江志波，李星星，任衛(wèi)聰，侍媛媛，高榮梅，李玉環(huán)，武臨專，洪斌

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基因組發(fā)掘策略指導(dǎo)鐵載體類化合物的發(fā)現(xiàn)

江志波*，李星星*，任衛(wèi)聰，侍媛媛，高榮梅，李玉環(huán)，武臨專，洪斌

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所/衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

利用基因組發(fā)掘策略指導(dǎo)鐵載體類化合物的發(fā)現(xiàn)。

首先，在獲得灰產(chǎn)色鏈霉菌（）CPCC 200274 全基因組序列的基礎(chǔ)上，利用 antiSMASH 對其編碼的潛在次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過 Blastp 比對，判斷該菌株中是否存在鐵阻遏蛋白（DmdR1）同源基因，并借助于 MEME、FIMO 等軟件尋找包含 DmdR1 蛋白結(jié)合位點(diǎn)（iron box）的基因簇，則該基因簇可能為鐵載體類化合物的生物合成基因簇；其次，摸索合適的發(fā)酵條件，利用實(shí)時(shí)定量 RT-PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測相關(guān)生物合成基因的表達(dá)水平；最后分離純化目標(biāo)鐵載體類化合物，驗(yàn)證此基因組發(fā)掘策略的可行性。

利用 antiSMASH 從灰產(chǎn)色鏈霉菌 CPCC 200274 基因組中發(fā)現(xiàn)了 5 個(gè)含有基因、標(biāo)注為鐵載體的生物合成基因簇。Blastp 比對提示該菌株基因組中存在 DmdR1 的同源蛋白 SGC5642，可能參與鐵載體類化合物生物合成的調(diào)控。結(jié)合 MEME、FIMO 軟件分析結(jié)果，5 個(gè)含的基因簇中只有 cluster 29 含有 iron box 序列，推測 cluster 29 可能編碼鐵載體類化合物。根據(jù)以上信息，利用 qRT-PCR 方法確定了該基因簇表達(dá)的發(fā)酵條件，分離純化獲得了 3 個(gè)鐵載體類化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為去鐵敏 B，去鐵敏 E和 N1-羥基-N1-琥珀?；贰?/p>

以基因組發(fā)掘策略為指導(dǎo)，從微生物基因組中發(fā)現(xiàn)鐵載體類化合物生物合成基因簇和鐵阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)，并通過 qRT-PCR 方法在轉(zhuǎn)錄水平確定目標(biāo)基因簇的方法，成功獲得 3 個(gè)鐵載體類化合物。該策略為解決目前 antiSMASH 對于鐵載體類化合物生物合成基因簇預(yù)測的局限性和該類化合物基因簇的快速定位、新生物合成元件的發(fā)掘提供了新思路，為新結(jié)構(gòu)鐵載體類化合物的尋找及合成生物學(xué)改造奠定了基礎(chǔ)。

基因組發(fā)掘； 鐵載體； 灰產(chǎn)色鏈霉菌； qRT-PCR

鐵是維持微生物生命活動的重要元素，作為輔因子參與催化多種生化反應(yīng)，如氧化作用和電子轉(zhuǎn)移過程等，另外還參與 DNA 和 RNA 的生物合成[1]。由于自然環(huán)境中可溶性鐵離子濃度低，微生物通過合成一類對鐵離子具有強(qiáng)螯合作用（aff> 1030）的有機(jī)小分子化合物（分子量通常為 500 ~ 2000 D）來攝取環(huán)境中的低濃度鐵離子，這類物質(zhì)被稱為鐵載體[2]。在細(xì)菌細(xì)胞膜上，存在鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如 TonB 等[3]。研究表明，鐵載體可以作為抗生素分子進(jìn)入胞內(nèi)的載體，在抗菌藥物研發(fā)中起到了重要作用[4]。將抗生素分子偶聯(lián)到鐵載體上，形成的一類新型分子稱為“木馬分子”，能夠克服細(xì)胞的外膜屏障[5]。根據(jù)木馬策略設(shè)計(jì)的化合物 Bal30072 對碳青霉烯耐藥的腸桿菌等多種革蘭陰性菌具有明顯的生長抑制活性，已經(jīng)完成I期臨床研究[6]。鐵載體化合物去鐵敏 B（deferoxamine B，DFOB）在臨床還被用于治療因代謝紊亂等因素引起的鐵離子中毒[7]。鑒于鐵載體的多種生物學(xué)功能和潛在應(yīng)用價(jià)值，從自然界尋找新結(jié)構(gòu)鐵載體成為目前天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的重要方向之一。

