曹俊超，王小慶，馬保華，鄒永德，廖新俤，龐燕玲，吳銀寶，2*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；3.南海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東 佛山 528200）

近年來隨著規(guī)模化、集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，獸用抗生素用量顯著增長。2015年我國發(fā)布了首份抗生素使用量和排放量清單，清單顯示從2007年到2013年我國抗生素使用量也呈逐年增長的趨勢(shì)，在2013年使用量達(dá)16.2萬t，使用量是英國和美國的近160倍和9倍[1]。獸用抗生素進(jìn)入畜禽體后，除殘留在畜禽機(jī)體組織和產(chǎn)品中外，有40%～90%會(huì)以原形和體內(nèi)代謝產(chǎn)物形式隨畜禽糞尿排出體外[2-4]，經(jīng)不同途徑對(duì)土壤和水體造成污染。值得注意的是，獸用抗生素經(jīng)畜禽吸收后，隨排泄物進(jìn)入環(huán)境的除了獸用抗生素原形，還包括其活性代謝產(chǎn)物。Andrzej等[5]研究發(fā)現(xiàn)，金霉素在pH為2～6時(shí)可轉(zhuǎn)化為4-差向異構(gòu)金霉素（4-epi-CTC），并且在豬腎中檢測(cè)到金霉素及4-epi-CTC的殘留。王小慶等[6]的研究表明，在豬飼料中加入75 mg·kg-1的金霉素，7 d用藥期內(nèi)豬糞中金霉素及代謝產(chǎn)物4-epi-CTC平均濃度分別為239.92 μg·g-1和217.79 μg·g-1。由于獸用抗生素活性代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和功能上與其原形有一定的共性，因此不可忽視其進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

厭氧發(fā)酵是畜禽糞污處理與利用的重要技術(shù)之一，但獸用抗生素及其活性代謝產(chǎn)物會(huì)隨畜禽糞污進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵系統(tǒng)，對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)生影響。目前，已有一些學(xué)者關(guān)注并研究了四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類等獸用抗生素殘留對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響。如Huang等[7]研究表明，采用直接添加法在常溫厭氧消化系統(tǒng)中加入混有0.55 mg·g-1金霉素的豬糞時(shí)，與對(duì)照組相比，7 d的加藥期內(nèi)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量被顯著抑制了15%，但該研究并未檢測(cè)并確認(rèn)金霉素活性代謝產(chǎn)物4-epi-CTC對(duì)厭氧消化系統(tǒng)功能的影響，也未檢測(cè)系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌多樣性，不能很好地解釋所得結(jié)果。Wang等[8]研究表明，在厭氧消化系統(tǒng)中加入經(jīng)飼料添加并經(jīng)豬體代謝后含12 mg·g-1泰樂菌素A的豬糞時(shí)，與對(duì)照組相比對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的抑制率達(dá)35.52%，而且顯著高于直接添加法組對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的抑制率12.98%，其原因與經(jīng)豬體代謝后，豬糞中不僅含有泰樂菌素A，而且含有高濃度的體內(nèi)代謝產(chǎn)物泰樂菌素D相關(guān)。所以研究獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響時(shí)，不應(yīng)忽視其活性代謝產(chǎn)物的影響。

由此，本文選用目前在養(yǎng)豬業(yè)中普遍使用的金霉素（Chlortetracycline，CTC）為研究對(duì)象，通過測(cè)定金霉素原形及其主要活性代謝產(chǎn)物4-epi-CTC在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度、系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量、沼液pH值以及產(chǎn)甲烷菌多樣性等參數(shù)，研究采用直接添加法和經(jīng)體內(nèi)代謝法金霉素對(duì)豬場污水厭氧消化系統(tǒng)的影響，闡明兩種方法所得結(jié)果的差異性。本文可為獸用抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的合理使用、獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響及其生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金霉素：金霉素原料藥購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華天獸藥廠，金霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。

