鄭雙艷，劉清，張霞麗，謝彥海*

1. 南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)中心，江西 南昌 330006；2. 江西省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新基金管理中心，江西 南昌 330007

重金屬污染水體現(xiàn)象日漸嚴(yán)重，主要包括非必需金屬離子和必需金屬離子。非必需金屬離子包括Cd2+、Pb2+和Hg2+等，必需金屬離子包括Cu2+和 Zn2+等，它們對水生生物和人類均有很強(qiáng)的毒性（Anrew et al.，2003；Pretto et al.，2010），當(dāng)這些離子濃度較低時，對生物體內(nèi)酶的活性起重要的誘導(dǎo)作用，但其濃度過高時，對生物體具有一定毒性（Blanco-penedo et al.，2006）。這些重金屬離子能長期存在自然水體中，水生生物遭受重金屬污染后，通過食物鏈危害人體的健康（Chale，2002）。

近些年，通過檢測魚（Lu et al.，2015）、軟體動物（Rossi et al.，2016）、甲殼動物（Harms et al.，2014）和藻類（Lauritano et al.，2016）等水生生物體內(nèi)相關(guān)應(yīng)激蛋白的mRNA表達(dá)程度和酶活性，可以對早期水體環(huán)境污染起到直接指示作用。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）是一類多基因家族編碼的二聚體可溶性蛋白的超家族酶系，是生物體內(nèi)相關(guān)應(yīng)急蛋白之一，具有消除體內(nèi)過氧化物及解毒的雙重功能（李雅琴等，2013；Chemale et al.，2010），主要功能是對異源有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷和對激素、內(nèi)及外源化合物進(jìn)行細(xì)胞間運輸。解毒的作用機(jī)理是促進(jìn)還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的活性基團(tuán)——巰基與毒素結(jié)合形成親電子試劑（程煒軒等，2009），使親電子的疏水化合物變成親水物質(zhì)，易于從膽汁或尿液中排出。GST通過催化過氧化氫的氧化還原反應(yīng)，清除體內(nèi)自由代謝反應(yīng)產(chǎn)生的氧化自由基和過氧化物，參與體內(nèi)免疫反應(yīng)（羅凱婭等，2012），保護(hù)細(xì)胞免受外界脅迫造成的損傷（張永國等，2006）。研究重金屬污染過程中貝類肝胰腺中GST基因表達(dá)特性和GST活性變化特征，有助于深入認(rèn)識貝類在受到重金屬脅迫時產(chǎn)生的分子應(yīng)激反應(yīng)及解毒機(jī)理。

河蜆（Corbicula fluminea），雙殼類軟體動物，棲息于淡水的江河、湖泊等，是數(shù)量較大的重要底棲生物，是江河水庫等淡水生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢物種，影響著水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)。河蜆生活史較長，個體較大，以浮游綠藻為食，能直接反映水體和沉積物的污染（Xie，2017）。目前，河蜆作為指示生物已被用于評價或監(jiān)測由重金屬、礦山開采排放物、生活污水等引起的水體污染狀況（曾麗璇等，2004）。

本研究以河蜆為對象，采用RACE方法克隆其GST基因cDNA全長；在外源重金屬Cd2+、Cu2+、Pb2+單一脅迫下，觀察不同時間段GST mRNA表達(dá)量和酶活性變化，分析它們與重金屬脅迫的時間關(guān)系，并由此判明河蜆GST mRNA表達(dá)和酶活性是否具有作為水體重金屬污染的潛在生物標(biāo)志物特征，為河蜆內(nèi)臟GST mRNA和酶生物標(biāo)志物評價指標(biāo)的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與試劑

河蜆采集于鄱陽湖地區(qū)。CdCl2、CuSO4·5H2O、Pb(CHOO)2均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用雙蒸餾水將其配制成濃度分別 750、150、4500 μg·mL-1的母液。GST活性測試盒和考馬斯亮蘭均購自南京建成生物工程研究所。SMARTTMRACE Amplificatuin Kit，Trizol Reagent，PrimeScriptTMRT reagent Kit，SYBR? Premix Ex TaqTMII購于 TaKaRa公司。

1.1.2 主要儀器

iMark酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；UV 752B紫外可見分光光度計（天津市普銳斯儀器有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5804R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；SSW-600-2S型電熱恒溫水槽（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ISO-9001電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SZ-93A自動雙重純水蒸餾器（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；NanoPhotometer Pearl蛋白核酸分析儀（德國Implen公司）；7500 Real Time PCR System（美國ABI公司）等。

