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(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510641；2.中新國(guó)際聯(lián)合研究院，廣州知識(shí)城，廣州 510555；3.海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

中國(guó)醬油歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，由于我國(guó)幅員遼闊、人們生活習(xí)慣不同，國(guó)內(nèi)醬油工業(yè)所用原料、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品品質(zhì)因地區(qū)不同有很大差異。按照制作方法的不同可分為釀造醬油和配制醬油。釀造醬油是指以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而制成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品。配制醬油是指以釀造醬油為主體，與酸水解植物蛋白調(diào)味液、食品添加劑等配制而成的液體調(diào)味品[1]。在醬油的色、香、味、體態(tài)等感官指標(biāo)中，風(fēng)味是最直觀、最受消費(fèi)者關(guān)注的指標(biāo)，隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，醬油易出現(xiàn)不可逆的口感逐漸變苦的情況，導(dǎo)致醬油的風(fēng)味物質(zhì)被掩蔽、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，顯著影響了醬油儲(chǔ)藏期間的穩(wěn)定性[2]。因此，對(duì)于釀造醬油儲(chǔ)藏期間呈味分子變化的研究已成為調(diào)味品行業(yè)中亟待解決的問題。

醬油成分復(fù)雜，主要包括以大豆為主的蛋白質(zhì)原料水解后產(chǎn)生的肽、游離氨基酸，以小麥為主的淀粉質(zhì)原料水解后產(chǎn)生的糖類，還含有植物水解后的天然活性物質(zhì)如單寧、黃酮、酚酸等。由于地域和天氣條件不同，南北方的醬油雖都是以發(fā)酵為主，但制作工藝有所差別，風(fēng)味也各有特色，南方醬油口味偏甜而北方醬油口味偏咸[3]。本研究選取兩種不同地域較有代表性的高鹽稀態(tài)法釀造醬油為研究對(duì)象，從醬油體系中不同化合物分子之間的氧化分解、分子聚集等角度入手，研究醬油在儲(chǔ)藏期間呈味分子的變化，探討影響醬油品質(zhì)穩(wěn)定性的原因，以期為醬油生產(chǎn)儲(chǔ)藏提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售高鹽稀態(tài)法釀造醬油(醬油Ⅰ、醬油Ⅱ)，購(gòu)自廣州；細(xì)胞色素C(12,384 Da)、抑肽酶(6,511 Da)、桿菌肽(1450 Da)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da)，購(gòu)自Sigma公司；色譜級(jí)甲醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、碳酸鈉、沒食子酸、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸、濃鹽酸、溴水，均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

L-8900高速氨基酸分析儀 株式會(huì)社日立制作所；AKTA蛋白純化儀，SuperdexTMPeptide 10/300 GL色譜柱 通用電氣公司醫(yī)療集團(tuán)；BSA124S萬分之一電子天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；H2050R高速離心機(jī) 湘儀動(dòng)力測(cè)試儀器有限公司；UV754N紫外分光光度計(jì) 上海儀電有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器 常州溪華儀器有限公司；KDN-1型自動(dòng)凱氏定氮儀 上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司；PHS-3C數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì) 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 常溫和加速儲(chǔ)藏試驗(yàn)

醬油一般保質(zhì)期為1～2年，為縮短考察時(shí)間，可在加速儲(chǔ)藏條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，考察樣品在儲(chǔ)藏期間呈味分子的變化。參考國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局辦公廳印發(fā)的《保健食品穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》，將兩種不同品牌的市售醬油(醬油Ⅰ、醬油Ⅱ)分別在常溫和高溫下儲(chǔ)藏，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4,5]，將加速儲(chǔ)藏條件設(shè)置為50 ℃、60% RH。分別測(cè)定不同儲(chǔ)藏條件和儲(chǔ)藏時(shí)間下醬油呈味分子的變化情況。

1.3.2 醬油單寧和游離酚含量的測(cè)定

取分別在常溫、50 ℃下儲(chǔ)藏0，5，10，15，20天的兩種醬油，參考NY/T 1600—2008、LS/T 6119—2017并作適當(dāng)修改，測(cè)量其單寧和游離酚含量。