豬糞：隨機(jī)選取30頭33 kg左右的成年二元雜母豬，預(yù)飼2周，期間日糧中不添加任何獸藥，臨床無異常后開始豬糞收集試驗(yàn)。豬糞收集試驗(yàn)分空白組和試驗(yàn)組，空白組日糧中不添加任何獸藥，試驗(yàn)組日糧中CTC的添加量為75 g·t-1飼料，用藥期7 d。分別收集空白組和試驗(yàn)組的豬糞，檢測(cè)CTC和4-epi-CTC濃度后用于厭氧消化試驗(yàn)。

0.01 mol·L-1Na2EDTA的Mcl-Vaine液：準(zhǔn)確稱取28.4 g Na2HPO4，用超純水溶解定容于1000 mL容量瓶中，簡稱A液；準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.00 g，用超純水溶解定容于1000 mL容量瓶中，簡稱B液；取625 mL溶液A與1000 mL溶液B混勻，調(diào)節(jié)pH至4.0±0.5，簡稱C液；準(zhǔn)確稱取60.5 g Na2EDTA溶解于C液中，即成0.01 mol·L-1Na2EDTA的Mcl-Vaine液。

1.2 試驗(yàn)裝置及主要儀器

模型厭氧消化系統(tǒng)：如圖1所示，該系統(tǒng)為有效容積1300 mL的定做的三口玻璃燒瓶[9]，3個(gè)出口均采用橡膠塞封嚴(yán)，頂部橡膠塞鉆出輸氣孔與吸收瓶相連，側(cè)邊出口分別用于取發(fā)酵液樣和加入新鮮豬糞樣。吸收瓶和集液瓶采用500 mL廣口瓶，吸收瓶用橡膠塞封口。吸收瓶橡膠塞上鉆孔連接玻璃和橡膠管路，用于導(dǎo)出厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生的的氣體及吸收瓶中的液體。

圖1 厭氧發(fā)酵裝置Figure 1 Anaerobic digestion device

主要儀器：包括高效液相色譜儀（Waters 600 Controller，Waters 717 plus Autosampler，Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector），固相萃取儀，凝膠成像系統(tǒng)，PCR儀，基因突變檢測(cè)儀（DGGE）等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

厭氧消化試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組依據(jù)2種CTC加入方式和2種CTC加入濃度分為4種處理，2種加入方式分別為體內(nèi)代謝組（即在飼料中添加CTC后所獲含CTC和4-epi-CTC殘留的豬糞）和直接添加組（即在空白豬糞中加入相應(yīng)濃度的CTC），2種CTC加入濃度分別為310.54 mg·kg-1干豬糞（高濃度）和160.05 mg·kg-1干豬糞（低濃度）。試驗(yàn)分組如表1所示。厭氧消化溫度設(shè)定為30℃。

表1 厭氧消化試驗(yàn)分組Table 1 The design of anaerobic digition trial

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量及沼液pH

采用排水法計(jì)算系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量[10]；以pH計(jì)測(cè)定沼液pH。

1.4.2 金霉素及4-差向異構(gòu)金霉素濃度

取10 mL沼液沼渣混合物，加入10 mL 0.01 mol·L-1Na2EDTA的Mcl-Vaine液，漩渦混合30 s，超聲10 min，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，上清液倒入另一干凈離心管中，沉淀中加入5 mL提取液，重復(fù)上述步驟再次提取，混合兩次上清液，4 ℃、13 000 r·min-1離心5 min，取上清液過固相萃取小柱。固相萃取小柱先用1 mL甲醇激活，1 mL水平衡，然后將上清液過柱，使藥物吸附在萃取小柱上，加水3 mL清洗小柱，頂空1 min，然用0.5 mL甲醇和0.5 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫。洗脫液用0.22μm濾膜過濾后，用于高效液相色譜儀檢測(cè)。

