石金敏 ，張彩光，周 燦，王 佳，余文鋒,余緒明*

（1.十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院） 藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

葛根散是由甘草、干葛花、葛根、縮砂仁、貫眾等5種中藥材組成，出自《儒門事親》卷十二，用于治療飲酒過度，酒毒內(nèi)蘊(yùn)者[1-3]。該制劑除貫眾外均為藥食兩用藥材，有研究表明，葛根素和大豆苷為其主要活性成分[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)首次建立了同時(shí)測(cè)定葛根素和大豆苷2種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法，可用于葛根散的質(zhì)量控制，亦為進(jìn)一步開發(fā)保健品提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AT、LC-20A高效液相色譜儀；分析天平（FA2004，上海天平儀器廠）。

葛根素（批號(hào)：110752-201615）、大豆苷（批號(hào)：111738-201603），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；葛根散（我院制劑室制備的水煎合劑，批號(hào)：20180107，20180108，20180109）。乙腈（色譜純），水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果[5-9]

2.1 色譜條件

色譜柱Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（10:90）；流速1.00 ml/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣10 μl，葛根素和大豆苷檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；在此條件下，葛根素和大豆苷色譜峰分離度，峰形等均符合要求。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取葛根素、大豆苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加水制成每1 ml含28，16 μg溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品1 ml，置入10 ml量瓶，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系、定量限考察

取葛根素、大豆苷對(duì)照品適量，精密稱定，置入10 ml量瓶，加水溶解并添加至刻度，搖勻，用水逐級(jí)稀釋，分別得葛根素對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為90，45，22.5，11.3，5.6，2.8，1.4 μg/ml，大豆苷對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為160，80，40，20，10，5，2.5 μg/ml。精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程分別為葛根素Y=66 104X+2578.4，r=1.0000；大豆苷Y=33 647X+5873.4，r=1.0000；結(jié)果表明，葛根素、大豆苷進(jìn)樣濃度分別在1.4～90 μg/ml、2.5～160 μg/ml之間與峰面積線性關(guān)系良好。葛根素、大豆苷定量限分別為0.175，0.8 μg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)20180107）10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算葛根素、大豆苷峰面積RSD值分別為0.51%，0.69%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液（批號(hào)20180107），測(cè)定峰面積，計(jì)算葛根素和大豆苷含量，RSD值分別為0.70%，0.85%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

由不同人員分別在不同日期和不同儀器設(shè)備，精密量取葛根散樣品（批號(hào)20180108），按2.3項(xiàng)方法制成供試品溶液，平行6份，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果葛根素和大豆苷RSD值分別為1.54%，1.89%，表明中間精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)20180107）10 μl，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣10 μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD分別為1.19%，0.94%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法，精密量取同一樣品（批號(hào)20180107）6份，加入適量葛根素、大豆苷對(duì)照品，依據(jù)2.3項(xiàng)制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，得平均加樣回收率分別為97.57%，99.64%，RSD分別為1.75%，1.96%。表明方法回收率較好。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.10 樣品測(cè)定

精密量取3批葛根散樣品，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算3批制劑中葛根素、大豆苷含量，結(jié)果見表2。

表2 葛根散樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.11 耐用性試驗(yàn)

2.11.1 檢測(cè)波長(zhǎng)耐用性試驗(yàn) 調(diào)整檢測(cè)波長(zhǎng)分別245，250，255 nm，其余按2.1項(xiàng)方法測(cè)定，葛根素含量為0.447，0.449，0.390 mg/ml，大豆苷含量為0.0910，0.0924，0.0891 mg/ml。

2.11.2 流動(dòng)相pH耐用性試驗(yàn) 調(diào)整流動(dòng)相pH為1.93，2.13，2.33，其余按2.1項(xiàng)方法測(cè)定，葛根素含量為0.452，0.449，0.448 mg/ml，大豆苷含量為0.0927，0.0924，0.0931 mg/ml。

2.11.3 流動(dòng)相比例耐用性試驗(yàn) 調(diào)整流動(dòng)相比例9:91，10:90，11:89，其余按2.1項(xiàng)方法測(cè)定，葛根素含量為0.448，0.449，0.449 mg/ml，大豆苷含量為0.0924，0.0924，0.0926 mg/ml。

2.11.4 流速耐用性試驗(yàn) 調(diào)整流速0.80，1.00，1.20 ml/min，其余按2.1項(xiàng)方法測(cè)定，葛根素含量為0.561，0.449，0.375 mg/ml，大豆苷含量為0.1153，0.0924，0.0772 mg/ml。

2.11.5 柱溫耐用性試驗(yàn) 調(diào)整柱溫30，35，40 ℃，其余按2.1項(xiàng)方法測(cè)定，葛根素含量為0.452，0.449，0.448 mg/ml，大豆苷含量為0.0930，0.0924，0.0927 mg/ml。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

最初嘗試甲醇-水（25:75）[10]，發(fā)現(xiàn)峰形不好，拖尾嚴(yán)重，故嘗試乙腈-0.1%磷酸水11:89、12:88和10:90，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（10:90）時(shí)分離度，峰形等較好，故選擇其作為流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行紫外掃描，葛根素、大豆苷的最大吸收波長(zhǎng)均為250 nm，故 HPLC 法測(cè)定采用250 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2018年6月1日新的國(guó)家食品藥品監(jiān)督管局發(fā)布2018年27號(hào)公告《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定》，標(biāo)志著古代經(jīng)典名方的注冊(cè)審批終于落地，有利于古代經(jīng)典名方制劑繁榮發(fā)展。本文首次建立HPLC法測(cè)定出自于《儒門事親》的葛根散中葛根素、大豆苷的含量，為其注冊(cè)審批提供理論支持，進(jìn)一步為葛根散或治療酒毒保健品的質(zhì)量控制提供參考。