1.3.3 醬油氨基酸組成及含量的測(cè)定

取分別在50 ℃下儲(chǔ)藏0，20天的兩種醬油各50 μL，并稀釋至原體積的50～100倍，再以4%的三氯乙酸溶液稀釋10倍，10000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后備用。

以氨基酸分析儀檢測(cè)樣品的氨基酸組成情況。檢測(cè)條件：色譜柱為磺酸性陽離子交換色譜柱(60 mm×4.6 mm，3 μm)；分離柱柱溫57 ℃，反應(yīng)柱柱溫135 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速0.5 mL/min，檢測(cè)限為3 pmol。

1.3.4 醬油多肽分子量分布的測(cè)定

取分別在50 ℃下儲(chǔ)藏0，15，30天的兩種醬油各50 μL，并用0.02 mol/L PBS緩沖液稀釋至蛋白濃度為5 mg/mL，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后備用。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考GB 5009.5—2010。

色譜檢測(cè)條件參考盧韻君等人的方法并做適當(dāng)修改，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，流速為0.5 mL/min，單次進(jìn)樣量為500 μL，單次分析時(shí)間為80 min[6]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過面積歸一化法計(jì)算各樣品多肽分子量分布。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

測(cè)定結(jié)果以P<0.05為顯著性評(píng)定指標(biāo)，數(shù)據(jù)用x±SD表示，采用Graph Prism和Origin制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油儲(chǔ)藏期間單寧和游離酚含量的變化

單寧是一類水溶性、分子量在500～3000 Da之間的酚類化合物，在植物界中廣泛分布，是一種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，也是除木質(zhì)素以外含量最多的一類植物酚類物質(zhì)。單寧可與唾液中的蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使口腔表層產(chǎn)生一種收斂性的觸感，人們通常形容為“澀”。單寧的含量與苦澀程度成正比，直接影響到醬油產(chǎn)品的風(fēng)味。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.117x+0.0222，R2=0.9994。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出不同樣品中的單寧、游離酚含量，見圖1和圖2。

圖1 醬油I、Ⅱ在常溫(a)、50 ℃(b)儲(chǔ)藏后單寧含量變化Fig.1 The change of tannin content of soy sauce I and Ⅱ at normal temperature (a) and 50 ℃ (b)

由圖1可知，醬油Ⅰ和醬油Ⅱ的初始單寧含量有顯著性差異(P<0.05)，這與兩種品牌醬油的原料、生產(chǎn)工藝等密切相關(guān)。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的推移，兩種醬油中的單寧含量呈現(xiàn)上下波動(dòng)的趨勢(shì)。但醬油Ⅰ的單寧含量波動(dòng)較為劇烈，第5天的單寧含量與其余各時(shí)間均具有顯著性差異。而不同儲(chǔ)藏時(shí)間下醬油Ⅱ的單寧含量無顯著性變化。醬油中的小分子物質(zhì)黃烷-3-醇可發(fā)生聚合反應(yīng)生成單寧，同時(shí)單寧在酸性條件下可發(fā)生水解作用[7]。水解作用與聚合反應(yīng)的同時(shí)存在，表現(xiàn)為醬油中單寧含量在一定范圍內(nèi)出現(xiàn)上下波動(dòng)的現(xiàn)象。