隨著基因組技術(shù)和天然產(chǎn)物生物合成機(jī)制研究的不斷深入，大量抗生素等次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇被報(bào)道。根據(jù)已報(bào)道生物合成基因（簇）來預(yù)測潛在的次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的生物信息學(xué)分析技術(shù)得到快速發(fā)展，這一技術(shù)被稱為基因組發(fā)掘技術(shù)[8]。AntiSMASH（https:// antismash.secondarymetabolites.org/）是目前綜合性最強(qiáng)的一個(gè)分析工具，整合了許多算法和軟件，能分析識別微生物基因組中的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，被廣泛應(yīng)用于新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。放線菌（特別是鏈霉菌）是已知抗生素如鏈霉素、紅霉素、萬古霉素等的主要來源。自 2001 年第一個(gè)放線菌（天藍(lán)色鏈霉菌）的基因組序列被報(bào)道以來，研究者發(fā)現(xiàn)放線菌基因組中往往存在十幾個(gè)甚至幾十個(gè)結(jié)構(gòu)多樣的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于從該菌株中已經(jīng)分離得到的天然產(chǎn)物。這些次級代謝產(chǎn)物大多數(shù)在實(shí)驗(yàn)室條件下難以表達(dá)，被稱為“沉默”或“隱性”基因簇[9]，其中包括鐵載體類化合物，因此需要結(jié)合生物信息學(xué)分析，采用有效的激活方法，針對性地指導(dǎo)鐵載體類化合物的分離。

目前已發(fā)現(xiàn)幾百個(gè)鐵載體類化合物，對其生物合成機(jī)制也已進(jìn)行了深入研究[10]。一類是由非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）家族的多酶復(fù)合體負(fù)責(zé)合成的鐵載體（NRPS-dependent siderophore），但 antiSMASH對于此類型生物合成基因簇不能直接給出鐵載體的預(yù)測，需要研究者根據(jù)可能產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來推測。另一類是以不依賴于 NRPS 的方式（NRPS-independent siderophore，NIS）來合成，由一類特殊合成酶家族（IucA_C）參與，在鐵載體 aerobactin 生物合成過程中負(fù)責(zé)將6-羥基-6-乙?；嚢彼崤c檸檬酸脫水縮合[11]，antiSMASH 對于含有同源基因的基因簇都預(yù)測為鐵載體的生物合成基因簇，但這些預(yù)測的基因簇并不一定都能編碼鐵載體類化合物。

鐵載體生物合成基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到一類阻遏蛋白（天藍(lán)色鏈霉菌中為 DmdR1）的調(diào)控，且該調(diào)控作用與鐵離子濃度密切相關(guān)[12]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度足夠高時(shí)，DmdR1 蛋白識別鐵載體生物合成基因簇中的結(jié)合位點(diǎn)（iron box）序列并與之結(jié)合，抑制其生物合成基因的表達(dá)，而在貧鐵條件下阻遏解除，細(xì)胞合成鐵載體以攝取環(huán)境中的鐵，這是細(xì)胞維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一種調(diào)控機(jī)制[13]。由于 antiSMASH 對于鐵載體生物合成基因簇預(yù)測的局限性，本文依據(jù)鐵載體合成的調(diào)控機(jī)制，提出了一個(gè)新的發(fā)掘策略。本文以灰產(chǎn)色鏈霉菌（）CPCC 200274 為研究對象，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，cluster 29 與去鐵敏的生物合成基因具有同源性，且在其基因簇上含有阻遏蛋白的“iron box”。利用 qRT-PCR 方法檢測相關(guān)基因的表達(dá)量確定了該基因簇表達(dá)的發(fā)酵條件，借助于色譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS 等）和“閃式”分離技術(shù)從發(fā)酵液中獲得了 3 個(gè)鐵載體類化合物，說明此基因組發(fā)掘策略適用于鐵載體類化合物生物合成基因簇的快速定位和分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 灰產(chǎn)色鏈霉菌（）CPCC 200274 由中國藥用微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 試劑和耗材 Trizol 試劑購自美國 Life Tech 公司；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Fast Start Universal SYBR Green Master Rox試劑盒購自瑞士 Roche 公司；色譜甲醇、乙腈購自上海泰坦科技股份有限公司；純水為屈臣氏蒸餾水經(jīng) Millipore 純化儀制備；丙酮、甲酸、三氯化鐵等為分析級，購自北京化工廠。分析和半制備色譜柱[CAPCELL PAK C18 AQ，4.6（或 10.0）× 250 mm，5.0 μm]購自日本資生堂公司。

