吳擁軍，馮嬌迪，梁海燕，屈凌波,3

(1.鄭州大學 化學與分子工程學院 河南 鄭州 450001；2.鄭州大學 公共衛(wèi)生學院 河南 鄭州 450001；3.河南省功能分子綠色構(gòu)建與生物分析國際聯(lián)合實驗室 河南 鄭州 450001)

0 引言

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素，是由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝物，廣泛存在于谷類作物中.其性質(zhì)比較穩(wěn)定，經(jīng)過一般的食品加工后仍保留毒性，且毒性會隨著人們對谷物的食用進入人體內(nèi)部，從而對健康造成嚴重損害.2017年10月27日，在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物清單里，DON位列其中.因此，DON的檢測對于人類健康具有重要意義[1-3].傳統(tǒng)DON檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，該方法利用抗原、抗體的特異性結(jié)合，再通過酶標反應，被催化成有色產(chǎn)物，根據(jù)吸光度的大小進行定量分析.傳統(tǒng)的ELISA方法中，通過物理吸附包被在96孔板上的抗原(或抗體)分布不均勻、易脫落，且固相和液相的接觸面積相對較小，反應速率慢.近年來分離技術(shù)得到迅速發(fā)展，尤其是磁分離技術(shù)[4-5].以磁性納米顆粒作為固相載體，一方面，利用磁顆粒實現(xiàn)了固液兩相快速分離；另一方面，由于磁顆粒具有較大的比表面積，增大了反應物的接觸面積，從而加快了反應速率.這種新穎的磁性載體為ELISA方法提出了一種新的思路.

Fe3O4納米顆粒是常用的磁性材料，但其生物相容性較差且容易聚沉，嚴重影響偶聯(lián)效率，為此開發(fā)新型的磁性材料顯得尤為重要.鐵蛋白是一種由24個亞基組成的具有鐵核的球狀天然高分子生物材料，經(jīng)脫鐵處理可得到脫鐵鐵蛋白(apoferritin，AF).因AF具有特殊的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)以及生物礦化過程而成為理想的納米材料反應器，以其為模板合成納米材料的技術(shù)逐漸成為研究熱點[6-8].文獻[9]通過調(diào)節(jié)硫代乙酸的濃度，控制AF空腔內(nèi)所合成硫化銅尺寸的大小，成功制備出硫化銅半導體納米顆粒；文獻[10]通過控制金離子復合物緩慢的礦化過程，在AF空腔內(nèi)合成了金納米陣列.另外，AF的外表面具有氨基、羧基、巰基等可供修飾且具有特殊功能的基團，易標記一些配體作為識別目標物的探針.因此，該研究擬利用AF為生物反應器，通過礦化過程在AF空腔內(nèi)合成具有磁性的Fe3O4，得到AF@Fe3O4.然后，利用AF表面的活性基團與抗原DON結(jié)合，制備人工抗原DON免疫磁性鐵蛋白復合物(DON@AF@Fe3O4).該復合物生物相容性好、尺寸單一，磁響應性較好且易于分離純化，其表面通過化學反應結(jié)合的抗原不易脫落，具有良好的免疫原性，可用于磁酶聯(lián)免疫吸附分析中，既解決了傳統(tǒng)ELISA中抗原易脫落的問題，又克服了磁性Fe3O4納米顆粒易聚沉且生物相容性差的缺點，為磁酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測DON奠定了基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

AF(37 g/L，Sigma)，硫酸亞鐵銨、3-[(1，1-二甲基-2-羥乙基)氨基]-2-羥基-丙磺酸(AMPSO)、三甲基氮氧化物(Me3NO)、羧基二咪唑(CDI)(國藥集團化學試劑有限公司)；所用試劑均為分析純，實驗用水均為MilliQ水.

場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JSM-6700F)，紫外可見分光光譜儀(UV-2450)，酶標儀(TECAN)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(NexION 300X)，電子自旋共振波譜儀(A300)，電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9146A)，透析袋(Sigma).

1.2 實驗方法

1.2.1磁性鐵蛋白顆粒的制備 根據(jù)文獻[11-12],利用AF生物模板法合成Fe3O4或者Fe2O3磁性顆粒，其反應過程為：3Fe2++2Me3NO+4H2O→Fe3O4+2Me3N+6H++H2O2.通過控制總鐵量和Me3NO配比、反應pH、反應物濃度、反應溫度以及加料、攪拌方式等，在AF空腔內(nèi)部生成Fe3O4或者Fe2O3磁性顆粒，用磁性分離器進行分離,然后用MilliQ水洗滌至中性備用.合成步驟如下：取配制好的AMPSO溶液100 mL，用N2除氧1 h并持續(xù)攪拌.然后加入20 mg AF，加熱至65 ℃.保持整個反應發(fā)生在N2條件下且持續(xù)攪拌.AF均勻分散后，使用密封微量注射器逐滴滴加Fe2+和Me3NO溶液，使其比值為3∶2.第1次時，只滴加Fe2+，不滴加Me3NO.從第2次開始，先滴加Fe2+，然后再滴加Me3NO，每次滴加完畢后反應20 min，共循環(huán)9次.反應完成后，使用磁性分離器分離所合成的磁性鐵蛋白并濃縮至5 mL，在4 ℃下用雙蒸水進行透析，每天更換蒸餾水兩次，透析3 d，透析結(jié)束后保存于4 ℃冰箱中備用.

