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無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是牛乳腺炎(Bovine mastitis)的主要致病菌之一，它不僅會對奶牛的產(chǎn)乳量造成影響，同時可通過“乳腺乳”的傳遞感染人類，是人獸共患病的典型的致病菌之一[1-4]。近年來由于生態(tài)保護政策的不斷提升，“禁牧”政策的嚴格實施，造成乳牛乳房炎的發(fā)病機率逐年增多。因此，奶牛乳腺炎的有效防控就顯得極為重要[5-8]。但是目前全球尚無有效防治牛乳房炎的疫苗上市，傳統(tǒng)的疫苗都存在免疫保護不佳，散毒，潛伏感染等現(xiàn)象[9]。因此，尋找和探索一種安全，有效，多價的非全菌體型基因工程亞單位疫苗是解決奶牛乳腺炎防控難的全球性的科學解決途徑[14-15]。 無乳鏈球菌中致病的因子有很多，除了莢膜，溶血素，鏈道酶素，鏈激酶以外，更為重要的是其具有的粘附功能，致病因子是其表向的菌毛，其菌毛有PI-1及PI-2(又稱PI-2a，PI-2b)[16-18]。有研究顯示，粘膜免疫可以阻止細菌有效定植目標細胞。因此，無乳鏈球菌的菌毛結構成為了眾多學者關注和研究的熱點[19]。我們針對無乳鏈球菌中具有致病性的PI-2a菌毛島嶼的三個亞基基因AP1、AP2、BP進行探究，將與GBS黏附有關的AP1基因、具有菌毛錨定的AP2基因和菌毛骨架蛋白BP基因進行三基因串聯(lián)，建立表達的載體，從而獲得多表位融合的蛋白，通過動物的免疫實驗，獲得血清，并將血清純化，并制備多亞單位抗體[20-21]。為后期研制新型基因工程免疫疫苗及快速檢測試劑提供可靠的實驗基礎，同時也為進一步研究牛乳房炎致病菌無乳鏈球菌的致病機理提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1重組質(zhì)粒構建 AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組原核BL21工程菌由內(nèi)蒙古乳源性致病菌防控工程技術研究中心構建。

1.2主要試劑 在該實驗中利用的主要試劑為NaCl、瓊脂、NaOH顆粒、卡那霉素、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、KCl、NaHPO4、甘油、KH2PO4、考馬斯亮藍R-250、Tris、濃HCl、SDS、過硫酸銨、Acrylamide、BIS、酵母浸粉、Glycine、胰蛋白胨、BPB、異丙醇、醋酸等，均購自哈爾濱博仕生物科技有限公司。

1.3實驗動物 3只家兔，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物室提供。

1.4AP1-AP2-BP克隆基因的表達及樣品處理 將AP1-AP2-BP三聯(lián)基因重組工程菌(pET-30(a+)-AP1-AP2-BP/BL21)用終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進行30 ℃恒溫誘導表達8～9 h。將誘導完成的培養(yǎng)液分裝、離心，并將獲得的沉淀用PBS緩沖液以1∶10的比例懸浮，再對其超聲破碎20 min左右，將破碎完全的菌液4 ℃離心20 min，取上清并用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。

1.5AP1-AP2-BP蛋白粗提取及純化 選用15%～50%的硫酸銨顆粒對已獲得的樣品進行粗提取，優(yōu)化確定其最佳質(zhì)量濃度，并將其4 ℃離心，將獲得的蛋白質(zhì)沉淀用含有20 mmol/L咪唑的PBS緩沖液進行懸浮，并將混合液放入透析袋中處理24 h。利用親和層析的方法對獲得樣品進行純化，蛋白層析柱的填料選用Ni NTA Beads 6FF，恒流泵的流速保持在4.5，將樣品過柱處理。將獲得的純化蛋白AP1-AP2-BP進行SDS-PAGE凝膠電泳及Protein A280測量。

1.6家兔抗AP1-AP2-BP融合抗原的亞單位抗體制備 將飼養(yǎng)的3只家兔進行分組，其中2只家兔為實驗組，另1只為對照組。用鋁膠水溶性佐劑與純化后的AP1-AP2-BP蛋白以1∶5的比例混合，采用腹部皮下肌肉多點注射的方式進行免疫，每只家兔免疫抗原含量為0.5 mg/mL，免疫劑量為500 μL/只。每次免疫前采集家兔耳靜脈血液約10 mL，每隔7 d進行1次免疫，共免疫4次，從第3次免疫開始，免疫劑量調(diào)整為1.0 mL/只。

1.7間接-ELISA檢測亞單位抗體滴度 根據(jù)檢測需求將包被抗原AP1-AP2-BP、待測血清、羊抗兔IgG HRP標記抗體進行倍比稀釋，根據(jù)檢測試劑盒的說明進行操作，并通過全自動酶標檢測儀讀取檢測數(shù)據(jù)，并進行統(tǒng)計學處理。

1.8AP1-AP2-BP亞單位抗體的純化 根據(jù)天地人和抗體的親和層析柱說明書配置純化Buffer，并用層析柱對血清IgG進行純化，將純化獲得的IgG進行SDS-PAGE凝膠電泳及Protein A280檢測。

2 結 果

2.1重組質(zhì)粒誘導表達結果 將AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌進行IPTG誘導后，對其SDS-PAGE凝膠電泳，通過實驗圖片的條帶對比可以確定AP1-AP2-BP蛋白的分子量大小約為65 kDa，該結果與預測分子質(zhì)量大小相符，條帶清晰，見圖1。