根據(jù)存在形態(tài)的不同，多酚分為游離態(tài)多酚和結(jié)合態(tài)多酚[8]。游離態(tài)多酚是以單體形式被物理吸附或截留于食品基質(zhì)中的多酚，易溶于水或有機(jī)溶劑。結(jié)合態(tài)多酚是經(jīng)由共價(jià)鍵與食品基質(zhì)(如細(xì)胞壁物質(zhì))相結(jié)合的多酚，具有難萃取的特點(diǎn)。結(jié)合態(tài)多酚在酸、堿、酶等的作用下可發(fā)生水解反應(yīng)，而導(dǎo)致多酚的流失。其中，酸水解反應(yīng)主要通過破壞糖苷鍵來釋放結(jié)合態(tài)多酚，但不能釋放通過酯鍵結(jié)合的多酚，但是酸水解往往需要較高的溫度。糧谷類食品中的結(jié)合態(tài)多酚主要包括阿魏酸、香豆酸、羥基肉桂酸、可水解單寧等與多糖類物質(zhì)共價(jià)結(jié)合的酚酸類物質(zhì)[9]。目前關(guān)于酚類物質(zhì)對(duì)食品品質(zhì)影響的研究不盡一致，醬油體系復(fù)雜，多酚的含量在一定程度上決定了其抗氧化功能的強(qiáng)弱，但同時(shí)多酚又是苦澀味的來源之一。

圖2 醬油I、Ⅱ在常溫(a)、50 ℃(b)儲(chǔ)藏后游離酚含量變化Fig.2 The change of free phenol content of soy sauce I and Ⅱ at normal temperature (a) and 50 ℃ (b)

由圖2可知，醬油Ⅰ與醬油Ⅱ的初始游離酚含量有顯著性差異(P<0.05)，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的推移，兩種醬油中的游離酚含量在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)，但差異并不明顯。這種變化趨勢(shì)的產(chǎn)生與儲(chǔ)藏條件并無太大關(guān)系。據(jù)研究，醬油體系為酸性環(huán)境，在加熱條件下游離酚含量會(huì)顯著增加，這是由于酚酯熱分解所致[10]。未滅菌的醬油在80 ℃條件下加熱10 h后，其游離酚成分的含量會(huì)達(dá)到最高。同時(shí)，游離酚還是酶促褐變的底物，在多酚氧化酶的作用下可被氧化生成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)聚合生成黑色素，導(dǎo)致醬油在儲(chǔ)藏期間苦味加重、色澤變深。酸水解與酶促褐變同時(shí)存在，造成了醬油中游離酚含量的上下波動(dòng)。

2.2 醬油儲(chǔ)藏期間氨基酸組成及含量的變化

氨基酸組成及含量在一定程度上影響著醬油的品質(zhì)。通常來說，醬油品質(zhì)鑒定各項(xiàng)指標(biāo)中風(fēng)味是最重要的，在醬油呈味體系中，以鮮味為主，其次是甜味和苦味。通過對(duì)50 ℃下儲(chǔ)藏0，20天的醬油Ⅰ和醬油Ⅱ的氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，得出17種常見氨基酸的含量，見表1。結(jié)果表明，兩種品牌醬油的氨基酸組成基本一致，但含量各有不同。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，是醬油中的主要鮮味物質(zhì)。醬油中的谷氨酸主要來源于原料的蛋白質(zhì)，除了賦予醬油鮮美的味道外，還作為蛋白質(zhì)的一種成分被人體所吸收利用。醬油Ⅱ比醬油Ⅰ有更高的谷氨酸含量，且儲(chǔ)藏20天后，醬油Ⅰ和醬油Ⅱ中谷氨酸的含量都有所下降，這使得醬油鮮味有所消退。在醬油新產(chǎn)品的開發(fā)中，鮮味醬油、固體醬油、忌鹽醬油等都額外添加了一定量的谷氨酸，這樣既增強(qiáng)了產(chǎn)品的鮮味，又增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。谷氨酸作為特征氨基酸，可作為初步判斷產(chǎn)品是否添加鮮味劑谷氨酸鈉的依據(jù)，如果醬油中谷氨酸占總氨基酸的比例超過30%，可初步認(rèn)定產(chǎn)品添加了谷氨酸鈉[11]。醬油Ⅰ的谷氨酸百分含量為65.32%，醬油Ⅱ的谷氨酸百分含量為80.05%，說明兩種醬油在制作過程中都人工添加了谷氨酸鈉以提高鮮味。除谷氨酸與未檢出的丙氨酸及半胱氨酸外，相同儲(chǔ)藏時(shí)間下醬油Ⅰ中其他各種氨基酸的含量均比醬油Ⅱ高。除谷氨酸外，天冬氨酸也是鮮味的主要來源。谷氨酸-天冬氨酸、谷氨酸-絲氨酸和在釀造過程中生成的一些低級(jí)肽也具有鮮味[12]。醬油Ⅰ中天冬氨酸、絲氨酸含量較高，醬油Ⅱ中谷氨酸含量較高，總體作用使得兩種醬油鮮味相當(dāng)。

