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(1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院,江蘇南京 210097; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095; 3.江蘇省生產(chǎn)力促進(jìn)中心,江蘇南京 210042)

貴州臘肉是一種以鮮(凍)豬肉為原料,配以各種調(diào)味料,經(jīng)腌制、脫水(晾曬或風(fēng)干)、煙熏(或不煙熏)等工藝加工而成的生肉制品[1]。一般產(chǎn)品表面色澤金黃,肉身干燥,肥膘透明,能較長時間保存且不易腐敗,其獨特的腌臘風(fēng)味深受消費者喜愛。作為一種極具地方特色的傳統(tǒng)美食長期流行于我國貴州省等西南地區(qū)。

臘肉的成熟主要是在內(nèi)源酶系的作用下使蛋白質(zhì)和脂肪等大分子營養(yǎng)物質(zhì)充分水解,其中水解產(chǎn)物小肽、游離氨基酸和游離脂肪酸是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)[2-3]。傳統(tǒng)的臘肉加工經(jīng)腌制后在自然條件下使臘肉緩慢風(fēng)干成熟,生產(chǎn)周期較長。為縮短生產(chǎn)周期,現(xiàn)代工廠一般采用高溫(60 ℃)烘干替代自然風(fēng)干,生產(chǎn)周期控制在2～3 d[4-5]。但豬肉中內(nèi)源酶系的活性在高溫下容易受到抑制,使臘肉中蛋白質(zhì)水解度下降,風(fēng)味和滋味物質(zhì)含量顯著降低[6-7],此外干腌肉制品中的脂肪和蛋白質(zhì)在高溫下容易加速氧化使產(chǎn)品風(fēng)味劣變[8]。因此,在臘肉中添加外源酶以替代內(nèi)源酶促進(jìn)蛋白質(zhì)水解形成風(fēng)味前體物質(zhì),同時提高產(chǎn)品的抗氧化穩(wěn)定性,在臘肉的現(xiàn)代化工藝改造過程中顯得尤為重要。朱建軍等[9]將木瓜蛋白酶和中性蛋白酶應(yīng)用于臘肉中,發(fā)現(xiàn)外源酶有效提高了蛋白質(zhì)的分解速度,提高風(fēng)味物質(zhì)的含量;Fernandez等[10]將胰脂酶添加到發(fā)酵香腸中,可以短時間內(nèi)提升產(chǎn)品風(fēng)味。穆建穩(wěn)等[11]在臘牛肉腌制中將中性蛋白酶摻入腌制劑中腌制7 d,發(fā)現(xiàn)肌肉蛋白質(zhì)在酶的作用下發(fā)生了強(qiáng)烈降解。在一定的添加范圍內(nèi),降解程度隨著酶添加量增大而提高。

風(fēng)味蛋白酶由米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生,同時具備內(nèi)切酶和外切酶活性,是一種廣泛運(yùn)用的商業(yè)酶[12-13]。用風(fēng)味蛋白酶水解花生蛋白[14]、鯉魚蛋白[15]、油菜籽蛋白[16]等,水解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗氧化活性,該酶被廣泛用于干腌發(fā)酵香腸[17]、腌臘雞腿肉[18]等的風(fēng)味改良,且對加速奶酪[19]的成熟效果顯著。目前尚未發(fā)現(xiàn)風(fēng)味蛋白酶在貴州臘肉成熟過程中應(yīng)用的相關(guān)報道,風(fēng)味蛋白酶促進(jìn)臘肉蛋白質(zhì)水解,影響臘肉抗氧化穩(wěn)定性的研究也不多見,本研究旨在通過在貴州臘肉腌制過程中添加不同劑量的風(fēng)味蛋白酶,以期增加臘肉中蛋白質(zhì)水解度、游離氨基酸含量等,增強(qiáng)產(chǎn)品抗氧化穩(wěn)定性和提升感官品質(zhì),以彌補(bǔ)高溫工藝對臘肉品質(zhì)的損害,使經(jīng)高溫快速成熟工藝制作的臘肉在最大程度上保留傳統(tǒng)貴州臘肉的感官品質(zhì),為貴州臘肉產(chǎn)品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化生產(chǎn)提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮五花肉(黑豬,取自同一頭豬胴體) 南京雨潤食品有限公司;風(fēng)味蛋白酶(1.5×104U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;三氯乙酸 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;硫代巴比妥酸(TBA) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