1.2.2DON@AF@Fe3O4復合顆粒的制備 采用羧基二咪唑法合成DON免疫磁性復合顆粒，以合成的磁性鐵蛋白作為化學發(fā)光免疫分析中的固相載體，并將所制備的DON@AF@Fe3O4復合顆粒作為化學發(fā)光酶免疫分析方法中的人工抗原.具體制備過程如下：將1 mg DON(296.3 g/mol)溶于500 μL丙酮中，再加入10 mg CDI,室溫振蕩反應1 h.反應完成后，在反應瓶中滴加20 μL去離子水，迅速向反應瓶中通入N2，揮干其中的丙酮，然后加入16 mg AF@Fe3O4(溶于500 μL，0.1 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖溶液)，4 ℃下攪拌反應過夜.反應完成后，在PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)中透析72 h，每天更換溶液2次，透析結(jié)束后保存于4 ℃冰箱中備用.

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性鐵蛋白AF@Fe3O4的表征

2.1.1磁性分析 磁性分離前后的AF@Fe3O4如圖1所示.左瓶是磁性分離前的溶液，右瓶是磁性分離后的溶液，將磁鐵置于瓶的底部，磁性鐵蛋白納米顆粒因磁鐵的引力作用而迅速沉降至瓶的底部，瓶內(nèi)上清液澄清透明，分離效果良好，這表明合成的磁性鐵蛋白具有良好的磁性.

2.1.2電子自旋共振波譜 在電子順磁共振器中，若在垂直于恒磁場的方向上附加一個適當頻率的交變磁場，當產(chǎn)生的能量等于某兩個能級的能量差時，電子將會吸收該交變磁場的能量從而發(fā)生躍遷,交變磁場的能量將會減少，這種現(xiàn)象稱為共振吸收.產(chǎn)生共振吸收時必須滿足以下關(guān)系式：

hυ=gβB，

式中：g為朗德因子；β為玻爾磁子；υ為頻率；B為共振磁場.

在該共振表達式中，朗德因子g是一個無量綱數(shù)，它是由軌道量子數(shù)、自旋量子數(shù)和總量子數(shù)決定的.不同的物質(zhì)由于軌道角動量與自旋角動量的耦合作用不同，朗德因子g也會各不相同，它反映了不同物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，在實驗中需要測得樣品朗德因子g的具體數(shù)值來確定其結(jié)構(gòu)特征.本實驗中磁性鐵蛋白的電子自旋共振波譜圖如圖2所示.

圖1 磁性分離前后的AF@Fe3O4Fig.1 AF@Fe3O4 before and after magnetic separation

圖2 AF@Fe3O4的電子自旋共振波譜Fig.2 Electron spins resonance spectra of AF@Fe3O4

由原子物理可知，當朗德因子g=2時，原子磁矩完全由電子軌道磁矩貢獻.本實驗中，通過測量AF@Fe3O4的電子自旋共振波譜可以得到頻率υ=9.847 7 GHz，從而計算出朗德因子g=1.998 3，非常接近于2.因此，可知所合成的磁性鐵蛋白具有順磁性.

2.1.3掃描電鏡 圖3為AF和AF@Fe3O4的掃描電鏡圖.從圖中可以看出，與AF相比， AF@Fe3O4的尺寸明顯變大，粒徑大小約為20 nm.AF@Fe3O4內(nèi)部具有較高的電子密度，其輪廓比AF更加清晰.由于AF@Fe3O4具有磁性引力，所以從掃描電鏡圖中可以看到AF@Fe3O4顆粒之間有一定程度的聚集.因此，可以推測成功合成了磁性鐵蛋白.

圖3 AF和AF@Fe3O4的掃描電鏡圖Fig.3 SEM image of AF and AF@Fe3O4

圖4 AF@Fe3O4的EDX譜Fig.4 EDX image of AF@Fe3O4

2.1.4能量色散X射線光譜(EDX) 該實驗通過礦化過程將Fe2+包載于AF的空腔內(nèi)部.為了證實蛋白腔內(nèi)部的元素組成，對所合成的AF@Fe3O4進行了EDX元素分析，結(jié)果如圖4所示.可以看出，蛋白腔內(nèi)部含有鐵、氧元素.結(jié)合磁性分析，推測鐵、氧元素在AF的空腔內(nèi)部以Fe2O3或Fe3O4的形式存在.

