康戰(zhàn)方 植新培 歐陽一蕙 高軍 張?zhí)?印大中

(1廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院 清遠市人民醫(yī)院，廣東 清遠 511518；2清遠職業(yè)技術學校)

隨著社會的發(fā)展及人民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率在我國及全球范圍內(nèi)迅速攀升〔1〕。2010年我國18歲及以上成人樣本中，根據(jù)國際最新臨床診斷標準進行診斷的糖尿病估測患病率為11.6%，約1.39億人〔2〕。目前，胰高血糖素樣多肽(GLP)-1受體(GLP-1R)激動劑及二肽基肽酶(DPP)-4抑制劑(能抑制體內(nèi)活性GLP-1被DPP-4酶降解)用于2型糖尿病治療并具有廣泛的應用前景。臨床研究表明，GLP-1R激動劑除了刺激胰島素分泌、降血糖之外還具有保護心血管及大腦等功能〔3〕。GLP-1通過與其特異性的G蛋白耦聯(lián)受體-GLP-1R相結合而發(fā)揮功能。研究表明，高糖和高脂分別能損傷β細胞中GLP-1R的表達，并影響其信號通路。本文旨在研究高糖、高脂協(xié)同條件下(糖脂毒性)對INS-1E β細胞中GLP-1R的表達及exendin-4保護作用的影響。

1 材料與方法

1.1材料 小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、β-巰基乙醇、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶均購自Hyclone。無糖RPMI1640培養(yǎng)基粉末、牛血清白蛋白(BSA)、棕櫚酸鈉(無脂肪酸)及噻唑藍(MTT)購于美國Sigma。BrdU抗體從CST 獲得。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司?？俁NA提取試劑、反轉錄反應試劑和SYBR Green I熒光定量PCR試劑從Takara公司購買。

1.28 mmol/L的棕櫚酸-BSA溶液配置 根據(jù)我們之前發(fā)表的論文配置〔4〕。主要步驟如下：首先100 mmol/L RPMI1640培養(yǎng)基中加入10 g BSA和2.5 ml的HEPES (1 mol/L)輕輕混勻，避免過多氣泡產(chǎn)生。完全溶解后取50 ml溶液放入無菌血清瓶中并且加入111.4 mg棕櫚酸鈉，控制溫度在37℃左右(不超過38℃)用磁力攪拌器攪拌約3 h棕櫚酸鈉完全溶解。最后用一次性濾器除菌、分裝4℃保存?zhèn)溆?。剩余的約含10.5%BSA的培養(yǎng)基不加入棕櫚酸鈉做相同的攪拌處理用作對照。

1.3細胞培養(yǎng) 大鼠胰島β細胞系INS-1E由日內(nèi)瓦大學P.Maechler教授惠贈。細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中(含有10% 的小牛血清，50 μmol/L β-巰基乙醇，100 U青鏈霉素雙抗)。細胞培養(yǎng)于37℃，95%空氣，5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中。觀察細胞密度約為80%至90%時，細胞用0.25%胰蛋白酶消化、傳代(1∶3)或者傳于96孔板或6孔板用于實驗。當棕櫚酸鈉處理細胞時，培養(yǎng)基換成不含小牛血清，對照組為含相同濃度BSA的溶液。

1.4熒光定量PCR實驗 INS-1E細胞在處理相應時間之后，按照說明書用總RNA提取試劑提取總RNA，然后用反轉錄試劑盒合成cDNA。熒光實時定量PCR反應采用SYBR Green試劑，在BIO-RAD CFX Connect定量PCR儀器上進行。GLP-1R引物序列正向TGAGAGACCTGCCCTTGGAAC，反向CGAGAGGAAGGCTGATGTAGG。GAPDH用作內(nèi)參，引物序列正向AGTTCAACGGCACAGTCAAG，反向TACTCAGCACCAGCATCACC。

1.5MTT實驗 取對數(shù)生長期的INS-1E細胞，消化后以4×104個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。第二天細胞換成無小牛血清的低糖(5 mmol/L)或高糖培養(yǎng)基(30 mmol/L)，并且加入終濃度0.4 mmol/L的棕櫚酸或者棕櫚酸聯(lián)合exendin-4(50 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后加入20 μl的MTT溶液(終濃度5 mg/ml)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，室溫下緩慢震蕩至結晶物溶解后在酶標儀中讀數(shù)(檢測波長490 nm)。

1.6BrdU免疫熒光 INS-1E細胞3×105個/孔傳于含無菌蓋玻片的6孔板中，第2天細胞貼壁后換成低糖或者高糖培養(yǎng)基，并且用0.4 mmol/L的棕櫚酸處理24 h后進行BrdU免疫熒光分析。具體步驟為檢測前2 h每孔加入終濃度為3 μg/ml的BrdU。然后PBS洗滌后4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗滌3次后0.3%Triton X-100處理15 min，2 mmol/L鹽酸處理30 min后再用0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液中和。按照免疫熒光常規(guī)過程封閉、加入抗BrdU抗體孵育、洗滌和加入二抗，熒光顯微鏡拍照計數(shù)。