1.2 河蜆GST基因克隆

1.2.1 總RNA的提取以及cDNA合成

采用Trizol法從河蜆的肝胰腺中提取總RNA。RNA的完整性和質(zhì)量分別用1%瓊脂糖凝膠電泳和蛋白核酸分析儀進(jìn)行檢測。完整的 RNA用SMARTTMRACE Amplificatuin Kit（Takara 公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒的使用說明，合成用于3′, 5′RACE擴(kuò)增的cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GST基因全長克隆及測序

從NCBI基因文庫里獲得河蜆GST基因序列片段（GenBank登陸號：KF218346.1），利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計 3′RACE 和 5′RACE 特異性引物（表1），按照SMARTTMRACE Amplification Kit試劑盒操作說明進(jìn)行擴(kuò)增。3′RACE擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 80 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。5′RACE 擴(kuò)增條件：94 ℃30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，20個循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體pMD18-T Vecter（TaKaRa公司）轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性基因進(jìn)行克隆后交上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。

表1 河蜆GST基因克隆及表達(dá)分析引物Table 1 Primer sequences for GST cloning and expression analysis in C. fluminea

1.2.3 GST基因生物信息學(xué)分析

應(yīng)用NCBI中的Blast等工具對GST基因進(jìn)行同源性分析，并用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列比對；采用 Smart服務(wù)器分析保守域和功能位點；SignalIP 4.0工具對該基因的信號肽進(jìn)行預(yù)測分析；運用軟件MEGA 5.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 重金屬對河蜆的急性脅迫

1.3.1 河蜆處理

采用半靜態(tài)暴露試驗，模擬重金屬（Cd2+、Cu2+、Pb2+）對河蜆的急性脅迫試驗。供試河蜆體長為 3－5 cm，試驗前將其暫養(yǎng)在長寬高為 30 cm×20 cm×20 cm水族箱中，1周后開始實驗。河蜆被隨機(jī)分成4組，分別為：Cd2+脅迫組、Cu2+脅迫組、Pb2+脅迫組和對照組，每組 50－60只。Cd2+、Cu2+和Pb2+3個實驗組中金屬脅迫的濃度均為10 μg·L-1，對照組中不添加任何重金屬離子。脅迫0、6、12、24、48和72 h，分別在每個脅迫時間點隨機(jī)選取6只河蜆，解剖取適量的肝胰腺組織，用于提取總RNA和酶活性測定實驗。

1.3.2 總RNA的提取及cDNA的合成

總RNA提取方法同1.2.1反轉(zhuǎn)錄方法參考試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit）說明書進(jìn)行。

1.3.3 Real-time PCR檢測GST mRNA的表達(dá)

根據(jù)本實驗室克隆的河蜆 GST基因的 cDNA序列（Genebank：KX211963），以β-actin作為內(nèi)參基因（Genebank：EF446608.1），設(shè)計特異性熒光定量引物（見表1）PCR反應(yīng)體系為20 μL，分別含有 2×SYBRPremix ExTaqTM10 μL，ROX II 0.4 μL，GST mRNA及β-actin的上下游引物各（10 U）0.8 μL，1∶10 稀釋的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA2 μL和 RNase free H2O 6 μL。擴(kuò)增條件為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個樣本均做 3個平行樣。用7500 system SDS Software v 2.2自動進(jìn)行融解曲線分析和GST mRNA基因相對表達(dá)含量分析。本實驗GST基因相對表達(dá)量利用GST基因mRNA水平比內(nèi)參基因mRNA水平的相對倍數(shù)來表示，即采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.3.4 GST活性測定