ESK125型真空滾揉機(jī) 德國VAKONA CmbH公司;DC800-FB-E型真空包裝機(jī) 希悅爾(中國)有限公司;V-5000可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;L8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司;JA2103N型精密天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;電熱烤箱 德國CONVOTHERM公司;CR-410型色差儀 柯尼卡美能達(dá)(中國)投資有限公司;L-3000型全自動氨基酸分析儀 蘇州華美辰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臘肉的加工工藝 豬五花肉除去筋膜,修整成規(guī)則的長條形,長15～20 cm,寬5～7 cm,厚3～4 cm。輔料(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):白砂糖1%,葡萄糖0.5%,食鹽2%,曲酒0.6%,味精0.1%,亞硝酸鈉0.001%,水5%,配制成腌制液。實驗組F2、F4、F6分別在腌制液中加入2.0×105、4.0×105、6.0×105U/kg的風(fēng)味蛋白酶[3,12]。對照組(CT)為傳統(tǒng)工藝自然風(fēng)干至水分含量≤25%的貴州臘肉(春秋季一般為25～30 d)?？瞻捉M(NT)不添加風(fēng)味蛋白酶經(jīng)60 ℃烘干至水分含量≤25%的貴州臘肉(一般為24～28 h)。

加工工藝流程:

1.2.2 取樣 臘肉成品真空包裝后4 ℃冰箱冷藏24 h,每組隨機(jī)取5塊臘肉進(jìn)行檢測,其中脂肪氧化指標(biāo)(酸價、過氧化值和丙二醛含量)測定選取臘肉中肥肉部位進(jìn)行測定,其它指標(biāo)均選取臘肉中瘦肉部位進(jìn)行測定,臘肉取樣部位盡可能保持一致,以減少取樣環(huán)節(jié)對實驗結(jié)果造成的影響。

1.2.3 臘肉水分含量、水分活度及pH測定 臘肉中水分含量測定按照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn):食品中水分的測定》[20]直接干燥法進(jìn)行;臘肉水分活度測定采用水分活度測定儀在25 ℃下進(jìn)行。pH值測定按照GB 5009.237-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn):食品pH的測定》[21]。每個樣品設(shè)三個平行,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.4 臘肉蛋白質(zhì)水解度的測定 蛋白質(zhì)水解度以臘肉中氨基酸態(tài)氮和總氮的比值表示,氨基酸態(tài)氮的測定按照GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn):食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[22]中的酸度計法進(jìn)行;總氮測定(total nitrogen,TN)按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn):食品中蛋白質(zhì)的測定》[23]中的凱氏定氮法進(jìn)行。

1.2.5 游離氨基酸的測定 按照GB5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸含量的測定》[24]利用氨基酸分析儀進(jìn)行測定,略有修改。具體操作簡述如下:稱取臘肉樣品1.00 g于水解管中,加入10 mL 6 mol/L的鹽酸,4滴苯酚,放入冷凍劑中冷凍5 min,抽真空后充入氮氣重復(fù)三次,在第三次充氮氣時封口,封口后的水解管置于110 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)恒溫水解22 h,取出冷卻至室溫。水解液經(jīng)中速定性濾紙過濾,濾液用50 mL容量瓶定容,取1 mL濾液于試管中,在離心濃縮儀上蒸干,加入1 mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖液,振蕩溶解均勻,通過0.22 μm濾膜,濾液為待測液。色譜柱為磺酸型陽離子樹脂,2.6×150 mm;可見光檢測器,波長570、440 nm;流動相為檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖液;流速225 μL/min;進(jìn)樣量50 μL。

1.2.6 臘肉中多肽提取與抗氧化活性的測定 臘肉中多肽的提取參照王雪芹的試驗方法[25]并略作修改,具體如下:取各組臘肉樣品10.00 g,加入35 mL pH7.2的磷酸緩沖液,冰浴下高速均質(zhì)2 min,經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心20 min(4 ℃,30000 r/min),取上清液,上清液通過5000 Da超濾膜,濾出液為多肽提取液,用1 mol/L NaOH調(diào)至pH7.2,凍干保存,使用時用去離子水配制成濃度為1 mg/mL多肽液。

