郝 剛，陳 莉，俞蘊(yùn)莉，王 吉，王猛猛，屈昱晨

（1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104；蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院2.臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，3.腫瘤科，江蘇 蘇州 215004）

氟喹諾酮類藥物是一類化學(xué)合成抗菌藥，由于其普遍具有良好的耐受性和廣譜抗菌活性，作為一線抗感染化療藥物在臨床上廣泛使用，主要用于治療尿路、腸道、呼吸道以及皮膚軟組織、腹腔和骨關(guān)節(jié)等感染，取得良好療效。糖尿病患者極易發(fā)生皮膚感染、肺炎以及泌尿系統(tǒng)感染。氟喹諾酮藥物是糖尿病患者的常見用藥。然而，在氟喹諾酮類藥物廣泛應(yīng)用的同時(shí)，其臨床應(yīng)用的安全性日益受到人們的重視。近年來，人們?cè)絹碓疥P(guān)注這類藥物造成血糖異常的不良反應(yīng)，而且，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病能增大氟喹諾酮藥物誘發(fā)糖代謝障礙的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］，并且高血糖的發(fā)生率高于低血糖。在我國臺(tái)灣地區(qū)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，莫西沙星（moxifloxacin，Mox）導(dǎo)致血糖升高的發(fā)生概率高于左氧氟沙星和環(huán)丙沙星［3］。目前，氟喹諾酮藥物引起血糖升高的機(jī)制并不清楚，可能是藥物直接作用于糖代謝過程，也可能是多種因素的共同作用結(jié)果［4］。

有文獻(xiàn)報(bào)道，抗生素由于影響腸道菌群以及一些膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)而能影響體內(nèi)膽汁酸組成［5-7］。膽汁酸是一類膽烷酸的總稱，是膽汁的主要成分。肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇在CYP7A1等代謝酶的作用下最終生成初級(jí)膽汁酸，膽酸（cholic acid，CA）和鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合生成結(jié)合型膽汁酸儲(chǔ)存于膽囊分泌進(jìn)入十二指腸，在腸道菌的作用下，進(jìn)行7-α脫羥作用生成次級(jí)膽汁酸，去氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）和石膽酸（lithocholic acid，LCA）［5］。近年來，對(duì)于膽汁酸生理作用的認(rèn)識(shí)已從最初的促進(jìn)脂肪消化吸收擴(kuò)展到對(duì)機(jī)體多種功能的調(diào)控作用，包括調(diào)控代謝過程，胰島素敏感性以及腸道內(nèi)分泌功能［6-7］。腸道膽汁酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及體內(nèi)膽汁酸代謝過程對(duì)維持機(jī)體脂類代謝和糖代謝的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。

然而，氟喹諾酮藥物對(duì)膽汁酸譜的影響目前并不清楚。本研究選擇臨床常用的氟喹諾酮藥物Mox，以自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠為糖尿病模型，旨在研究Mox對(duì)糖尿病狀態(tài)下血中膽汁酸組成的影響，并從膽汁酸代謝譜的角度初步評(píng)價(jià)其與Mox引起血糖波動(dòng)的相關(guān)性，為氟喹諾酮藥物的臨床合理應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠，SPF級(jí)，雄性，8～9 周齡，體質(zhì)量217～235 g；正常 Wistar大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量219～227 g，均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。大鼠飼養(yǎng)于蘇州藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心。自然光照、室溫20～24℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。本研究開展前經(jīng)蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過。