GST活力的測定采用南京建成生物工程研究所的GST測試盒測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗分析，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 GST基因的全長cDNA序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用 RACE技術(shù)克隆了河蜆 GST基因（GenBank登錄號：KX211963），全長952 bp，其中5′非編碼區(qū)為30 bp，3′非編碼區(qū)為268 bp，開放閱讀框為654 bp，編碼一個由217個氨基酸組成的多肽，預(yù)測理論等電點PI為5.98，分子量為25.169 kD，氨基酸序列中含有GST基因家族特有的GST-N結(jié)構(gòu)域和GST-C結(jié)構(gòu)域（圖1陰影部分），SignalP 4.1程序分析表明該 GST蛋白不存在信號肽，TMHMM軟件分析表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用Bioedit軟件對河蜆GST氨基酸序列與其他物種的GST氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析，結(jié)果如圖2所示。分析表明，河蜆GST基因與菲律賓簾蛤（Rudiraps philippinarum）同源性最高，為90.32%，河蜆與近江牡蠣（Crassostreaariakensis）、盤鮑（Haliotis discus）、魁蚶（Scapharacabroughtonii）、霸王蓮花青螺（Lottiagigantea)、斑節(jié)對蝦（Penacus monodon）、羅非魚（Oreochromisniloticus）、錦鯉（Cyprinuscarpiao）、大西洋鯡（Clupeaharengus)的相似性分別為 74.65%、73.27%、72.81%、70.51%、64.55%、64.09%、60.81%、60.81%。結(jié)果說明，河蜆GST基因與菲律賓簾蛤同屬一支。

2.2 河蜆GST mRNA表達(dá)及活性變化

2.2.1 Cd2+脅迫下，河蜆GST mRNA表達(dá)及酶活性變化

圖1 河蜆GST基因的核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of C. fluminea GST

圖2 河蜆GST與其他物種GST的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of GST of C. fluminea and other species based on amino acid sequence

圖3 肝胰腺GST mRNA表達(dá)水平（A）和活性（B）變化Fig. 3 Changes of GST mRNA expression (A) and activity in hepatopancreas (B)

經(jīng)Cd2+脅迫后，河蜆GST mRNA表達(dá)水平和酶活性均隨著時間延長逐漸增強(qiáng)，到達(dá)峰值后又逐漸減弱，脅迫組GST mRNA表達(dá)量在24 h和48 h分別約為對照組的4倍和3倍，與對照組相比其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3A）；GST酶活性在 24 h [(99.36±5.21) U·mg-1]與對照組相比其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B）。

2.2.2 Cu2+脅迫下，河蜆GST mRNA表達(dá)及酶活性變化

經(jīng)Cu2+脅迫后，河蜆GST mRNA表達(dá)水平和酶活性均隨著時間延長逐漸增強(qiáng)，到達(dá)峰值后又逐漸減弱，脅迫組GST mRNA表達(dá)量在12 h約為對照組的2倍，且與對照組相比其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4A）。脅迫組GST酶活性在24 h[(104.04±8.21) U·mg-1] 和 48 h [(123.58±6.13)U·mg-1]與對照組相比其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖 4B）。

2.2.3 Pd2+脅迫下，河蜆GST mRNA表達(dá)及酶活性變化

經(jīng)Pd2+脅迫后，河蜆GST mRNA表達(dá)水平和酶活性均隨著時間延長逐漸增強(qiáng)，到達(dá)峰值后又逐漸減弱，脅迫組GST mRNA表達(dá)量在24 h和48h約分別為對照組的2倍和3倍，且與對照組相比其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5A）。脅迫組GST 酶活性在 48 h [(50.79±4.13) U·mg-1]與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5B）。

圖4 肝胰腺GST mRNA表達(dá)水平（A）和活性變化（B）Fig.4 Changes of GST mRNA expression (A) and activity in hepatopancreas (B)

圖5 肝胰腺GST mRNA表達(dá)水平（A）和活性變化（B）Fig. 5 Changes of GST mRNA expression (A) and activity in hepatopancreas (B)

3 討論

3.1 河蜆GST序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究采用RACE方法克隆獲得了河蜆GST完整序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析表明基因全長952 bp，編碼217個氨基酸，分子量為25.169 kD，氨基酸序列中含有GST基因家族特的有兩個保守性不同結(jié)構(gòu)域（Sheehan et al.，2001）：具有保守的N末端結(jié)構(gòu)域（GST-N）含有谷胱甘肽（GSH）結(jié)合位點；具有不保守的C末端結(jié)構(gòu)域（GST-C）可以結(jié)合不同底物（左偉東等，2007）。SignalP 4.1程序分析表明該GST蛋白不存在信號肽，TMHMM 軟件分析表明該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，河蜆GST與菲律賓簾蛤親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步說明本研究克隆得到的GST基因?qū)儆诤油楪ST基因，為后續(xù)研究該基因結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

