王秀麗，張媛，李紅霞，袁露，李愛玲，曹翠萍，劉博，辛凌翔，彭國瑞，李建，蔣玉文*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. 齊魯動物保健品有限公司，濟南 250100；3. 遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽 111000)

沙門氏菌能感染多種動物，大部分沙門氏菌具有較強的致病性，成為肉類產(chǎn)品的主要污染源[1]。二〇一五版《中國獸藥典》中收錄的沙門氏菌類活疫苗有仔豬副傷寒活疫苗(C500株)、沙門氏菌馬流產(chǎn)活疫苗、牦牛副傷寒活疫苗、牛副傷寒滅活疫苗等[2]?；罹嫈?shù)是該類疫苗質(zhì)量標準的重要參數(shù)，對于評價疫苗的安全性和免疫效力有重要意義；該類疫苗的效力檢驗(免疫攻毒法)也需要估計測毒及攻毒菌數(shù)?；罹嫈?shù)受到多種因素影響，如培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)條件、平板表面濕度、檢驗員的主觀差異等，導致按照標準操作規(guī)程計數(shù)的結(jié)果不一致。在近幾年的檢驗過程中，多次出現(xiàn)初次檢驗結(jié)果不符合規(guī)定，更換培養(yǎng)基或檢驗員重檢后檢驗結(jié)果符合規(guī)定的情況，因目前沒有活菌計數(shù)的參照物，對培養(yǎng)基的促生長能力及檢驗員的計數(shù)結(jié)果無科學評價的方法，重復檢驗降低工作效率，浪費實驗材料。本研究試圖研制沙門氏菌類疫苗活菌計數(shù)的參考疫苗，以期更加科學地評價沙門氏菌類疫苗活菌計數(shù)的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 參考疫苗候選物的制備及分發(fā) 按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》[3]的方法，制備一批(500瓶)仔豬副傷寒活疫苗(20頭份/瓶)，作為參考疫苗候選物。按照現(xiàn)行《中國獸藥典》三部對參考疫苗候選物的性狀、純粹檢驗、活菌計數(shù)、真空度測定、剩余水分等參數(shù)進行檢驗。從500 瓶參考疫苗候選物中隨機抽取100 瓶，置于隔熱泡沫塑料盒內(nèi)，并放入生物冰袋，最外層包裝紙箱，快遞至A單位、B單位和C單位，收到樣品后立即置于-70 ℃以下冰箱中保存[4]。

1.2 培養(yǎng)基及耗材 用6批原材料按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版附錄配制6批普通瓊脂培養(yǎng)基，用上述培養(yǎng)基對隨機抽取的3瓶參考疫苗候選物進行活菌計數(shù)，篩選出適宜的培養(yǎng)基原材料。用篩選出的原材料制備普通瓊脂和普通肉湯培養(yǎng)基，用翻口膠塞密封后置于2～8 ℃保存。1 mL、10 mL一次性吸管購買自costar，一次性平皿(直徑90 mm)，購買自青島金典生化器材公司。A、B、C三家單位所用的試驗耗材完全一致。

1.3 均一性試驗 隨機抽取10瓶參考疫苗候選物，由2名檢驗員對10瓶參考疫苗候選物同時進行活菌計數(shù)，計算每位檢驗員對10瓶參考疫苗計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)，比較2組數(shù)據(jù)的差異程度。

1.5 運輸穩(wěn)定性試驗 B單位和C單位分別從100瓶參考疫苗候選物中隨機抽取5 瓶用1.1項下的方式寄到A單位，A單位收到樣品后馬上進行活菌計數(shù)，運輸過程均需2 d，分析運輸過程對樣品穩(wěn)定性的影響。夏季(7月份)和冬季(12月份)分別試驗一次。

1.6 加速破壞試驗 隨機抽取參考疫苗候選物，分別置于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃、-20 ℃條件下，2～8 ℃、25 ℃、37 ℃條件下保存的樣品每隔若干天隨機抽取3瓶進行活菌計數(shù)、-20 ℃保存的樣品每隔6個月隨機抽取3瓶進行活菌計數(shù)，分析樣品在不同儲存條件下的穩(wěn)定性[7]。

1.7 保存期試驗 將置于-70 ℃以下保存的仔豬副傷寒參考疫苗候選物按1.4項下協(xié)作標定的方法每1～2個月取樣并計數(shù)，至保存期18個月，對計數(shù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析，每隔6個月對其性狀、真空度、剩余水分測定一次。

1.8 參考疫苗的應(yīng)用 2016-2018年沙門氏菌類活疫苗活菌計數(shù)的檢驗中，加入?yún)⒖家呙?，每次檢驗隨機抽取3瓶參考疫苗，其中至少2瓶參考疫苗計數(shù)結(jié)果在協(xié)作標定賦值范圍內(nèi)時對照成立，對待檢疫苗進行結(jié)果判定。

2 結(jié) 果

2.1 參考疫苗候選物的檢驗 參考疫苗候選物性狀為海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，隨機抽取5瓶疫苗進行純粹檢驗，結(jié)果5/5純粹生長，真空度測定結(jié)果顯示疫苗呈現(xiàn)白色或粉色或紫色輝光，隨機抽取4瓶疫苗測定剩余水分，結(jié)果為2.2%、2.3%、2.6%、2.1%，均小于3.0%，活菌計數(shù)結(jié)果為3.5×109CFU/頭份。