Mox（生產(chǎn)批號(hào)BJ40141）由德國拜耳公司生產(chǎn)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司分裝。CA（批號(hào)：SLBH1420V，純度≥98%）、DCA（批號(hào)：BCBQ4388V，純度≥98%）、CDCA（批號(hào)：MKBS2816V，純度≥97%）、熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA，批號(hào)：SLBQ1474V，純度≥99%）、LCA（批號(hào)：BCBS3684V，純度≥95%）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA，批號(hào)：SLBQ5062V，純度≥98%）、?；侨パ跄懰幔╰aurodeoxycholic acid，TDCA，批號(hào)：SLBR0659V，純度≥98%）、?；蛆Z去氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA，批號(hào)：SLBR7538V，純度≥97%）、牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA，批號(hào)：026M4184V，純度≥95%）、?；鞘懰幔╰aurolithocholic acid，TLCA，批號(hào)：SLBQ8462V，純度≥98%）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA，批號(hào)：SLBR1284V，純度：≥ 97%）、甘氨去氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA，批號(hào)：BCBN5741V，純度≥97%）、甘氨鵝去氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA，批號(hào)：SLBM3327V，純度≥97%）、甘氨熊去氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA，批號(hào)：BCBR4054V，純度≥96%）以及 2，2，3，4，4-5氘代石膽酸（D5-LCA，批號(hào)：SH1094V，純度為98 atom%D）購自美國Sigma-Aldrich公司，甘氨石膽酸（glycolithocholic acid，GLCA，批號(hào)：1-TMH-13-4，純度：≥98%）由J&K科技公司提供，乙腈為色譜純，醋酸銨為分析純，水為滅菌注射用水。葡萄糖檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)：API-4000型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystem Sciex公司），1200系列高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 動(dòng)物分組和給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以正常Wistar大鼠作為正常對(duì)照組。GK大鼠隨機(jī)分為模型組和Mox 40 mg·kg-1組，每組5只。Mox組大鼠每天ig給予Mox 40 mg·kg-1，體積為0.01 mL·g-1體質(zhì)量，連續(xù)7 d，模型組及正常對(duì)照組大鼠用溶媒（0.25%CMCNa）代替。最后一次給藥后，各組大鼠禁食不禁水過夜。實(shí)驗(yàn)第8天，各組大鼠ip給予戊巴比妥鈉 60 mg·kg-1，頸動(dòng)脈插管采血，經(jīng)（2～8）℃，1800×g，離心10 min后，取血清于-80℃冰箱保存。樣本采集后，動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下處死。葡萄糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠空腹血糖，LC-MS/MS法測(cè)定各組大鼠血清中15種膽汁酸（CA，CDCA，UDCA，LCA，DCA，TCA，TCDCA，TUDCA，TLCA，TDCA，GCA，GCDCA，GUDCA，GLCA和GDCA）濃度。使用Heml 1.0.3.7軟件產(chǎn)生各組間15種膽汁酸成分的熱圖。

1.3 HPLC-MS/MS法測(cè)定大鼠血清中15種膽汁酸成分的濃度

血清樣本預(yù)處理：吸取200 μL血清樣本至1.5 mL塑料離心管中，加10 μL內(nèi)標(biāo)工作液后再加400 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋1 min，于20 000×g，4℃離心10 min。取上清至1.5 mL塑料離心管中，用真空濃縮儀65℃揮干溶劑，100 μL甲醇：水=1∶1（V/V）復(fù)溶，渦旋1 min，20 000×g，4℃離心10 min，取上清至進(jìn)樣瓶中，最終進(jìn)樣10 μL分析測(cè)定。

色譜條件：使用色譜柱Xterra RP18（4.6 mm×150 mm，5 μm），保護(hù)柱 Phenomenex Security Guard TMC18預(yù)柱（4 mm×3.0 mm）；流動(dòng)相為10 mmol·L-1醋酸銨水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫組成見表1，流速為1000μL·min-1，進(jìn)樣體積為10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子檢測(cè)，掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。電噴霧電壓：-4200 V，碰撞氣：4 psi；氣簾氣：30 psi；霧化氣：50 psi；輔助氣：50 psi；離子源溫度：500℃。15種膽汁酸及內(nèi)標(biāo)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)（母離子，子離子，錐孔電壓，碰撞能量）及保留時(shí)間見表2。

Tab.1 Composition of mobile phase

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 莫西沙星對(duì)GK大鼠血糖的影響

血糖測(cè)定結(jié)果（圖1）顯示，和正常對(duì)照組〔（6.0±0.7）mmol·L-1〕相比，模型組GK大鼠空腹血糖〔（15.7±2.1）mmol·L-1〕顯著升高（P＜0.01），Mox 40 mg·kg-1連續(xù)ig給予GK大鼠7 d后，空腹血糖濃度〔（22.0±6.0）mmol·L-1〕進(jìn)一步升高（P＜0.05），提示Mox引起高血糖。

2.2 Mox對(duì)GK大鼠血清中15種膽汁酸成分濃度的影響

血清中15種膽汁酸成分濃度測(cè)定（表3）及熱圖結(jié)果（圖2）顯示，與正常大鼠相比，模型組大鼠游離型膽汁酸中僅DCA增加0.67倍（P＜0.01），其余游離型膽汁酸均顯著減少（P＜0.01），其中CA減少89%，CDCA減少56%，UDCA減少99%，LCA減少76%；各型?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸均有不同程度的增加，TCA增加6.2倍（P＜0.05），TCDCA增加8.6倍（P＜0.01），TUDCA增加3.3倍（P＜0.01），TLCA增加15.7倍（P＜0.01），TDCA增加15.9倍（P＜0.01）。而各型甘氨酸結(jié)合型膽汁酸的改變并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Tab.2 Retention time and mass spectrum conditions of 15 types of bile acids