表1 醬油I、Ⅱ儲(chǔ)藏前后氨基酸組成及含量變化Table 1 The amino acid composition and content of soy sauceⅠ and Ⅱ before and after storage g/dL

注：“—”表示未檢出，同行不同肩標(biāo)小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

醬油在釀造過程中產(chǎn)生的甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和脯氨酸對(duì)醬油甜味有重要作用[13]，總體來說，醬油Ⅰ呈甜味的氨基酸含量比醬油Ⅱ高，且50 ℃儲(chǔ)藏20天對(duì)甜味氨基酸含量幾乎無影響。

醬油中纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸是使醬油呈苦味的重要來源。醬油中適量苦味物質(zhì)的存在使得醬油的口感醇厚綿長(zhǎng)，但好的醬油不應(yīng)該有明顯苦味。50 ℃儲(chǔ)藏20天后醬油Ⅰ中纈氨酸、精氨酸的含量上升，蛋氨酸含量下降，異亮氨酸和苯丙氨酸基本不變；醬油Ⅱ中纈氨酸含量上升，蛋氨酸含量下降，異亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸基本不變。

醬油在儲(chǔ)藏期間，鮮味氨基酸含量的下降和苦味氨基酸含量的上升，是導(dǎo)致其風(fēng)味發(fā)生不可逆變化的原因之一。

2.3 醬油儲(chǔ)藏期間多肽分子量分布的變化

美拉德反應(yīng)是食品加工過程中廣泛存在的一種非酶褐變反應(yīng)，主要是指羰基化合物(還原糖)與氨基化合物(氨基酸、肽和蛋白質(zhì))經(jīng)過分子聚合、Amiadori重排、Strecker裂解等一系列反應(yīng)最終形成類黑精的復(fù)雜反應(yīng)，該反應(yīng)可生成大量的揮發(fā)性化合物和大分子量的聚合物。由于肽的結(jié)構(gòu)和組成較為復(fù)雜，且在高溫條件下易發(fā)生裂解或聚合，尤其是在美拉德反應(yīng)中，多肽除自身會(huì)發(fā)生熱降解外，還與還原糖類發(fā)生羰氨縮合反應(yīng)，甚至?xí)c中間產(chǎn)物分子發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而改變其分子結(jié)構(gòu)。

據(jù)研究，分子量>10000 Da，5000～1000 Da的肽熱降解反應(yīng)劇烈，美拉德反應(yīng)體系中此段組分增多可能是由于小分子肽與木糖或其衍生物的縮合所導(dǎo)致的，反應(yīng)體系中分子量<1000 Da的組分急劇減少，證明其具有良好的美拉德反應(yīng)活性[14]。同時(shí)，劉平等發(fā)現(xiàn)在美拉德反應(yīng)中，還原糖對(duì)肽的降解和交聯(lián)起促進(jìn)作用，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，>5000 Da的肽段含量增加，糖肽交聯(lián)作用明顯，而1000～5000 Da的肽段在反應(yīng)1 h時(shí)增加3.86%，隨后緩慢降低[15]。根據(jù)相關(guān)報(bào)道[16,17]，分子量>6000 Da的肽沒有苦味。鄧勇等研究了大豆多肽分子質(zhì)量與苦味之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在500～1000 Da之間的大豆多肽苦味最強(qiáng)[18]。葛文靜等利用SEC-HPLC，RP-HPLC對(duì)大豆酶解物進(jìn)行分離純化，經(jīng)感官評(píng)價(jià)和儀器輔助評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)疏水性苦味肽是苦味的重要來源，大豆苦味肽分子量集中在200～5000 Da，其中以200～2000 Da的組分的苦味最重[19]。