CTC色譜條件：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長355 nm；色譜柱采用Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，100 ?）；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相，乙腈∶0.01 mol·L-1草酸=18∶82；流速 1.0 mL·min-1；檢測(cè)限 0.01μg·mL-1；CTC回收率62.25%。在上述檢測(cè)條件下，能將沼液沼渣中CTC與其他物質(zhì)分開，其保留時(shí)間為17.377 min。

4-epi-CTC色譜條件：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長365 nm；色譜柱采用Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm，100 ?）；柱溫40℃；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相，乙腈∶0.01 mol·L-1草酸=22∶78；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)限0.01μg·mL-1；4-差向異構(gòu)CTC回收率67%。在上述檢測(cè)條件下，能將沼液沼渣中4-差向異構(gòu)金霉素與其他物質(zhì)分開，其保留時(shí)間為15.230 min。

1.4.3 產(chǎn)甲烷菌多樣性

將20 mL沼液沼渣樣品5000 r·min-1室溫離心3 min，去上清液后取1 g沼渣，加入10 mL PBS（pH為7.2～7.4），漩渦，然后5000 r·min-1離心10 min，倒掉上清液；固體加1 mL TE buffer和5 mg·mL-1的溶解酶，漩渦，37 ℃水浴30 min，5000 r·min-1離心10 min，去掉上清液，固體采用OMEGA公司E.Z.N.A.TMSoil DNA Kit試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。

采用50μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系對(duì)產(chǎn)甲烷菌16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：1μL模板，1 μL dNTP，10×PCR buffer 1 μL，0.5 μL Ex?TagDNA聚合酶，1μL上游引物，1μL下游引物，加ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)上下游引物分別為：A934F 5 "-AGG AAT TGG CGG GGG AGC A-3 "和1390R 5 "-ACG GGC GGT GTG TCA A-3 "[8]，其中在引物1390R的5 "端加入33個(gè)GC夾（5 "-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGC GGG GGC ACG GGC GGT GTG TCA A-3 "），以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定和片段電泳分離度。梯度反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸45 s；38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）檢測(cè)樣品中產(chǎn)甲烷菌多樣性。首先配制變性劑范圍為35%～60%的變性梯度凝膠，并放入充滿預(yù)熱至60℃的1×TAE電泳液的電泳槽內(nèi)，然后將20μL PCR產(chǎn)物與4μL 6×loading buffer混合，用移液器加入點(diǎn)樣孔中，最后以80 V電壓，60℃電泳16 h。電泳完畢后，用去離子水漂洗凝膠2 min，加入350 mL固定液（10%乙醇，0.5%乙酸）中，靜置15 min；倒掉固定液，去離子水漂洗2 min。漂洗完成后加入350 mL銀染液（10%乙醇，0.5%乙酸，用之前加入0.2%AgNO3，0.1%甲醛），放置在搖床上避光搖動(dòng)染色10 min；倒掉銀染液，用去離子水漂洗兩次，每次5～10 s，加入350 mL顯色液（3%NaOH，0.1%甲醛）顯色，待條帶顯示清楚停止顯色；倒掉顯色液，加入350 mL終止液（10%乙醇，0.5%乙酸）。將銀染后的DGGE凝膠放置在白光投影儀上，用數(shù)碼相機(jī)拍照保存圖片。使用Phoretix 1D Pro（Totallb）軟件分析DGGE圖像，計(jì)算Shannon "s多樣性參數(shù)H′。H′的計(jì)算公式為：

式中：s為每個(gè)泳道條帶數(shù)；pi為每個(gè)條帶強(qiáng)度占總條帶強(qiáng)度的比例；H′值越大說明樣品的多樣性程度越高。

利用Phroetix-1D和Phroetix-1D pro軟件對(duì)DG?GE電泳圖譜進(jìn)行相似性分析，得出戴斯系數(shù)（Dice coefficient，Cs），根據(jù)Cs得到各個(gè)泳道相似性系數(shù)矩陣圖，用非加權(quán)組平均法（Unweighted pair group mean average，UPGMA）將相似性系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)化為聚類樹狀圖，然后對(duì)聚類樹狀圖進(jìn)行分析[8]。聚類樹狀圖中的Distance表示泳道間條帶差異性，當(dāng)Distance為0時(shí)表示差異性為0，泳道間的條帶完全相同，當(dāng)Distance為1時(shí)則相反，表示差異性為1，泳道間的條帶完全不同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SE）表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用鄧肯極差檢驗(yàn)法，顯著水平P值設(shè)為0.05，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素及4-差向異構(gòu)金霉素在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度變化