1.1.3 儀器 CFX 96TM實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)為美國 Bio-Red 公司產(chǎn)品；Sepacore?flash systems X10 中壓制備液相色譜系統(tǒng)為瑞士BuChi 公司產(chǎn)品；LC-20AD 高壓液相分析半制備系統(tǒng)為日本島津公司產(chǎn)品；1290-1956 單四級桿質(zhì)譜儀為美國 Agilent 公司產(chǎn)品；600 MHz 核磁共振儀為美國Varian 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌基因組 DNA 提取及序列測定 將CPCC 200274 接種于 5 ml TSB（BD Cat.211825）培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 h，5000 r/min 離心 10 min，收集10 ml 菌體，并用 STE 緩沖液（0.3 mol/L 蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA，pH 8.0）洗滌菌體一次。用 5 ml STE 緩沖液重懸菌體，加入終濃度為 5 mg/ml 的溶菌酶，在 37 ℃恒溫水浴中孵育 30 min。然后加入 2.5 ml 2% SDS，輕輕混勻后，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）混合物，在室溫下輕輕搖勻，12 000 r/min，4 ℃離心 10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中。重復(fù)抽提 1 ~ 2 次，直至界面沒有白色變性蛋白的存在。加入等體積的氯仿抽提一次以除去殘留的酚，5000 r/min，4 ℃離心 10 min。再次將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加 RNA 酶（15 μg/ml）消化 1 h后加入等體積的酚：氯仿：異戊醇抽提一次，用等體積的氯仿抽提一次以除去殘留的酚，加入1/20 體積的 5 mol/L NaCl 和等體積異丙醇，充分混勻至 DNA 沉淀。用潔凈無菌的玻璃棒纏繞 DNA，將其移至新的離心管中，70% 的乙醇洗滌1 ~ 2 次，室溫晾干后溶于 500 μl 純水，保存于4 ℃ 備用。經(jīng)電泳檢測合格后，送深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行全基因組序列測定。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 采用 AntiSMASH （Version 4.2.0，https://antismash.secondarymetabolites. org/）預(yù)測菌株次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇；Blastp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對 DmdR1 的同源蛋白；Clustal Omega（https://www. ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行 DmdR1 同源蛋白的多序列比對。MEME（Version 4.12.0，http:// meme-suite.org/tools/meme）根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道 DmdR1 的結(jié)合位點(diǎn)，生成“iron box”的一致性序列。根據(jù) MEME 生成的一致性序列，以 FIMO（Version 4.11.1，http://meme-suite.org/tools/ fimo）尋找目標(biāo)基因組中“iron box”的相似序列。

1.2.3 菌株活化、培養(yǎng)與發(fā)酵條件 菌株在 YMS 固體培養(yǎng)基（0.4% 酵母抽提物、1% 麥芽膏、0.4% 可溶性淀粉、0.0005% CoCl2?6H2O、2% 瓊脂）中28 ℃培養(yǎng) 7 d 后，取約 2.0 cm2大小的帶菌瓊脂塊轉(zhuǎn)接到 100 ml 種子培養(yǎng)基 TSB（BD Cat.211825）中，于 28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h 后，按 5%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基（貧鐵：2.0% 可溶性淀粉、0.05% NaCl、0.1% KNO3、0.05% K2HPO4、0.05% MgSO4，pH 7.4 ~ 7.6；富鐵：在貧鐵發(fā)酵培養(yǎng)基中加入終濃度 0.01 mol/L FeCl3）中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng) 7 d。

1.2.4 RNA 提取及實(shí)時(shí)定量qRT-PCR 在菌株發(fā)酵 48 h 時(shí)，收取 2 ml 發(fā)酵液，12 000 r/min 離心 5 min，棄上清，菌體立即凍于液氮中。提取 RNA 時(shí)，將菌體于冰上解凍，重懸于 250 μl TE 溶液 中（含 10 mg/ml溶菌酶），37 ℃孵育 30 min。加1 ml Trizol 試劑并按說明書操作步驟分離并純化 RNA。然后采用 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 按說明書操作步驟將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA。采用Fast Start Universal SYBR Green Master Rox 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 qRT-PCR，qPCR 反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 模板 2.5 μl、待考察基因引物 400 nmol/L、SYBR Green Rox Mix 12.5 μl 和 DEPC 水5 μl。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 10 min；94 ℃30 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s（40 個(gè)循環(huán)數(shù)）。擴(kuò)增作為內(nèi)參。采用 2-ddCt法計(jì)算各基因表達(dá)變化倍數(shù)。引物序列見表1。

表 1 qRT-PCR 所用引物

1.2.5 HPLC-MS 分析方法 發(fā)酵液經(jīng) 3000 r/min離心 30 min，除去菌體和不溶物，取 10 ml 上清液進(jìn)行固相萃取，其中 60% 甲醇水洗脫液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，用于 HPLC-MS 檢測。

液相色譜采用兩相梯度洗脫的方法，其中 A 相為甲醇，B 相為 0.1%（V/V）甲酸水溶液。A 相在 40 min 內(nèi)由 10%（V/V）逐漸遞增至 70%（V/V），流速為 1.0 ml/min，洗脫液經(jīng)過色譜柱后，使用三通等分至二極管陣列檢測器和質(zhì)譜檢測器中。檢測波長為 435 nm，柱溫箱設(shè)定為 25 ℃，進(jìn)樣體積為 20 μl。