由圖3(a)可知，利用凝膠色譜法對(duì)一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，通過保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品分子量常用對(duì)數(shù)值(log10)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時(shí)間為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品分子量為橫坐標(biāo)，通過最小二乘法算出線性相關(guān)方程，可以獲得保留時(shí)間與分子量的關(guān)系，作為樣品分子量定性標(biāo)準(zhǔn)。由圖3(b)可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=94.762-16.964lg(x)，R2=0.9603。同時(shí)對(duì)分別在50 ℃下儲(chǔ)藏0，15，30天的醬油Ⅰ、醬油Ⅱ進(jìn)行檢測(cè)。由圖3(c)和(d)可知，兩種醬油儲(chǔ)藏后在30～40 min處峰值變化最明顯，表現(xiàn)為該分子量肽段的占比增加，尤其是儲(chǔ)藏30天的醬油Ⅰ在20 min處出現(xiàn)明顯的大分子聚集。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品分子量色譜圖(a)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)醬油Ⅰ(c)與醬油Ⅱ(d)儲(chǔ)藏后肽分子量分布的變化趨勢(shì)Fig.3 Standard molecular weight chromatogram (a)，standard curve (b), molecular weight distribution of peptides in soy sauce I (c) and soy sauce II (d) after storage

對(duì)圖3(c)和(d)進(jìn)行積分，由面積歸一化法算出各分子量肽段所占比例，見圖4。

圖4 醬油Ⅰ(a)與醬油Ⅱ(b)儲(chǔ)藏期間各分子段肽占比Fig.4 Percentage of peptide molecular weight in soy sauce Ⅰ (a) and soy sauce II (b) during storage period

由圖4(a)可知，醬油Ⅰ在儲(chǔ)藏15天后，各分子段占比發(fā)生明顯變化，具體表現(xiàn)為：分子量<200 Da的小分子肽占比減少，2000～5000 Da分子段占比顯著增加。繼續(xù)儲(chǔ)藏至30天時(shí)，200～2000 Da和2000～5000 Da肽段占比略有下降，而<200 Da和>5000 Da的肽段占比略有上升。由圖4(b)可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間推移，醬油Ⅱ中分子量<200 Da和200～2000 Da的肽段占比略有減少，2000～5000 Da和>5000 Da的肽段占比略有上升，但總體變化趨勢(shì)相對(duì)緩慢。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉平等人的研究結(jié)論一致。因此，醬油在儲(chǔ)藏期間，不同分子量肽的變化可能導(dǎo)致其風(fēng)味發(fā)生不可逆變化。

2.4 環(huán)境條件的改變加速呈味分子的變化

外界環(huán)境的改變也可能加速各種呈味分子的變化，最終影響醬油品質(zhì)的穩(wěn)定性。例如，溫度升高可以使美拉德反應(yīng)加劇，氧氣的引入可促使酚類底物在多酚氧化酶的作用下發(fā)生酶促褐變，表現(xiàn)為“黑色素”的生成及醬油變苦、色澤變深。光的光化作用可能促進(jìn)淀粉糖化、酒精發(fā)酵、蛋白質(zhì)降解、風(fēng)味物質(zhì)形成和美拉德褐變等生化反應(yīng)的進(jìn)行，或影響微生物的繁殖代謝。也有研究指出光照本身對(duì)醬油品質(zhì)沒有直接的影響，但光照可以引起發(fā)酵基質(zhì)的溫度升高，從而使醬醪和醬油中各種生理生化反應(yīng)加快，最終導(dǎo)致醬油品質(zhì)的差異[20]。

3 結(jié)論

由于原料和工藝的不同，成品醬油中單寧含量、游離酚含量、氨基酸組成及含量、多肽分子量分布存在差異，這些呈味分子在醬油儲(chǔ)藏期間會(huì)持續(xù)變化波動(dòng)，可能導(dǎo)致醬油風(fēng)味、色澤等發(fā)生不可逆變化，從而影響醬油儲(chǔ)藏期間的品質(zhì)穩(wěn)定性。