CTC在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度變化如圖2a所示。由圖可知，7 d的加藥期內(nèi)除空白組外，其他各試驗(yàn)組CTC濃度均逐步上升，表明每日加入到厭氧消化系統(tǒng)中的CTC不會(huì)被完全降解，而會(huì)逐漸累積。加藥期結(jié)束時(shí)（8 d），除空白組未檢出CTC外，第2～4試驗(yàn)組系統(tǒng)中CTC的濃度分別達(dá)到0.59±0.07、0.61±0.16、0.36±0.02、0.56±0.04 mg·kg-1。進(jìn)入停藥期后，各試驗(yàn)組CTC濃度逐漸降低，在試驗(yàn)第15 d時(shí)，各試驗(yàn)組CTC濃度降至0.1 mg·kg-1左右，直至試驗(yàn)第25 d時(shí)系統(tǒng)中才檢測(cè)不到CTC殘留。

方差分析表明，在厭氧消化系統(tǒng)中添加CTC濃度為310.54 mg·kg-1的豬糞時(shí)，第二組（高濃度體內(nèi)代謝組）在加藥期內(nèi)CTC平均濃度顯著低于第三組（高濃度直接添加組）（P＜0.05），但當(dāng)CTC添加濃度為160.05 mg·kg-1時(shí)，第四組（低濃度體內(nèi)代謝組）與第五組（低濃度直接添加組）在加藥期內(nèi)CTC平均濃度無顯著差異（P＞0.05）。由此表明，不同加入方式對(duì)厭氧消化系統(tǒng)中CTC濃度的影響與CTC的加入濃度有關(guān)，CTC加入濃度高時(shí)經(jīng)體內(nèi)代謝組CTC的消失速度快于直接添加組。

CTC在糞便中的主要代謝產(chǎn)物是4-差向異構(gòu)金霉素（4-epi-CTC）[9]，因此本文檢測(cè)了各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)中4-epi-CTC的濃度（圖2b）。由圖可知，除空白組外，隨著含CTC豬糞的加入，在加藥期各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)中4-epi-CTC逐步累積。由于直接添加組所加豬糞中不含4-epi-CTC，但在系統(tǒng)中也能檢測(cè)到4-epi-CTC，說明4-epi-CTC不但可以由畜禽體內(nèi)代謝產(chǎn)生，而且也可在厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)生。進(jìn)入停藥期后，各試驗(yàn)組4-epi-CTC濃度逐漸降低，直至試驗(yàn)第28 d系統(tǒng)中檢測(cè)不到4-epi-CTC殘留。

方差分析表明，在厭氧消化系統(tǒng)中添加CTC濃度為310.54 mg·kg-1的豬糞時(shí)，第二組（高濃度體內(nèi)代謝組）在加藥期內(nèi)4-epi-CTC平均濃度顯著高于第三組（高濃度直接添加組）（P＜0.05），但當(dāng)CTC添加濃度為160.05 mg·kg-1時(shí)，第四組（低濃度體內(nèi)代謝組）與第五組（低濃度直接添加組）在加藥期內(nèi)4-epi-CTC平均濃度無顯著差異（P＞0.05）。其原因可能為在豬糞中CTC濃度為310.54 mg·kg-1時(shí)，與直接添加組相比，經(jīng)體內(nèi)代謝組系統(tǒng)中CTC的降解速度更快，由此導(dǎo)致4-epi-CTC的累積量更多。