多肽提取液OH·自由基清除力測定結(jié)合Yildirim等[26]和You等[27]的方法并作適當(dāng)修改。取各實驗組多肽提取液各1 mL,加入0.5 mL 2 mmol/L EDTA-Fe溶液,1 mL磷酸鹽緩沖液(150 mmol/L,pH7.4),1 mL番花紅(360 μg/mL),1 mL 3% H2O2,在渦旋混合器上混合均勻,37 ℃水浴30 min,520 nm比色,測定吸光值?？瞻捉M用緩沖液替代多肽液,對照用緩沖液替代多肽液和過氧化氫,每個濃度做3個平行,結(jié)果用清除率(E)表示。

1.2.7 蛋白羰基含量的測定 臘肉中蛋白提取參考曹云剛[28]的試驗方法并略作修改:稱取3.00 g臘肉,加入30 mL 0.15 mol/L的KCl溶液,均質(zhì)1 min,取200 μL均質(zhì)液于1 mL棕色離心管中,加入0.5 mL 20%(w/v)三氯乙酸,旋渦混合均勻,30000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀為蛋白提取物,加入適量KCl溶液溶解蛋白,調(diào)整蛋白濃度為20 mg/mL。

臘肉中蛋白羰基含量測定參考Li等[29]方法并略作修改:準(zhǔn)確吸取200 μL蛋白提取液于2 mL棕色塑料離心管中,加入0.5 mL 10 mmol/L DNPH,室溫下避光反應(yīng)1 h,加入0.5 mL 20%三氯乙酸渦旋混勻,終止反應(yīng),30000 r/min離心5 min,沉淀經(jīng)1 mL洗液(乙醇/乙酸乙酯等體積混合)充分洗滌后,同樣條件下離心,重復(fù)三次。沉淀洗滌后晾干,加入1.5 mL 6 mol/L 鹽酸胍溶液,50 ℃ 水浴30 min,30000 r/min離心10 min。上清液于370 nm比色測定羰基含量,280 nm比色測定蛋白含量(以 BSA 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)。羰基含量采用摩爾消光系數(shù)進(jìn)行計算。同時做樣品空白。計算公式如下:

A=εbc

其中:ε為摩爾消光系數(shù)22000,b為光程長度1 cm,c為溶液濃度(mol/L)

1.2.8 脂肪氧化指標(biāo)的測定 臘肉酸價測定按照GB5009.229-2016 食品中酸價的測定[30]冷溶劑滴定法進(jìn)行。過氧化值測定按照國標(biāo)GB5009.227-2016 食品中過氧化值的測定[31]滴定法進(jìn)行。丙二醛含量測定,按照國標(biāo)GB5009.181-2016 食品中丙二醛的測定[32]分光光度法進(jìn)行。

1.2.9 臘肉硬度測定 各組臘肉樣品放置到室溫后切割成8 cm×8 cm×5 mm的臘肉片,分別裝入聚乙烯包裝袋中,用真空包裝機(jī)抽真空并封口,在水浴鍋中72 ℃水浴20 min[13],取出,用質(zhì)構(gòu)儀測定硬度。測試方法選擇“壓縮試驗”,選用2 mm柱狀不銹鋼探頭,觸發(fā)值5 g,測試速度30 mm/min,返回速度為最大速度,目標(biāo)值“形變量60%”,每組樣品測5組數(shù)據(jù)[33]。

1.2.10 感官評定 感官評定參照GB/T 22210-2008 肉與肉制品感官評定規(guī)范[34]進(jìn)行,由實驗室10位接受過專業(yè)訓(xùn)練的實驗員組成感官評定小組,采用9分嗜好法[35]進(jìn)行評價。評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SAS 8.12進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(p<0.05),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 臘肉水分含量、水分活度及pH分析

各組臘肉水分含量、水分活度和pH測定結(jié)果如表2所示,5組臘肉分別經(jīng)風(fēng)干或高溫烘干脫水后水分含量都控制在24%～25%之間,水分活度在0.65左右,各組間沒有顯著差異(p>0.05)。NT組與CT組相比pH顯著下降(p<0.05),這主要是由于脂肪在烘烤或高溫處理下會加速氧化使產(chǎn)品pH下降[10,36],脂肪酸價測定實驗結(jié)果也驗證了這一點。實驗組中加入風(fēng)味蛋白酶后pH與CT組相比也顯著下降(p<0.05)。這主要是由于風(fēng)味蛋白酶在促進(jìn)臘肉蛋白質(zhì)水解過程中釋放出H+導(dǎo)致的[37]。