1: IPTG誘導前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌; 2: IPTG誘導前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎沉淀; 3: 低分子質(zhì)量蛋白Marker(116～18 kDa); 4: IPTG誘導前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清; 5: IPTG誘導后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌; 6: IPTG誘導后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清; 7: IPTG誘導后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎沉淀

2.2IPTG誘導劑濃度的優(yōu)化結果 通過5組(0.4 mmo1/L，0.6 mmo1/L，0.8 mmo1/L，1.0 mmo1/L，1.2 mmo1/L)不同IPTG終濃度對菌液進行相同條件的8 h培養(yǎng)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定后可知，伴隨著IPTG終濃度的不斷提高，其蛋白的表達量有所增強，但持續(xù)升高IPTG終濃度并沒有顯著變化，因此，確定IPTG誘導劑終濃度為1.0 mmo1/L，見圖2。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG誘導前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3-7：分別為0.4～1.2 mmo1/L 5個濃度梯度的IPTG誘導后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清

2.3誘導溫度優(yōu)化結果 用最佳的IPTG濃度，分別在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃條件下對AP1-AP2-BP菌液誘導8 h，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，其蛋白的表達量也有所提升，而且在30 ℃的時候，蛋白表達量有顯著提高。但再繼續(xù)升溫，蛋白表的達量無明顯變化，可判定30 ℃是最佳的誘導溫度，見圖3。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG誘導前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3-7：在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃誘導的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清

2.4抗原蛋白鹽析處理硫酸銨質(zhì)量濃度優(yōu)化結果

通過對硫酸銨的質(zhì)量濃度設置，將上清液分為8組進行AP1-AP2-BP蛋白的粗提取，經(jīng)SDS-PAGE電泳可知，在硫酸銨的濃度為20%時，AP1-AP2-BP蛋白的粗提取最理想，該濃度下其雜帶最少，見圖4。

1：IPTG誘導后三基因串聯(lián)重組工程菌；2：IPTG誘導后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3-5：15%～25%硫酸銨粗提AP1-AP2-BP重組蛋白；6:低分子量蛋白Marker；7-11:30%～50%硫酸銨粗提AP1-AP2-BP重組蛋白

2.5AP1-AP2-BP重組蛋白懸浮緩沖液的優(yōu)化結果 通過SDS-PAGE凝膠電泳實驗結果表明，利用含20 mmol/L咪唑的PBS溶液做懸浮液處理后的回收率比利用pH值為8.5的Tris-Cl溶液處理后的回收率更高，其效果更為理想，見圖5。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG誘導后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3：含有20 mmol/L咪唑的PBS緩沖液的懸浮液；4：pH值為8.5的Tris-Cl緩沖液的懸浮液

2.6AP1-AP2-BP重組蛋白最優(yōu)純化結果 通過對AP1-AP2-BP蛋白純化過程的優(yōu)化與改良，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，純化的AP1-AP2-BP蛋白質(zhì)量濃度達到4.353 mg/mL，與優(yōu)化前直接純化相比回收率提高了81%，見圖6。

1：低分子量蛋白Marker；2：洗滌液洗滌；3-6：洗脫液洗脫

2.7血清中抗體的滴度測定結果 對家兔血清中抗體的滴度進行了ELISA測定，測定結果顯示，家兔血清在免疫后抗體的水平逐漸上升，且從第3周開始抗體的水平明顯提升，在第4周時抗體滴度達1∶5 600，該結果表明家兔經(jīng)過免疫所產(chǎn)生的抗體具有很高的滴度水平，見圖7。

圖7 抗體滴度的檢測Fig.7 Detection of antibody titer

2.8抗體的制備 通過親和層析的方法對血清進行純化，純化得到的IgG的濃度非常理想，通過Protein A280的測量，IgG的最高濃度為9.102 mg/mL，表明抗體含量達到要求，符合實驗預期，見圖8。

1-4：洗脫液洗脫；5-6：洗滌液洗滌；7：純化的AP1-AP2-BP蛋白；8：低分子量蛋白Marker

3 討 論

本實驗用層析的方法對AP1-AP2-BP重組的蛋白進行了多次相同條件的純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳可知，在初步純化過程中在分子量約為33 kDa處出現(xiàn)了明顯雜帶，效果不是很理想。因此，本實驗對重組蛋白的純化過程進行了系統(tǒng)的優(yōu)化處理，首先采用硫酸銨沉淀法對重組蛋白進行了粗提取，其次為提高蛋白回收率對粗提蛋白懸浮液的選擇進行了比對實驗，最后再對回收蛋白進行親和層析純化，并將獲得的純化蛋白進行SDS-PAGE電泳處理，且通過Protein A280比對了重組蛋白的回收率。

實驗優(yōu)化前測得AP1-AP2-BP純化蛋白濃度最高為2.396 mg/mL，濃度最低為1.370 mg/mL。實驗優(yōu)化后測得AP1-AP2-BP純化蛋白濃度最高為4.353 mg/mL，最低為3.032 mg/mL。且通過SDS-PAGE凝膠電泳圖對比分析，不難發(fā)現(xiàn)實驗優(yōu)化后的SDS-PAGE凝膠電泳圖中分子量約為33 kDa處的雜帶明顯減少，而且Protein A280測得的重組蛋白的純化程度也有顯著提升。

本實驗首次制備兔源牛乳腺炎致病性無乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼AP1-AP2-BP重組蛋白抗原的亞單位抗體，為下一步制備快速檢測牛乳中致病性無乳鏈球菌奠定了堅實的基礎。