Fig.1 Effect of moxifloxacin（Mox）treatment on fasting serum glucose in GK rats.Normal control and model group rats were ig given 0.25%CMCNa（vehicle），Mox rats were ig given Mox 40 mg·kg-1for 7 d，respectively.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

Fig.2 Effect of Mox on bile acid profiles in serum of GK rats by heatmap presentation.See Fig.1 for the rat treatment.The heatmap was generated using HemI 1.0.3.7.Red indicates an increased value，whereas blue indicates a decreased value.

連續(xù)ig給予Mox 7 d后，比較給藥組GK大鼠與模型組GK大鼠血清中的膽汁酸代謝譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mox處理組GK大鼠血中CDCA濃度降低50%（P＜0.05），DCA降低60%（P＜0.01），而血中CA，UDCA，TCA，TDCA，GCA，GCDCA及GDCA分別增加了3.4倍（P＜0.01）、9.9倍（P＜0.01）、5.7倍（P＜0.05）、27.1倍（P＜0.05）、4.1倍（P＜0.05）和12.0倍（P＜0.05），其余膽汁酸成分濃度與模型組大鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改變。

2.3 Mox對(duì)GK大鼠血清初級(jí)膽汁酸/次級(jí)膽汁酸、結(jié)合型膽汁酸/游離型膽汁酸、12 α羥基化膽汁酸/12 α未羥基化膽汁酸及疏水指數(shù)的影響

根據(jù)膽汁酸的不同分類，進(jìn)一步進(jìn)行分類（表4）比較（圖3），在正常大鼠血清膽汁酸代謝譜中，初級(jí)膽汁酸與次級(jí)膽汁酸比值為10.1±2.6，結(jié)合型膽汁酸與游離型膽汁酸比值為0.10±0.02，12α羥基化膽汁酸與12α未羥基化膽汁酸比值為3.0±1.0，而在GK大鼠血清膽汁酸代謝譜中，三者比值分別為初級(jí)膽汁酸與次級(jí)膽汁酸（1.9±0.6，P＜0.01）顯著降低，結(jié)合型膽汁酸與游離型膽汁酸（1.5±0.4，P＜0.05）顯著升高，12α羥基化膽汁酸與12α未羥基化膽汁酸比值為2.2±1.1，與正常大鼠相比略有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Mox組大鼠血中膽汁酸代謝譜以上3項(xiàng)比值較模型組GK大鼠均顯著升高，分別為6.3±1.4，4.5±1.4和6.2±2.8（P＜0.05）。

對(duì)比各組大鼠疏水性指數(shù)（hydrophobicity index，HI）值，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠HI為0.22±0.05，模型組GK大鼠血清膽汁酸池的HI值顯著升高（0.31±0.08，P＜0.05），Mox給藥后GK大鼠血清膽汁酸池的HI值下降為0.18±0.04，與正常組大鼠相比無顯著性改變（圖3）。

Tab.4 Subgrouping of measured bile acids

Fig.3 Ratio of primary/secondary bile acids,conjugated/unconjugated bile acids and 12 α-OH/non-12 α-OH bile acids.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=5.HI：hydrophobicity index.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.4 莫西沙星引起膽汁酸代謝譜改變與其所致血糖波動(dòng)的相關(guān)性評(píng)價(jià)

采用Pearson相關(guān)性分析評(píng)價(jià)3組大鼠血糖與膽汁酸代謝譜變化的相關(guān)性。結(jié)果表明（表5），大鼠血糖改變與血清中結(jié)合型膽汁酸/游離型膽汁酸比值的相關(guān)系數(shù)為0.784（P＜0.01），與12α羥基化膽汁酸/12α未羥基化膽汁酸比值的相關(guān)系數(shù)為0.624（P＜0.05），提示Mox引起的GK大鼠血糖升高與血清中上述2項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)。