表2 風(fēng)味蛋白酶添加量對貴州臘肉 水分含量、水分活度、pH的影響Table 2 Effect of flavourzyme levels on moisture content, water activity(Aw)and pH values of Guizhou bacon

2.2 風(fēng)味蛋白酶對臘肉蛋白質(zhì)的水解作用

2.2.1 風(fēng)味蛋白酶對臘肉蛋白質(zhì)水解度的影響 各組臘肉蛋白質(zhì)水解度測定結(jié)果如表3,總氮含量在各組間沒有顯著差異(p>0.05),NT組非蛋白氮含量和水解度顯著低于CT組(p<0.05),表明高溫快速成熟工藝使臘肉蛋白質(zhì)水解度顯著下降。在加入風(fēng)味蛋白酶后臘肉中非蛋白氮含量與蛋白質(zhì)水解度顯著上升(p<0.05),當(dāng)風(fēng)味蛋白酶添加量分別為2×105、4×105、6×105U/kg時,臘肉非蛋白氮依次達(dá)到5.25、6.35、7.18 g/100 g,水解度依次為16.76%、20.72%和23.70%,且添加風(fēng)味蛋白酶的3組臘肉非蛋白氮與蛋白質(zhì)水解度均顯著高于CT組,在實驗范圍內(nèi)臘肉中非蛋白氮含量的增加與風(fēng)味蛋白酶添加量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)R2=0.9524。結(jié)果表明在高溫快速成熟工藝中使用風(fēng)味蛋白酶能有效促進(jìn)臘肉蛋白質(zhì)水解,添加量為2×105U/kg時,蛋白質(zhì)水解度已顯著高于CT組(p<0.05)。

表3 風(fēng)味蛋白酶添加量對臘肉蛋白質(zhì)水解度的影響Table 3 Effects of flavourzyme levels on degree of hydrolysis

2.2.2 風(fēng)味蛋白酶對臘肉中游離氨基酸含量的影響 臘肉中游離氨基酸測定結(jié)果如表4,NT組16種游離氨基酸含量顯著低于CT組,說明高溫快速成熟工藝使貴州臘肉中游離氨基酸含量降低,這可能與內(nèi)源蛋白酶活性受到抑制導(dǎo)致臘肉中蛋白質(zhì)水解度下降有關(guān)[6-7]。在臘肉中加入風(fēng)味蛋白酶后游離氨基酸含量顯著提高,且隨風(fēng)味蛋白酶添加量的增加,16種游離氨基酸含量也顯著增加。當(dāng)風(fēng)味蛋白酶添加量達(dá)到2×105U/kg時,臘肉中16種游離氨基酸含量顯著(p<0.05)高于CT組。

表4 風(fēng)味蛋白酶添加量對臘肉中游離氨基酸含量的影響Table 4 Effects of flavourzyme levels on free amino acid(FAA)

風(fēng)味蛋白酶運(yùn)用在花生蛋白[14]、鯉魚蛋白[15]水解中也能顯著提高水解液游離氨基酸的含量。游離氨基酸是重要的滋味物質(zhì)也是形成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要前體,它們?nèi)菀着c糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生風(fēng)味化合物[38],對臘肉的感官品質(zhì)有重要作用。

2.3 風(fēng)味蛋白酶對臘肉氧化穩(wěn)定性的影響

實驗結(jié)果如表5所示,加入風(fēng)味蛋白酶后,臘肉多肽提取液清除羥自由基的能力增強(qiáng),且風(fēng)味蛋白酶添加量越高,羥自由基清除力越強(qiáng)。臘肉經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解后表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性主要是由于水解過程中產(chǎn)生的芳香族氨基酸可以提供H+,使自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減慢或終止[40]。也有研究認(rèn)為富含疏水性氨基酸或含硫氨基酸的多肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性,如鮐魚蛋白、豌豆蛋白經(jīng)風(fēng)味蛋白酶水解后多肽提取液抗氧化活性提高,能有效清除·OH、DPPH·、ABTS+·等自由基[25,39]。NT組蛋白羰基含量和脂肪酸價、過氧化值、硫代巴比妥酸值都顯著高于CT組(p<0.05),表明高溫快速成熟工藝使臘肉中蛋白質(zhì)和脂肪氧化加劇[41],加入風(fēng)味蛋白酶后蛋白羰基含量和脂肪酸價、過氧化值、硫代巴比妥酸值顯著下降(p<0.05),表明風(fēng)味蛋白酶可以提高臘肉生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)和脂肪的氧化穩(wěn)定性。這一方面是由于風(fēng)味蛋白酶使臘肉中產(chǎn)生更多具有抗氧化活性的小肽,另一方面也有可能是由于水解臘肉蛋白產(chǎn)生的小肽能在脂質(zhì)體表面形成物理壁壘,阻礙氧化劑的滲入和擴(kuò)散[39],從而增強(qiáng)了臘肉中蛋白質(zhì)和脂肪的氧化穩(wěn)定性。