2.2 培養(yǎng)基的篩選 由2名檢驗員用編號A～F的 6批普通瓊脂培養(yǎng)基對相同的3瓶樣品進行活菌計數(shù)。結(jié)果顯示，6批普通瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果無差異，2名檢驗員計數(shù)結(jié)果基本一致(表1)。因此，隨機選1批培養(yǎng)基的原材料配制普通瓊脂培養(yǎng)基300瓶，100 mL/瓶，配制普通肉湯培養(yǎng)基400瓶，100 mL/瓶，均用翻口膠塞封口后置于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 參考疫苗用6批普通瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果Tab 1 Test result of the reference vaccines with 6 batches of normal agar mediums

表格中的2個數(shù)據(jù)分別為兩名檢驗員的檢測結(jié)果

2.3 均一性試驗 結(jié)果顯示，2名檢驗員對10瓶參考疫苗候選物計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)分別為8.4%和8.2%，均小于10%，說明均一性良好[8]，2名檢驗員對同一瓶疫苗計數(shù)結(jié)果的差異小于5.4%，說明檢驗員之間的計數(shù)結(jié)果差異不明顯(表2)。

2.5 運輸穩(wěn)定性試驗 第一次運輸穩(wěn)定性試驗(夏季，7月份)：B單位和C單位寄回的5瓶參考疫苗候選物計數(shù)結(jié)果的最小值均為3.7×109CFU/頭份，第二次運輸穩(wěn)定性試驗(冬季，12月份)：B單位和C單位寄回的5瓶參考疫苗候選物計數(shù)結(jié)果的最小值分別為3.6×109CFU/頭份，3.7×109CFU/頭份。本參考疫苗候選物保存期0個月時計數(shù)結(jié)果為3.5×109CFU/頭份，運輸后計數(shù)結(jié)果與其一致，說明該參考疫苗候選物在48 h內(nèi)的運輸穩(wěn)定性良好(表3)。

表2 均一性試驗結(jié)果Tab 2 The uniformity test result

表3 運輸穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 3 The transport stability test result

表中數(shù)據(jù)為測定的菌數(shù)，單位為109CFU/頭份

2.6 加速破壞試驗 加速破壞試驗結(jié)果(表4-表7)顯示：2～8 ℃保存10 d，結(jié)果穩(wěn)定，保存20 d菌數(shù)下降17%；25 ℃保存7 d，結(jié)果穩(wěn)定，保存20 d，菌數(shù)下降22%；37 ℃保存5 d，結(jié)果穩(wěn)定，保存7 d，菌數(shù)下降31%；-20 ℃保存的疫苗18個月內(nèi)菌數(shù)無下降，結(jié)果穩(wěn)定。

2.7 保存期試驗 按協(xié)作標定的方法對-70 ℃以下保存18 個月以內(nèi)的參考疫苗候選物逐月進行活菌計數(shù)，剔除結(jié)果不滿意的偏離數(shù)據(jù)，變異系數(shù)為6.7%～8.9%，均小于10%，平均數(shù)為3.4×109～3.7×109CFU/頭份，中位數(shù)為3.4×109～3.75×109CFU/頭份，均在活菌計數(shù)可接受的誤差范圍內(nèi)，且計數(shù)結(jié)果在18個月內(nèi)未隨保存時間的延長而降低，保存期為6個月、12個月、18個月時分別隨機抽取參考疫苗候選物檢查性狀、真空度，結(jié)果均符合《中國獸藥典》的規(guī)定[9]，剩余水分均小于3%。

表4 參考疫苗候選物加速破壞試驗(2～8℃)Tab 4 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(2～8℃)

表5 參考疫苗候選物加速穩(wěn)定性試驗(25℃)Tab 5 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(25℃)

2.8 參考疫苗的應(yīng)用 本參考疫苗在應(yīng)用過程中主要存在4種情況：(1)參考疫苗對照成立，待檢疫苗不符合規(guī)定，這種情況下更換培養(yǎng)基，由2名檢驗員同時對待檢疫苗進行重檢，檢測結(jié)果均與初次檢驗結(jié)果一致。(2)待檢疫苗和參考疫苗結(jié)果均不符合規(guī)定，更換培養(yǎng)基對待檢疫苗和參考疫苗重檢測，參考疫苗結(jié)果符合規(guī)定，對待檢疫苗進行判定。(3)參考疫苗符合規(guī)定，待檢疫苗不符合規(guī)定，但二者在37 ℃培養(yǎng)24 h菌落大小不一，繼續(xù)延長培養(yǎng)時間仍有新菌落長出，且菌落直徑總體小于本菌在37 ℃培養(yǎng)24 h的大小。(4)待檢疫苗和參考疫苗均符合各自質(zhì)量標準(表8)。