質(zhì)譜檢測條件：噴霧電壓 4.5 V；載氣為氮?dú)?，流速?10 L/min；離子源溫度 325 ℃；全掃描模式，范圍為300 ~ 1200；數(shù)據(jù)使用儀器自帶軟件（Data Analysis, version 3.3）進(jìn)行處理。

1.2.6 化合物分離純化和制備過程 貧鐵發(fā)酵上清液（6.0 L）經(jīng)大孔樹脂（XAD-2，6.0 L）吸附后，依次以 3%、10%、30%、50% 丙酮水溶液洗脫。HPLC-MS 檢測鐵載體集中在 30% 丙酮水溶液部分，減壓濃縮 30% 丙酮水溶液，得粗品 1003.5 mg。經(jīng)過中壓快速分離系統(tǒng)（ODS 反相硅膠為載體）10% ~ 90% 甲醇水溶液（70 min）梯度洗脫，收集 20% ~ 30% 甲醇水溶液，減壓濃縮后得混合物 100.5 mg?；旌衔锝?jīng)過半制備高壓液相系統(tǒng)分離獲得化合物1（R= 15.5 min，25.5 mg），2（R=17.5 min，5.3 mg）和3（R= 5.5 min，5.2 mg）。

取等量化合物1（DFOB，5.0 mg）于兩支潔凈試管中，分別加入 FeCl3（0.1 mol/L，10 μl）或Ga2(SO4)3（0.1 mol/L，10 μl）水溶液，室溫下振蕩反應(yīng) 0.5 h 后，冷凍干燥除去溶劑，得 DFOB-Fe（5.1 mg）和 DFOB-Ga（4.9 mg）。

1.2.7 化合物抗病毒活性檢測方法 MDCK 細(xì)胞以 2.5 × 104/孔的密度接種于 96 孔培養(yǎng)板，置 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)。24 h 后加入不同濃度待測化合物，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對照組。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，觀察細(xì)胞病變，以 Reed & Muench 法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒濃度（TC50）。同樣密度接種細(xì)胞，24 h 后用 100 倍半數(shù)組織細(xì)胞感染量（TCID50）的病毒（流感病毒 A/漢防/359/95，H3N2）感染2 h 后，移去未吸附的病毒。加入不同稀釋度樣品及陽性對照藥（利巴韋林和磷酸奧司他韋），同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照組和病毒對照組。待病毒對照組病變達(dá) 4+（75% ~ 100%）時(shí)觀察各給藥組細(xì)胞病變，用 Reed & Muench 法計(jì)算樣品半數(shù)抑制濃度（IC50），并根據(jù) TC50/IC50比值計(jì)算選擇指數(shù)（SI）。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

對灰產(chǎn)色鏈霉菌（）CPCC 200274進(jìn)行了基因組 DNA 提取及高通量測序，獲得了基因組精細(xì)圖，其基因組為一個(gè) 10 397 305 bp的線性染色體，GC 含量為 70.82%，含有 9790 個(gè)基因，與 GenBank 中ATCC 14511 的完整基因組大小、基因數(shù)量相當(dāng)（10 764 674 bp，9840 個(gè)基因），核苷酸序列一致性為 99%。AntiSMASH（Version 4.2.0）分析顯示CPCC 200274 基因組中至少含有 47 個(gè)不同類型的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，包括非核糖體肽類（NRPS）、聚酮類（polyketides，PKS）、萜類（terpene）等，其中有5 個(gè)基因簇含有基因_，為鐵載體類化合物生物合成基因簇（圖 1），而ATCC 14511 的基因組中同樣預(yù)測有 5 個(gè)基因簇含有基因。

