術(shù)組（NC）最接近。

3.3 HCA聚類匹配 見圖3。

圖3 HCA聚類分析

HCA聚類分析如圖3所示，從聚類關(guān)系上，OC組獨(dú)立于其他分組聚到一起，說明腎纖維化的建模取得了成功，其他治療組在一定程度上都起到了腎臟的修復(fù)的作用；其中HK組整體上與NC組跟接近，KS組次之，MK和LK的聚類更遠(yuǎn)。

3.4 miRNA差異表達(dá)分析 見圖4。

圖4 與模型組差異表達(dá)的miRNA數(shù)目比較

我們將假手術(shù)組（NC）和藥物處理組（HK，MK，LK，KS）的miRNA表達(dá)譜分別與模型組（OC）進(jìn)行了比較。采用基因表達(dá)倍數(shù)變化大于1.5和t檢驗(yàn)，P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。并對(duì)差異表達(dá)基因的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。縱坐標(biāo)表示差異表達(dá)基因數(shù)量，數(shù)量越多，差異越大。從圖4中可以看出，NC組與OC組的差異最大，其次是高劑量治療組（HK），再次是KS組和MK，LK組與OC組的差異較小。

4 討論

腎纖維化是各種原因引起終末期腎?。‥SRD）的的共同病理基礎(chǔ)，早期延緩，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，尚缺乏有效生物診斷早期標(biāo)志物和治療手段，TGF-β/Smads是公認(rèn)促腎纖維化最主要的信號(hào)通路[4]，miRNAs 的發(fā)現(xiàn)為評(píng)估及治療為腎纖維化提供了全新的視角和方向。miRNAs 是一類長(zhǎng)度約22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用。miRNAs在腎臟纖維化發(fā)展過程中存在異常表達(dá)，提示它可能參與腎臟纖維化的過程并起到重要作用[5]。

腎纖維化中TGF-β1是最重要的促纖維細(xì)胞因子[6]，其受體效應(yīng)蛋白Smad在腎纖維化中也起到重要作用，Smad3 作為通路限制性分子之一，被TGF-β1激活，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)[7]。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組TGF-β1、Smad3基因表達(dá)均有升高，經(jīng)治療后比較，TGF-β1、Smad3表達(dá)量降低，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中抗纖靈隨著用藥劑量的增加，差異開始顯現(xiàn)顯著，提示治療效果的不斷好轉(zhuǎn)，推測(cè)通過抑制TGF-β1表達(dá)，下調(diào)Smad3，從而調(diào)節(jié)靶蛋白（如ECM）的表達(dá)，達(dá)到減輕 ECM 聚積，延緩腎硬化的的發(fā)生。

本研究通過miRNA表達(dá)譜主成分分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)譜相似的樣本會(huì)被聚集在一起。NC組（空白）和OC組（模型組）相距最遠(yuǎn)，兩者的生物學(xué)差異較大，其中高纖靈組其表達(dá)譜位置較中纖靈組，科素壓組位置與空白組相距位置更為接近，從而提示高纖靈組具有更好的療效。同樣通過HCA聚類匹配分析發(fā)現(xiàn)，NC組的聚類與HK（高劑量）組最為接近，說明高劑量的抗纖靈治療更接近空白對(duì)照，其對(duì)腎臟的修復(fù)程度最好，而KS（科素亞組），MK（中劑量組）則效果次之。通過miRNA表達(dá)譜差異表達(dá)分析， NC組與OC組的差異最大，其次是高劑量治療組（HK），再次是KS組，最后是MK組；MK組與OC組的差異較小，說明高劑量治療組的基因表達(dá)譜變化最接近空白對(duì)照組變化，提示藥物處理劑量越大，樣本的表達(dá)譜越與對(duì)照NC組相近，表明隨著劑量增大抗纖維化的效果越好。

抗纖靈方為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院何立群教授的經(jīng)驗(yàn)方，該方以活血化瘀，補(bǔ)腎益氣為治則，與慢性腎衰的中醫(yī)病機(jī)，正氣虧虛，氣虛血滯，絡(luò)脈瘀阻的不謀而合。方中黃芪補(bǔ)氣升陽，仙靈脾溫陽補(bǔ)腎，兩者為君藥；丹參益氣活血，桃仁祛瘀活血，牛膝補(bǔ)腎活血，此三藥為臣；制大黃清熱泄?jié)峄钛?，為本方佐藥?？估w靈方以活血為主，兼以扶正泄?jié)?，攻補(bǔ)兼施，使瀉而不傷正，補(bǔ)而不滯邪。該方在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究抗腎纖維化取得較好療效[8-9]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗纖靈方治療后，無論是在TGF-β1/Smad3 mRNA的表達(dá)，還是miRNA表達(dá)譜的差異改變，抗纖靈都呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，表明腎臟的纖維化程度改善跟抗纖靈劑量大小有關(guān)，同時(shí)其中顯現(xiàn)的差異基因有待進(jìn)一步通過后續(xù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證。

綜上所述，抗纖靈方通過益氣活血補(bǔ)腎作用，減少TGF-β1、Smad3基因表達(dá)，而起到抗腎纖維化作用，保護(hù)腎臟。推測(cè)其機(jī)理可能通過調(diào)節(jié)miRNA譜改變，來發(fā)揮作用，并且抗纖維化作用與劑量呈依賴關(guān)系。