3 結(jié)論與討論

在生物制品的檢驗中增加參考品以更加客觀、科學的評價檢驗結(jié)果是未來的一種趨勢，國外以及國內(nèi)人用生物制品參考品的研究及應(yīng)用越來越廣泛[10-11]。活菌計數(shù)是細菌類活疫苗質(zhì)量控制最重要的參數(shù)之一，直接關(guān)系到疫苗的安全性和免疫效力，參考疫苗的研究對于客觀評價疫苗的菌數(shù)有極其重要的意義。目前我國尚無任何活菌計數(shù)的參考疫苗，也無控制培養(yǎng)基促生長能力的參考疫苗，對影響活菌計數(shù)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一培養(yǎng)基的質(zhì)量無法科學評價，外加其他因素的影響，更無法科學評價活菌計數(shù)結(jié)果的有效性?；罹嫈?shù)的參照物在美國細菌類疫苗如多殺性巴氏桿菌和豬丹毒桿菌活疫苗的檢驗中已應(yīng)用多年[12-13]，但其應(yīng)用和判定不適合中國國情。

表6 參考疫苗候選物加速穩(wěn)定性試驗(37℃)Tab 6 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(37℃)

表7 參考疫苗候選物加速穩(wěn)定性試驗(-20℃)Tab 7 The accelerated damage test of the candidate reference vaccines(-20℃)

通過對沙門氏菌類活菌計數(shù)參考疫苗的系統(tǒng)研究，制定出參考疫苗的質(zhì)量標準：性狀、純粹檢驗、真空度測定、剩余水分測定的標準參照《中國獸藥典》；活菌計數(shù)標準為隨機抽取3瓶參考疫苗，至少有2瓶計數(shù)結(jié)果在參考疫苗協(xié)作標定賦值范圍內(nèi)，且在37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落大小均勻一致； 均一性檢驗標準為隨機抽取10瓶參考疫苗進行活菌計數(shù)，10瓶參考疫苗計數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)小于10.0%；運輸穩(wěn)定性標準為將參考疫苗置于2～15 ℃運輸不超過48 h，活菌數(shù)下降應(yīng)小于10.0%。

表8 參考疫苗的應(yīng)用情況Tab 8 The preliminary application of the reference vaccine

參考疫苗換批時需對現(xiàn)有的在保存期內(nèi)的參考疫苗用普通瓊脂進行計數(shù)，如果計數(shù)結(jié)果符合參考疫苗的質(zhì)量標準，說明普通瓊脂培養(yǎng)基的靈敏度適宜，用該普通瓊脂培養(yǎng)基對新制備的參考疫苗進行檢驗和協(xié)作標定，以確保參考疫苗在換批時標準一致[14]。

參考疫苗的應(yīng)用結(jié)果顯示，本參考疫苗既可以應(yīng)用于控制沙門氏菌類活疫苗活菌計數(shù)的過程，又可以用于控制普通瓊脂培養(yǎng)基的質(zhì)量?？刂粕抽T氏菌類活疫苗活菌計數(shù)的過程時，每次檢驗均需使用參考疫苗對試驗結(jié)果的有效性進行判定。若一次檢驗中使用同一批普通瓊脂培養(yǎng)基對多批次檢品進行檢驗，則僅需要使用3瓶參考疫苗對試驗結(jié)果的有效性進行判定。若一次檢驗中使用了不同批次的普通瓊脂培養(yǎng)基，則每批次普通瓊脂培養(yǎng)基均需用3瓶參考疫苗對試驗結(jié)果進行有效性判定。當3瓶參考疫苗中至少2瓶計數(shù)結(jié)果在參考疫苗質(zhì)量標準規(guī)定的范圍內(nèi)，且(37±0.5) ℃培養(yǎng)18～24 h菌落大小均勻一致時，判定試驗結(jié)果有效。此時將每批待檢疫苗3瓶樣品中含有活菌數(shù)的最小值計為檢驗結(jié)果，根據(jù)制品質(zhì)量標準進行判定。用于普通瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量控制時，每批普通瓊脂培養(yǎng)基用3瓶參考疫苗進行檢驗，當不少于2瓶參考疫苗計數(shù)結(jié)果在參考疫苗協(xié)作標定范圍內(nèi)，且參考疫苗在(37±0.5)℃培養(yǎng)18～24 h，菌落大小均勻一致時，判定培養(yǎng)基促生長能力符合規(guī)定。若參考疫苗計數(shù)結(jié)果高于參考疫苗協(xié)作標定的賦值范圍，提示普通瓊脂培養(yǎng)基的促生長能力偏高，若低于參考疫苗協(xié)作標定的賦值范圍，提示普通瓊脂培養(yǎng)基的促生長能力偏高。因此應(yīng)在普通瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量標準的控制中添加促生長能力檢驗參數(shù)，符合規(guī)定的培養(yǎng)基用于檢驗，可以避免不必要的重復工作。若參考疫苗在普通瓊脂培養(yǎng)基的質(zhì)量控制中應(yīng)用后還可以降低普通瓊脂培養(yǎng)基促生長能力的批間差異，在效力檢驗(攻毒保護試驗)估算菌數(shù)時即使更換培養(yǎng)基，對結(jié)果影響不大，保證試驗的順利進行。