文獻(xiàn)報(bào)道天藍(lán)色鏈霉菌中鐵載體生物合成基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到阻遏蛋白 DmdR1 的調(diào)控[12]，我們首先分析了 DmdR1 在放線菌中的保守性，發(fā)現(xiàn)在隨機(jī)選擇的 15 株放線菌基因組中（鏈霉菌屬 11 株、游動放線菌屬 2 株、擬無枝酸菌屬 1 株、糖多孢菌屬 1 株）都存在至少一個(gè)鐵阻遏蛋白 DmdR1 的同源蛋白（E 值 < e-80），提示該蛋白在放線菌中保守性較高（代表性菌株比對結(jié)果如圖 2 所示）。在CPCC 200274中，SGC5642 與 DmdR1 的氨基酸序列在全長范圍內(nèi)一致性為 97%（224/230）（圖 2），提示 SGC5642 可能參與鐵載體表達(dá)的調(diào)控。DmdR1 結(jié)合位點(diǎn)（iron box）保守性較高，在天藍(lán)色鏈霉菌中目前已知的 iron box 位點(diǎn)包括以下 7 個(gè)[12, 14-15]：desAp-SCO2782（ttaggttaggctcacctaa）、desEp-SCO2780（tgaggttaggctaacctac）、cchAp-SCO0499（ttagcttagg ctcacctaa）、cchEp-SCO0495（ctcgattaggctcgcctta）、cchFp-SCO0494（tgagggtaggcttacctca）、cchJp-SCO0490（ttaggttaggctcgcctaa）和 cdtCp-SCO7400（ttaggtta ggctaaccttc），我們利用 MEME 軟件將已知的 iron box 生成一致性序列，結(jié)果如圖 3 所示，是包含G的回文序列。利用 FIMO 軟件分析灰產(chǎn)色鏈霉菌基因組，結(jié)果顯示在預(yù)測到的所有 47 個(gè)次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇中只有 cluster 29 基因簇中含有兩個(gè) iron box 位點(diǎn)（圖 4），分別位于 cluster-29-C 和 cluster-29-E 的啟動子區(qū)，說明此基因簇可能為鐵載體的生物合成基因簇，其表達(dá)水平可能受鐵離子濃度的調(diào)控。

圖 1 灰產(chǎn)色鏈霉菌 CPCC 200274 中預(yù)測的鐵載體類化合物生物合成基因簇[紅色代表iucA_C基因，黃色代表其他生物合成基因，綠色代表調(diào)控基因，藍(lán)色代表轉(zhuǎn)運(yùn)基因，灰色代表其他未知功能基因。由于cluster 20 超過 180 kb，用黑色箭頭（未按比例）表示相鄰的 NRPS 和 PKS 等基因]

Figure 1 Clusters related to the biosynthesis of siderophores in the genome ofCPCC 200274 (Red arrows stand for_, yellow arrows for other synthetic genes, green arrows for regulatory genes, blue arrows for transporter genes, gray arrows for other genes. As the size of cluster 20 is over 180 kb, genes for adjacent NRPS and PKS are represented by unscaled black arrows)

圖 2 8 株放線菌中鐵阻遏蛋白 DmdR1 的同源比對

Figure 2 Homology comparison of iron dependent repressor DmdR1 in 8 strains of actinomycetes

圖 3 MEME 軟件分析得到 iron box 的一致性序列

Figure 3 MEME analysis for the consensus sequence of iron box

將 cluster 29 與天藍(lán)色鏈霉菌（M145）中負(fù)責(zé)去鐵敏生物合成的基因簇[16]進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該基因簇含有與去鐵敏類鐵載體關(guān)鍵合成基因~高度同源的基因（圖 4），可能編 碼去鐵敏類的鐵載體。Cluster 29 中基因的大小、預(yù)測的功能、同源基因以及氨基酸序列相似性見 表 2。

2.2 qRT-PCR 考察預(yù)測的基因簇轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)以上生物信息學(xué)分析的結(jié)果提示，我們設(shè)計(jì)了貧鐵（< 10-3mol/L）和富鐵（0.01 mol/L）兩種條件對實(shí)驗(yàn)菌株分別進(jìn)行發(fā)酵，提取 RNA，采用 qRT-PCR 對 antiSMASH 預(yù)測的 5 個(gè)可能的鐵載體類基因簇中關(guān)鍵合成基因_的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行考察，結(jié)果如圖 5 所示，只有 cluster 29在貧鐵條件下被激活，而其余 4 個(gè)基因簇的表達(dá)不受鐵離子濃度的調(diào)控，與生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果一致。

圖 4 Cluster 29 與去鐵敏生物合成基因簇的比較[黑色短箭頭表示 DmdR1 結(jié)合序列（iron box）的位置]

Figure 4 Organization of the genes cluster 29 comparing togene cluster inr M145 [The vertical arrows indicate the location of DmdR1 binding sites (iron box)]

表 2 Cluster 29中基因的功能及與同源基因的相似度

圖 5 基因簇 cluster 12、20、29、37 和 38 中的關(guān)鍵合成基因在富鐵和貧鐵兩種培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄水平

Figure 5 The transcriptional levels of the key synthetic genes in cluster 12, 20, 29, 37 and 38 under iron-sufficient and iron-deficient conditions