1.7細胞凋亡試劑盒(TUNEL)染色 INS-1E細胞3×105個/孔傳于含無菌蓋玻片的6孔板中，第2天細胞貼壁后換成低糖或者高糖培養(yǎng)基，并且用0.4 mmol/L的棕櫚酸處理24 h，后進行TUNEL細胞凋亡分析。按照說明書進行，最后用熒光顯微鏡拍照計數(shù)分析。

1.8統(tǒng)計方法 使用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1高糖、高脂單獨及糖脂毒性條件下β細胞中GLP-1R mRNA的表達 首先，我們選擇大鼠INS-1E細胞作為模型，用棕櫚酸模擬體內(nèi)高血脂來進行體外實驗。單獨高糖(30 mmol/L)或者高脂(0.4 mmol/L棕櫚酸)的條件下都能顯著降低INS-1E細胞中GLP-1R mRNA表達(分別下降至68.1%±16.7%和55.5%±14.6%)。但是合并高糖、高脂的條件下GLP-1R mRNA表達下降更顯著(下降至35.0%±7.9%，均P<0.05)。

2.2高糖、高脂及糖脂毒性條件下對INS-1E細胞增殖的影響 我們進一步用MTT和BrdU染色方法檢測了高糖、高脂和糖脂毒性并條件下激活GLP-1R信號通路對INS-1E細胞增殖的影響。MTT結果顯示(OD值分別為：低糖，0.78±0.03；低糖+棕櫚酸，0.68±0.04：低糖+棕櫚酸+exendin-4，0.73±0.02；高糖，0.86±0.05；高糖+棕櫚酸，0.71±0.02；高糖+棕櫚酸+exendin-4，0.72±0.04)，與低糖相比較，高糖條件下能促進細胞增殖。而高脂對不同葡萄糖培養(yǎng)條件下的INS-1E細胞都有抑制作用。exendin-4能部分保護低糖條件下棕櫚酸對INS-1E細胞的抑制作用，而在高糖條件下幾乎沒有保護作用。BrdU染色結果也得到相似的結果(BrdU陽性細胞統(tǒng)計百分比結果為：低糖，11.1%±2.0%；低糖+棕櫚酸，4.2%±1.8%；低糖+棕櫚酸+exendin-4，4.8%±1.8%；YM OYVK，14.9%±2.9%；高糖+棕櫚酸，4.6%±1.3%；高糖+棕櫚酸+exendin-4，4.5%+1.7%)。0.4 mmol/L棕櫚酸處理細胞后BrdU陽性細胞比例顯著降低。exendin-4減弱了低糖條件下棕櫚酸對細胞增殖的抑制作用，但在高糖作用下則無明顯影響(圖1)。

2.3高糖、高脂及糖脂毒性條件下對INS-1E細胞凋亡的影響及exendin-4的保護作用 我們的培養(yǎng)條件下，高糖對β細胞凋亡影響較小。0.4 mmol/L棕櫚酸則顯著增加了INS-1E細胞的凋亡，無論是在高糖或低糖條件下。exendin-4能保護低糖條件下棕櫚酸誘導的細胞凋亡，但在高糖條件下作用不明顯，TUNEL陽性細胞統(tǒng)計百分比結果為：低糖，1.2%±0.8%；低糖+棕櫚酸，14.1%±14.4%；低糖+棕櫚酸+exendin-4,9.1%±2.2%；高糖，1.3%±0.5%；高糖+棕櫚酸，16.8%±4.8%；高糖+棕櫚酸+exendin-4，15.1%±4.3%。見圖2。

圖1 糖脂毒性及exendin-4對INS-1E細胞增殖影響的BrdU免疫熒光結果

圖2 糖脂毒性及exendin-4對INS-1E細胞凋亡的影響

3 討 論

糖尿病是一種多因素決定的代謝性疾病，其發(fā)病的根本原因在于胰島素抵抗(胰島素相對不足)或者胰島素β細胞損傷引起的胰島素分泌減少(胰島絕對不足)。糖尿病一旦發(fā)生，β細胞胰島素分泌能力將持續(xù)降低，包括β細胞量也會減少，直至β細胞衰竭〔5，6〕。盡管具體機制并不清楚，多數(shù)研究表明高血糖、高血脂在糖尿病β細胞衰竭中起重要作用〔7〕。腸促胰島素是口服營養(yǎng)物質后，由胃腸道產(chǎn)生的一類具有促進胰島β細胞胰島素分泌、降低血糖的內(nèi)分泌因子。GLP-1和抑胃肽/葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽(GIP)是2個最重要的腸促胰島素。目前基于GLP-1R激動劑的藥物廣泛應用于臨床來治療2型糖尿病〔8〕。我們及其他研究團隊發(fā)現(xiàn)，高脂、高脂單獨條件下都能降低β細胞中GLP-1R的表達、損傷GLP-1R信號通路〔4，9〕。但并沒有研究高糖合并高脂，即糖脂毒性對β細胞GLP-1R表達及其信號通路影響。本研究發(fā)現(xiàn)糖脂毒性比單獨高糖、高脂損傷β細胞GLP-1R信號通路更嚴重，提示了我們在使用腸促胰島素類藥物治療2型糖尿病時血脂控制也十分重要。