Tab.5 Correlation analysis between serum glucose and bile acids

3 討論

糖尿病患者表現(xiàn)為不同程度的糖代謝和脂類代謝紊亂，血清總膽汁酸顯著增加，膽汁酸代謝失衡［12］，然而目前的研究未能揭示糖尿病狀態(tài)下的膽汁酸代謝譜的改變。本研究使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)法，測(cè)定大鼠血中5種游離型膽汁酸——CA，CDCA，UDCA，DCA和LCA及其相應(yīng)的牛磺酸結(jié)合型和甘氨酸結(jié)合型共15種膽汁酸的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性糖尿病GK大鼠血中游離型膽汁酸中除DCA有顯著增加外，其余游離型膽汁酸均顯著減少，?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸顯著增加，甘氨酸結(jié)合型膽汁酸無顯著改變，提示游離型膽汁酸和?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸的改變可能與GK糖尿病血糖升高相關(guān)。Mox干預(yù)GK大鼠7 d后，GK大鼠血清中CDCA及DCA水平進(jìn)一步降低，CA，UDCA，TCA，TDCA，GCA，GCDCA及GDCA進(jìn)一步增加，而Mox對(duì)其他膽汁酸亞型的影響則是逆轉(zhuǎn)了GK大鼠中血清膽汁酸的改變，使之與正常大鼠更為接近。

由于體內(nèi)循環(huán)膽汁酸池包含著大量的膽汁酸亞型，每種膽汁酸分子與體內(nèi)各膽汁酸受體的親和力也都存在差異，因此很難闡明單一膽汁酸亞型濃度的變化對(duì)機(jī)體代謝的影響。我們進(jìn)一步對(duì)血清膽汁酸譜分類分析，比較初級(jí)膽汁酸與次級(jí)膽汁酸比值，結(jié)合型膽汁酸與游離型膽汁酸比值以及12α羥基化膽汁酸與12α未羥基化膽汁酸的比值在各組大鼠間的差異。此外，由于各膽汁酸亞型電離狀態(tài)，羥基數(shù)目、位置等存在差異，因此不同膽汁酸疏水性具有很大不同，膽汁酸譜的疏水性指數(shù)能定量反映循環(huán)膽汁酸親疏水平衡［13］。由于膽汁酸的親水性能影響其在體內(nèi)某些疏水域（如細(xì)胞膜、膠束或某些受體位置）的溶解性能或結(jié)合能力，因此膽汁酸譜的疏水性指數(shù)的變化可用來評(píng)估體內(nèi)膽汁酸譜改變對(duì)機(jī)體的影響［14］。盡管目前膽汁酸譜的疏水性指數(shù)與機(jī)體代謝的關(guān)系還未被完全闡明，但有文獻(xiàn)報(bào)道2型糖尿病患者膽汁酸池的疏水性指數(shù)較正常人顯著性升高［14］，這與我們的研究結(jié)果一致，模型組GK大鼠的膽汁酸池疏水性指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，糖尿病GK大鼠血中初級(jí)膽汁酸/次級(jí)膽汁酸顯著降低，結(jié)合型膽汁酸/游離型膽汁酸顯著升高，而12α羥基化膽汁酸/12α未羥基化膽汁酸的比值并無顯著改變。Mox干預(yù)后能顯著增加糖尿病GK大鼠血中上述3項(xiàng)比值，而對(duì)膽汁酸池的疏水性指數(shù)影響不明顯。

本研究結(jié)果表明，Mox能導(dǎo)致糖尿病GK大鼠空腹血糖進(jìn)一步升高。對(duì)各組大鼠血糖及膽汁酸代謝譜參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)合型膽汁酸和游離型膽汁酸比值與各組大鼠血糖波動(dòng)呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，12α羥基化膽汁酸和12α未羥基化膽汁酸比值也與血糖波動(dòng)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系，提示Mox引起血糖升高可能是由于改變了膽汁酸代謝譜中上述2項(xiàng)比值。

本研究揭示了糖尿病狀態(tài)下血清膽汁酸譜的改變，以及Mox用藥后對(duì)糖尿病狀態(tài)下血清膽汁酸譜的影響，并從膽汁酸代謝譜的角度初步評(píng)價(jià)其與Mox引起血糖升高的相關(guān)性，提示該類藥物的使用需關(guān)注患者膽汁酸代謝譜，為減少該類藥物引起的血糖紊亂不良反應(yīng)提供新的理論依據(jù)，而對(duì)于Mox引起的膽汁酸代謝譜改變?cè)谄渌赂哐遣涣挤磻?yīng)中的機(jī)制，我們將開展進(jìn)一步的研究。