2.3 鐵載體類化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)鐵載體與 Fe3+絡(luò)合后復(fù)合物在波長435 nm下存在特定吸收的特點(diǎn)，定性檢測發(fā)酵產(chǎn)物中鐵載體類化合物，結(jié)果如圖 6 所示。在富鐵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中，由于基因簇被沉默，未檢測到特定的鐵載體類化合物產(chǎn)生（圖 6A）；貧鐵的發(fā)酵液中，由于缺乏Fe3+，激活基因簇表達(dá)的游離鐵載體在 435 nm 下吸收較弱（保留時(shí)間R= 12 min 處的峰不是鐵載體類化合物）（圖 6B）；在貧鐵發(fā)酵液中加入一定量 FeCl3（0.01 mol/L），使游離的鐵載體與 Fe3+形成絡(luò)合物，分別在 19.7 min（峰 1）、21.5 min（峰2）和 22.1 min（峰3）增加了 3 個(gè)具有特征吸收的峰（圖 6C）。說明在貧鐵條件下表達(dá) 3 個(gè)鐵載體類化合物，能與鐵離子特異性結(jié)合。借助于中壓制備和 HPLC 純化獲得了峰 1、2 和 3 對應(yīng)的化合物1、2和3，結(jié)構(gòu)如圖 7 所示。

圖 6 HPLC 方法檢測富鐵和貧鐵發(fā)酵條件下鐵載體含量（A：富鐵培養(yǎng)基發(fā)酵液，含 0.01 mol/L FeCl3；B：貧鐵培養(yǎng)基發(fā)酵液；C：在 B 中加入 FeCl3，使鐵離子濃度達(dá)到 0.01 mol/L）

Figure 6 The HPLC for analyzing theabundance of siderophores under fermentation condition of sufficient and deficient iron(A: The iron-sufficient fermentation broth, containing 0.01 mol/L FeCl3; B: The iron-deficient fermentation broth; C: Adding 0.01 mol/L FeCl3to the iron-deficient fermentation broth of B)

化合物1，白色無定型粉末，易溶于水，難溶于氯仿、丙酮等低極性有機(jī)溶劑。在低分辨質(zhì)譜測試樣品中分別加入等物質(zhì)量的Ga2(SO4)3和 FeCl3水溶液后得到準(zhǔn)分子離子627.2 [M + Ga-2H]+和 614.2 [M + Fe-2H]+，推測1的分子量（M）為 560 D，與文獻(xiàn)報(bào)道的去鐵敏 B（DFOB）一致。1的鎵（III）絡(luò)合物的1H NMR 譜（以 D2O 為溶劑）中給出了 DFOB-Ga 所有的質(zhì)子信號，包括兩組互相偶合的亞甲基信號ppm2.35（4H，t，= 7.2 Hz，H2-9，20），2.45，1.96（each 2H，m，H2-10，21）歸屬為琥珀酰基；與羥氨相連的亞甲基ppm4.64 ~ 4.84（6H，m，H2-2，13，24）；與氨基相連的亞甲基ppm2.88，3.00，3.05（each 2H，t，= 7.2 Hz，H2-6，17，28）；飽和脂肪族質(zhì)子ppm2.18（18H，m，H2-3，4，5，14，15，16，25，26，27），以及一個(gè)屬于乙酰基甲基質(zhì)子信號ppm1.26（3H，s）。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的 DFOB-Ga 相吻合[17]。確定1 為去鐵敏 B。

化合物2，白色無定型粉末，易溶于水、甲醇等極性溶劑。LC-MS 測試樣品中分別加入等物質(zhì)量的Ga2(SO4)3和 FeCl3水溶液得到準(zhǔn)分子離子分別為667.2 [M + Ga-2H]+和 654.2 [M + Fe-2H]+，推測2的分子量（M）為 600 D，比1大 40 D，與文獻(xiàn)報(bào)道的去鐵敏 E（DFOE）一致。2 的1H NMR 譜與1相比明顯少了一個(gè)甲基信號，而在屬于琥珀酰基的亞甲基區(qū)域（2.0 ~ 2.5 ppm）處增加了一組互相偶合的亞甲基（積分總數(shù)多出了4 個(gè)質(zhì)子），這些信息與去鐵敏E 結(jié)構(gòu)相符合[18]。推測2為去鐵敏 E。

化合物3，無色油狀物，易溶于甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。LC-MS 給出3的準(zhǔn)分子離子峰219.3 [M + H]+和 241.3 [M + Na]+，提示其分子量為 218 D，結(jié)合其 NMR 數(shù)據(jù)推測其分子式應(yīng)為 C9H18N2O4。3的1H NMR 譜（DMSO-6為溶劑）給出了羥肟酰胺類化合物的質(zhì)子信號：ppm2.29，2.41（each 2H，t，= 7.2 Hz，H2-10，11），3.07（2H，t，= 7.2 Hz，H2-6），3.02（2H，t，= 7.2 Hz，H2-2）和 1.28，1.37，1.58（each 2H，m，H2-3，4，5）。3的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的1-hydroxy-1-succinyl cadaverine（HSC）一致，提示3應(yīng)為1-羥基戊二胺與琥珀酸單脫水縮合產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 7所示。

圖 7 化合物1、2、3、DFOB-Fe 和DFOB-Ga 結(jié)構(gòu)