3.2 重金屬脅迫下河蜆GST mRNA的表達(dá)分析與酶活性變化

對GST mRNA相對定量表達(dá)和酶活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)河蜆在 Cd2+、Cu2+、Pb2+單一脅迫下均可使GST mRNA表達(dá)升高、酶活性增強(qiáng)，且表現(xiàn)為時間依賴型，隨著時間延長內(nèi)臟中GST mRNA表達(dá)和酶活性逐漸增強(qiáng)，表明谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對環(huán)境脅迫尤為敏感，其活性可被氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)而做出積極的應(yīng)答反應(yīng)，這與胡影等（2016）的研究結(jié)果是一致的，說明污染物處理時間是誘導(dǎo)GST活動的重要因素，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因為生物體在遇到外界環(huán)境有毒物質(zhì)時，GST具有消除中間產(chǎn)物與體內(nèi)自由基的雙重功能，將體內(nèi)潛在的毒性物質(zhì)和親電的疏水化合物變成親水化合物，使之降解排出體外（聶湘平等，2008）。隨著暴露時間的延長，GST mRNA和活性達(dá)到峰值后逐漸下降，可能與河蜆對環(huán)境的適應(yīng)，體內(nèi)自由基被清除和酶活性逐漸喪失有關(guān)。然而，3種金屬離子脅迫的表達(dá)特征略有不同，即表達(dá)峰值出現(xiàn)的時間點差異：在 Cd2+脅迫下，GST mRNA表達(dá)和酶活性峰值均出現(xiàn)在24 h；在Cu2+脅迫下，GST mRNA表達(dá)峰值出現(xiàn)在12 h，酶活性峰值出現(xiàn)在48 h；在Pb2+脅迫下，GST mRNA表達(dá)和酶活性峰值均出現(xiàn)在48 h，以上表達(dá)特征差異可能是因為 GST對不同的重金屬的解毒能力的存在差異。

以往利用 Cu2+和 Cd2+脅迫厚殼貽貝（Mytilus coruscus）能使其內(nèi)臟中GST基因表達(dá)升高，到達(dá)峰值后又逐漸下降，且表現(xiàn)為時間依賴型（劉慧慧等，2014）。利用污染物對貝類產(chǎn)生刺激時，也發(fā)現(xiàn)貝類體內(nèi)的GST酶活性顯著升高，從而保護(hù)自身細(xì)胞免受外界脅迫環(huán)境損傷（Blanchette et al.，2002）。另外，有研究發(fā)現(xiàn)脅迫櫛孔扇貝(Chlamys farreri)可以誘導(dǎo)其 GSTPi表達(dá)且具有一定時間劑量效應(yīng)（苗晶晶，2010），已有研究表明底泥浸出液對GSTD基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)也顯示出先誘導(dǎo)后抑制作用（蔣玫等，2013），以上研究結(jié)果均與本實驗結(jié)果類似。GST mRNA轉(zhuǎn)錄水平和酶活性的提高意味著體內(nèi)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平提高，間接證明了 GST的誘導(dǎo)是生物體對化學(xué)物質(zhì)脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。鑒于此敏感反應(yīng)，GST能夠作為環(huán)境污染指示分子（Lenartova et al.，2000），可直觀反映水體環(huán)境的污染狀況。

以河蜆作為環(huán)境監(jiān)測的指示生物，第一，因為河蜆是淡水水域系統(tǒng)底棲動物的重要組成部分，分布廣，生活周期長，對環(huán)境變化敏感；第二，當(dāng)水體受到污染時，最先接觸污染物的是活動能力差的貝類品種，由于其不具有回避能力，暴露在污染物中的時間長，有害物質(zhì)易發(fā)生富集，進(jìn)而影響其正常的生理代謝。因此，通過對河蜆體內(nèi)GST mRNA和酶活性進(jìn)行實時監(jiān)測，可加強(qiáng)對水體中重金屬污染程度的監(jiān)測。

4 結(jié)論

本研究通過克隆獲得河蜆GST mRNA完整序列，由進(jìn)化樹分析得知河蜆GST與菲律賓簾蛤親緣關(guān)系最近。河蜆體內(nèi)GST mRNA表達(dá)量和酶活性對水體中 Cd2+、Cu2+、Pb2+高度敏感且均隨迫時間的延長呈先增強(qiáng)后減弱趨勢，說明河蜆內(nèi)臟中GST可以作為水體環(huán)境重金屬污染的監(jiān)測指示分子。