畢春艷，薛劍橋，翟兆玲

（淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086）

退黃保肝膠囊是由赤芍、茵陳、白術、枳殼、梔子、郁金、丹參、金錢草等十五味藥組成，有疏肝健脾，清利濕熱，利膽退黃的作用，用于急慢性黃疸型肝炎。方中茵陳為君藥，具有清利濕熱，利膽退黃[1]的功效，其中綠原酸為其主要成分之一?，F(xiàn)代研究表明綠原酸是一類分布廣泛且有諸多藥理作用的天然化合物，具有抗氧化、抗菌、抗突變和抗癌變、降血脂和降血壓、保護心血管和中樞神經(jīng)、抑制糖尿病、抗紫外和抗輻射、抗白血病、免疫調(diào)節(jié)、細胞保護、保肝、抗內(nèi)毒素、抗抑郁和焦慮等多方面的藥理作用[2]。枳殼為臣藥，現(xiàn)代研究表明，枳殼主要含黃酮、生物堿、揮發(fā)油等化學成分，且具有廣泛的藥理作用，常作為理氣藥，對脂肪肝引起的轉(zhuǎn)氨酶升高和肝內(nèi)脂肪浸潤、肥胖、高脂血癥進行治療和調(diào)理[3]。枳殼的藥典主要質(zhì)控成分為柚皮苷和新橙皮苷[1]。為提高退黃保肝膠囊的質(zhì)量標準，保障臨床用藥安全，本文采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定該制劑中綠原酸、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），配備SPD-20A UV/VIS檢測器、LC-solution工作站；Mettler Toledo MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）；BWS-10恒溫水浴鍋（上海一恒公司）。

1.2 材料

綠原酸對照品（批號110753-201415，含量以96.2%計），柚皮苷對照品（批號110722-201613，含量以94.3%計），新橙皮苷對照品（批號111857-201102，含量以99.6%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；退黃保肝膠囊3批，批號分別為170318，170412，170521，均為醫(yī)院制劑；液相用乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18Superb（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）；流速為1.0 ml/min；檢測波長為283 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對照品儲備溶液。臨用時，精密吸取上述3種對照品儲備溶液各1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按照退黃保肝膠囊處方制備不含茵陳、枳殼的樣品，按2.2.2項方法操作，制得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取2.2項下3種溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件測定，記錄色譜圖。結果表明，供試品呈現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，陰性樣品在對照品的保留時間處，無色譜峰干擾（見圖1）。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察

精密吸取2.2.1項下對照品溶液1，5，10，20，30 μl，注入高效液相色譜儀，依法測定峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得綠原酸回歸方程為Y=2×106X-523，r=0.9999，柚皮苷回歸方程為Y=2×106X+388，r=0.9999，新橙皮苷回歸方程為Y=2×106X+436，r=0.9996，結果表明，綠原酸在0.0387～1.1610 μg、柚皮苷在0.0399～1.1970 μg、新橙皮苷在0.0414～1.2420 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下對照品溶液10 μl，重復進樣6次，記錄峰面積。結果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.41%，0.35%，0.36%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批（批號為170318）樣品，按2.2.2項方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項色譜條件測定。結果，綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷平均含量分別為1.3398，1.8978，2.2241 mg/g，RSD分別為0.9%，1.0%，1.2%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批（批號為170318）樣品，按2.2.2項方法制備供試品溶液，分別于0，6，9，12，18，21，24 h按規(guī)定的色譜條件測定峰面積。結果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.19%，0.31%，0.27%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收試驗

分別取同一批已知含量的樣品（批號為170318）約0.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入綠原酸對照品儲備溶液、柚皮苷對照品儲備溶液、新橙皮苷對照品儲備溶液3，5，5 ml，揮干甲醇，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，計算加樣回收率。結果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為99.7%，99.3%，99.6%，RSD分別為0.9%，1.3%，1.1%（n=6）。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為170318，170412，170521），分別按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，計算各成分含量，結果見表1。

表1 供試品中綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷含量測定（n=3）

3 討論

3.1 波長的選擇

分別取綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷對照品溶液在200～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，最大吸收波長分別為327，283，283 nm，因在283 nm得到的峰形、峰高最為適宜，故選用283 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

對比了乙腈-0.4%磷酸溶液（13:87）[1]，乙腈-0.1%磷酸溶液（10:90）[4]，乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）[5]，乙腈-水（20:80）[6]，乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（16:10:74）[7]的分離效果，結果表明以乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動相時，樣品中各組分的分離度最好，故采用乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動相。

3.3 提取溶劑和提取時間的確定

分別考察了以50%甲醇[7]、70%甲醇、75%甲醇[8]、甲醇[6]、50%乙醇、70% 乙醇[9]、 90%乙醇、乙醇為溶劑的加熱回流提取效果，結果表明70%甲醇提取效果優(yōu)于其他溶劑。同時對提取時間進行了考察，結果表明加熱回流60 min能提取完全，故確定用70%甲醇加熱回流提取60 min。