Figure 7 Chemical structures of 1, 2, 3, DFOB-Fe and DFOB-Ga

化合物1~ 3的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有體現(xiàn)鐵載體功能的羥肟酰胺片段，均屬于鐵載體類化合物?；衔?和2來源于同一個(gè)生物合成前體[16]，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，差異在化合物1（去鐵敏 B）末端氨基發(fā)生了乙?；?，分子為鏈狀結(jié)構(gòu)；而化合物2（去鐵敏 E）的末端氨基與分子內(nèi)羧基縮合形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)。化合物3是1和2的生物合成中間體之一。

2.4 化合物的活性評價(jià)

化合物1（DFOB）及其金屬離子絡(luò)合物 DFOB-Fe 和 DFOB-Ga 在流感病毒 A/漢防/ 359/95 病毒株上進(jìn)行了活性測試。以磷酸奧司他韋和利巴韋林為陽性對照，結(jié)果表明三者具有一定抗病毒活性（表 3），IC50分別為 > 0.07 μg/ml（DFOB）、0.74 μg/ml（DFOB-Fe）和 0.01 μg/ml（DFOB-Ga），但選擇指數(shù)較低。所有化合物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和綠膿假單胞菌等無明顯生長抑制作用。

表 3 DFOB、DFOB-Fe 和 DFOB-Ga 抗病毒活性結(jié)果

3 討論

灰產(chǎn)色鏈霉菌（）CPCC 200274 為殺稻瘟菌素的產(chǎn)生菌[19]。借助于 antiSMASH 網(wǎng)站整合的多種算法對該菌株基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)其富含多種類型化合物生物合成基因簇，其中有 5 個(gè)基因簇預(yù)測為鐵載體生物合成基因簇，包含 NIS 類型的鐵載體類生物合成基因（）。對預(yù)測到的 NRPS 基因簇進(jìn)行了逐一分析，未找到與已知 NRPS 類鐵載體生物合成基因簇同源的基因簇。經(jīng)進(jìn)一步生物信息學(xué)分析，這 5 個(gè)預(yù)測為鐵載體生物合成基因簇以及所有的 NRPS 基因簇中只有 cluster 29 含有 DmdR1 蛋白結(jié)合位點(diǎn) iron box，說明除了 cluster 29 之外，其余基因簇的表達(dá)可能均不受鐵離子濃度影響。進(jìn)一步分析顯示這 4 個(gè)基因簇中同源基因與其他生物合成基因（如 NRPS、PKS 等）相鄰，提示這些基因簇可能編碼其他類型的化合物，有待進(jìn)一步研究。

去鐵敏化學(xué)結(jié)構(gòu)中通常含有三組羥肟酰胺類官能團(tuán)，在溶液狀態(tài)下能夠與三價(jià)金屬離子（如 Fe3+和Al3+等）生成穩(wěn)定的無毒絡(luò)合物，因此去鐵敏在臨床主要用于治療鐵離子或者鋁離子濃度過高引起的金屬離子中毒。在中東等地區(qū)，去鐵敏還被用于治療因球蛋白生成障礙性貧血引起的聽力異常[20]。除此之外，去鐵敏與抗生素偶聯(lián)的天然“木馬分子”ferrimycin A1 和 salmycins 對抑制革蘭陽性菌生長有效，它們結(jié)構(gòu)中的抗生素均為氨基糖苷類?；谌ヨF敏與 β-內(nèi)酰胺（羅拉碳頭孢）或氟喹酮類（環(huán)丙沙星）抗生素偶聯(lián)合成的“木馬分子”對多重耐藥細(xì)菌（ESKAPE）有效，最低抑菌濃度（MIC）達(dá)到 64 ~ 1 μmol/L[21]。鐵載體化學(xué)合成比較困難，除了選擇性差，反應(yīng)路線長，總收率低等缺點(diǎn)之外，還體現(xiàn)在保護(hù)基團(tuán)的脫除比較困難[22]。酰胺氮原子的直接氧化（羥基化）產(chǎn)物復(fù)雜，氧化劑的量和氧化條件難以控制，因此，目前市售的該類鐵載體絕大多數(shù)來源于微生物發(fā)酵。從微生物來源發(fā)現(xiàn)新型鐵載體類化合物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