表5 風(fēng)味蛋白酶添加量對臘肉抗氧化活性以及蛋白質(zhì)和脂肪氧化程度的影響Table 5 Effect of flavourzyme levels on the antioxidant activity of peptide extraction and protein and lipid oxidation in Guizhou bacon

2.4 風(fēng)味蛋白酶對臘肉硬度及感官品質(zhì)的影響

各組臘肉硬度測定結(jié)果如表6所示,NT組硬度顯著高于CT組(p<0.05),這可能與NT組蛋白水解度過低有關(guān)[13]。加入風(fēng)味蛋白酶后硬度顯著降低,且不同劑量組間有顯著差異,其變化趨勢與蛋白質(zhì)水解度相同。這與Benito等[42]和張思宇等[13]研究結(jié)果相似。風(fēng)味蛋白酶對臘肉硬度的影響主要是由蛋白酶對肌原纖維的水解作用以及對蛋白持水性的影響造成的[42]。但是過度的蛋白水解(6×105U/kg)使臘肉硬度過低,反而使貴州臘肉的食用品質(zhì)下降。

表6 風(fēng)味蛋白酶添加量對臘肉硬度與感官品質(zhì)的影響Table 6 Effect of flavourzyme levels on hardness and sensory quality of Guizhou bacon

感官評分包括色澤、口感、氣味、滋味和總體可接受度,對五組貴州臘肉評分結(jié)果(表6)表明風(fēng)味蛋白酶添加量為2×105U/kg(F2組)時臘肉感官品質(zhì)最好,與CT組相比沒有顯著差異,有明顯的貴州臘肉特征風(fēng)味。NT組和風(fēng)味蛋白酶添加量為4×105U/kg(F4)組與CT組臘肉相比,在氣味上有顯著差異(p<0.05),但總體可接受度尚可。風(fēng)味蛋白酶添加量為6×105U/kg(F6)組與傳統(tǒng)貴州臘肉(CT組)在口感、氣味、滋味上均有顯著差異(p<0.05),尤其是在口感上與傳統(tǒng)臘肉軟硬適中的口感相比過于柔軟,硬度只有CT組的59.4%,咀嚼性較差,臘肉食用品質(zhì)較低,總體可接受度較差。

3 結(jié)論

風(fēng)味蛋白酶可以有效促進(jìn)貴州臘肉蛋白質(zhì)的水解,提高臘肉中游離氨基酸含量。風(fēng)味蛋白酶水解臘肉蛋白有較強(qiáng)的抗氧化活性,能有效清除臘肉中的·OH,能顯著提高臘肉在高溫快速成熟工藝中的氧化穩(wěn)定性,使蛋白羰基含量、脂肪酸價和過氧化值顯著降低。當(dāng)風(fēng)味蛋白酶添加量為2×105U/kg時,臘肉的風(fēng)味和滋味特征與傳統(tǒng)貴州臘肉沒有顯著差異(p<0.05),當(dāng)風(fēng)味蛋白酶添加量為4×105U/kg時,臘肉的風(fēng)味和滋味特征與傳統(tǒng)貴州臘肉有顯著差異,風(fēng)味蛋白酶添加量為6×105U/kg時臘肉蛋白因水解過度硬度和咀嚼性過低嚴(yán)重影響食用品質(zhì)。風(fēng)味蛋白酶在貴州臘肉高溫快速成熟工藝中的適宜用量為2×105U/kg原料,配制在腌制液中添加,臘肉蛋白質(zhì)水解度、蛋白質(zhì)和脂肪氧化穩(wěn)定性均顯著高于傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的臘肉,感官品質(zhì)與傳統(tǒng)臘肉相比沒有顯著差異。