2.1.5鐵原子載入量 稱取已干燥至恒重的AF@Fe3O4(準確至0.001 g)于瓷坩堝中，置電爐上低溫碳化變黑后，加入0.9 mL濃H2SO4，重置電爐上碳化，待濃煙揮盡后，放入馬弗爐(500 ℃)中使灰化完全，取出，冷卻后加體積比1∶1鹽酸溶液2 mL，置水浴上加熱至干，將生成的氯化鹽加水溶解，用玻璃棒將溶液轉(zhuǎn)移備用.通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測出溶液中鐵的質(zhì)量濃度為46 mg/L，經(jīng)過計算可以得到AF中鐵原子載入量為791.

2.2 DON免疫磁性鐵蛋白的表征

2.2.1紫外吸收光譜 分別對AF、DON、Fe3O4、DON@AF@Fe3O4進行紫外吸收光譜掃描，掃描波長范圍為200～400 nm，結(jié)果如圖5所示.可以看出，AF在280 nm處有強的特征吸收峰，因為蛋白中有肽鍵的存在，所以在200～250 nm內(nèi)有雜峰；DON在200～250 nm處有寬的吸收峰；裸露的Fe3O4顆粒沒有吸收峰；制備的DON@AF@Fe3O4在280 nm附近有不明顯的吸收峰.這與文獻[13]中報道的AF包載物質(zhì)以后特征吸收峰由強峰變?yōu)榧绶宓慕Y(jié)果一致，可能是由于Fe3O4的影響，280 nm處的吸收峰變平；DON@AF@Fe3O4在225 nm處有強的吸收峰，這可能是由于DON@AF@Fe3O4中DON或AF或DON和AF的吸收，表明人工抗原偶聯(lián)成功.

2.2.2ELISA方法 ELISA方法是以抗原(或抗體)的固相化和抗體(或抗原)的酶標記為基礎(chǔ).包被在固相載體上的人工抗原通常具有免疫活性，酶標抗體(或抗原)兼具有免疫活性和酶活性.當檢測目標物為抗原時，加入的待測抗原與固相載體上的抗原競爭結(jié)合單抗，隨后加入酶標二抗與單抗結(jié)合，通過洗滌除去未作用的酶標二抗，最后加入酶反應底物，底物將被酶催化成有色產(chǎn)物，而有色產(chǎn)物的量與待測抗原的量直接相關(guān).因此，可以根據(jù)吸光度的大小對待測抗原進行定量分析.

鑒于此，本實驗采用不同稀釋比進行ELISA方法表征人工抗原DON@AF@Fe3O4.首先采用單抗識別人工抗原DON@AF@Fe3O4，通過洗滌除去未作用的單抗后，進一步在體系中加入酶標二抗，洗滌后加入底物進行顯色反應，ELISA表征結(jié)果如圖6所示.可以看出，隨著稀釋比的增大，吸光度陽性/空白值(B/B0)降低，表明人工抗原DON@AF@Fe3O4具備免疫活性.結(jié)合掃描電鏡、紫外吸收光譜、EDX元素分析的結(jié)果，進一步證明人工抗原DON@AF@Fe3O4制備成功.

圖5 DON@AF@Fe3O4的紫外吸收光譜Fig.5 UV spectra of DON@AF@Fe3O4

圖6 DON@AF@Fe3O4的ELISA表征Fig.6 ELISA characteritation of DON@AF@Fe3O4

3 結(jié)論

通過蛋白分子模板法合成了易標記、生物相容性好的磁性鐵蛋白AF@Fe3O4，采用磁性分析、掃描電鏡、EDX元素分析、電子自旋共振波譜進行表征，結(jié)果表明，所合成的磁性鐵蛋白具有良好的磁性，蛋白腔體內(nèi)部含有鐵元素和氧元素，AF@Fe3O4的粒徑大小約為20 nm，ICP-MS檢測出AF的鐵原子載入量為791.選擇羧基二咪唑法制備人工抗原DON@AF@Fe3O4，通過紫外吸收光譜和ELISA方法對合成的人工抗原進行表征，證明DON@AF@Fe3O4復合物偶聯(lián)成功，且具有免疫原性.制備的DON@AF@Fe3O4將生物相容性與磁性有機結(jié)合，可實現(xiàn)固液快速分離且保持良好的免疫原性，為后續(xù)磁酶聯(lián)免疫吸附分析提出了一種新的思路.