基于微生物生物信息學(xué)分析的基因組發(fā)掘技術(shù)已經(jīng)成為尋找新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的重要手段之一[8]。研究表明，微生物尤其是放線菌的基因組中存在大量的隱性生物合成基因簇，這些基因簇在通常實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下表達(dá)量低或者不表達(dá)，借助于傳統(tǒng)的分離技術(shù)無法富集足夠量進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。因此，科學(xué)家開發(fā)出多種有效手段用來激活這些沉默基因簇，如改變發(fā)酵條件的OSMAC 方法[23]，過表達(dá)基因簇中正調(diào)控基因，敲除負(fù)調(diào)控基因和異源表達(dá)等已經(jīng)被成功應(yīng)用，并獲得了大量新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物[24]。我們發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌屬和游動放線菌屬、擬無枝酸菌屬等稀有放線菌中均存在 DmdR1 的同源蛋白，且 iron box 序列保守，在此基礎(chǔ)上本文利用鐵載體的生物合成調(diào)控特性，從 antiSMASH 預(yù)測的 5 個(gè)鐵載體生物合成基因簇中排除了 4 個(gè)不含 iron box 序列且不受鐵離子濃度調(diào)控的基因簇，用貧鐵發(fā)酵條件成功激活并分離到了 cluster 29 對應(yīng)的 3 個(gè)鐵載體類化合物。該策略將可用于放線菌中新結(jié)構(gòu)鐵載體類化合物的高效發(fā)現(xiàn)。自然界中還存在能與其他金屬離子（如 Zn2+、Cu2+、Mn2+等）螯合的天然產(chǎn)物，具有不同的生物活性，隨著其調(diào)控蛋白的發(fā)現(xiàn)和調(diào)控機(jī)制的解析（例如 Zn2+攝取調(diào)控蛋白 Zur[25-26]），本文報(bào)道的基因組發(fā)掘策略還可推廣至更多的具有不同金屬離子螯合功能的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。

本文通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)灰產(chǎn)色鏈霉菌（）CPCC 200274 基因組上存在多種天然產(chǎn)物生物合成基因簇，其中有 5 個(gè)為可能的鐵載體生物合成基因簇。借助 antiSMASH 網(wǎng)站次級代謝產(chǎn)物預(yù)測、MEME、FIMO 等生物信息學(xué)分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因簇與去鐵敏生物合成基因簇（~）具有高度同源性，且包含調(diào)控蛋白 DmdR1 的結(jié)合位點(diǎn)，由此借助于改變培養(yǎng)基中的鐵離子濃度結(jié)合 qRT-PCR 的方法確定了該基因簇表達(dá)條件，并成功從該菌株的發(fā)酵液中分離得到去鐵敏 B、E和1-羥基-1-琥珀?；?，通過 LC-MS 和 NMR 等方法確定了三者的結(jié)構(gòu)。本工作為鐵載體類化合物生物合成基因簇的快速定位、新生物合成元件的積累及定向化學(xué)分離提供了新思路，為新結(jié)構(gòu)鐵載體類化合物的尋找及合成生物學(xué)改造奠定了基礎(chǔ)。

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Discovery of siderophore compounds using genome mining strategy

JIANG Zhi-bo, LI Xing-xing, REN Wei-cong, SHI Yuan-yuan, GAO Rong-mei, LI Yu-huan, WU Lin-zhuan, HONG Bin

NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To discover siderophores using genome mining strategy.

Firstly, the antiSMASH was used to analyze the whole genome sequence ofCPCC 200274 for identifying the biosynthetic gene cluster of potential secondary metabolites. Blastp was used to determine the homologues of iron dependent regulatory protein DmdR1 from. Using MEME and FIMO analysis, the biosynthetic gene clusters of siderophore were identified which contain DmdR1 protein binding site(s) (iron box). Secondly, to explore suitable fermentation conditions, real-time RT-PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression level of related biosynthetic genes. Finally, the target siderophores were isolated and purified to verify the feasibility of this strategy.

Five clusters containinggene were identified from the genome ofCPCC 200274 by antiSMASH. By Blastp analysis, SGC5642 was indicated to be homologous with DmdR1, which is involved in the regulation of siderophore’s biosynthesis. Cluster 29 might encode siderophores, as it was the only iron box containing cluster among the five predicted siderophore clusters by MEME and FIMO analysis. Based on the above information, the fermentation conditions for the siderophore production were determined by qRT-PCR. Three compounds were isolated and purified and their structures were identified as deferoxamine B, deferoxamine E and1-hydroxy-1-succinyl cadaver amine.

Under the guidance of our siderophore mining strategy, the biosynthetic gene clusters of siderophores are predicted in the microbial genome and the transcriptional level are determined. Three siderophore compounds are successfully obtained fromCPCC 200274. This strategy provides a new idea for the rapid identification of siderophore biosynthetic gene clusters and new biosynthetic elements, and lays a new foundation for the search and synthesis of new structural siderophores through biosynthetic biology.

Genome mining; Siderophores;; qRT-PCR

HONG Bin, Email: binhong69@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.001

國家自然科學(xué)基金（81603006、81630089、81703398、81872780）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX09711001- 006-011、2018ZX09711001-007-001）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-2-002、2016-I2M-3-012）

洪斌，Email：binhong69@hotmail.com

2018-11-05

*同為第一作者