2.2 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

CTC對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響如圖3所示，對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期不同試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），表明28 d的試驗(yàn)期內(nèi)，豬糞中殘留的CTC未顯著影響厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量。

方差分析表明，在厭氧消化系統(tǒng)中添加CTC濃度為310.54 mg·kg-1和160.05 mg·kg-1的豬糞時(shí)，直接添加組與相同CTC濃度的經(jīng)體內(nèi)代謝組相比，加藥期內(nèi)產(chǎn)甲烷量分別顯著降低了4.40%、5.22%（P＜0.05），而經(jīng)體內(nèi)代謝組與空白組無顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于直接添加組厭氧消化系統(tǒng)中CTC濃度顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝組，因此其對(duì)系統(tǒng)中微生物的抑制作用更強(qiáng)，從而使厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量顯著降低。

2.3 金霉素對(duì)沼液pH的影響

由圖4可知，各試驗(yàn)組pH變化趨勢(shì)基本一致。在7 d的加藥期內(nèi)，各試驗(yàn)組沼液平均pH值分別為6.15±0.10、6.17±0.11、5.98±0.11、6.18±0.05、5.95±0.04。方差分析表明，采用直接添加組的沼液pH顯著低于經(jīng)體內(nèi)代謝組和空白組（P＜0.05），而經(jīng)體內(nèi)代謝組沼液pH變化與空白組相比無顯著差異（P＞0.05）；同時(shí)對(duì)于同種研究方法（經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接添加法），不同試驗(yàn)濃度間無顯著差異（P＞0.05）。由此說明，直接添加法會(huì)導(dǎo)致厭氧消化系統(tǒng)中pH顯著降低，進(jìn)而使系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量顯著低于其他試驗(yàn)組。

2.4 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

2.4.1 產(chǎn)甲烷菌16S rDNA可變區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)各試驗(yàn)組第0、4、8、28 d沼液沼渣混合樣品提取微生物總DNA，并用產(chǎn)甲烷菌的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖5所示。由圖可知，所得PCR產(chǎn)物的分子量約為500 bp，片段大小與引物所能擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致，且條帶單一，可進(jìn)行后續(xù)DGGE分析。

圖2 金霉素與4-差向異構(gòu)金霉素在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度變化Figure 2 The concentration of chlortetracycline and 4-epi-CTC in anaerobic digestion system

圖3 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響Figure 3 Effect of chlortetracycline on the methane volume of anaerobic digestion system

圖4 金霉素對(duì)沼液pH的影響Figure 4 The effect of chlortetracycline on the pH value of anaerobic digestion system

圖5 樣品產(chǎn)甲烷菌16S rDNA可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 5 Electrophoregram of PCR amplified products derived from methanogenic archaea 16S rDNA

2.4.2 產(chǎn)甲烷菌多樣性的DGGE分析

CTC對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′的影響如表2所示，方差分析表明，在各時(shí)間段，兩種研究方法未顯著影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′（P＞0.05），且均與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

對(duì)所獲的DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖6。在試驗(yàn)開始時(shí)，各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌相似性水平為0.86。加藥期第4 d，各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌相似性上升為0.90，但總條帶數(shù)減少，因此在試驗(yàn)第4 d時(shí)各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷量較試驗(yàn)開始時(shí)略低。試驗(yàn)第8 d加藥期結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌條帶數(shù)增多，此時(shí)各試驗(yàn)組的產(chǎn)甲烷量比試驗(yàn)開始時(shí)也有所增加，不同初始濃度的體內(nèi)代謝法組和直接添加組分別聚為一類，相似性為0.90和0.95，但所有試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌相似性水平為0.82，說明不同CTC加入方法會(huì)影響厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌群落多樣性，使其相似性降低，這也可能是直接添加組產(chǎn)甲烷量顯著低于其他試驗(yàn)組的原因之一。整個(gè)試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷細(xì)菌相似性水平為0.90。

表2 金霉素厭氧消化產(chǎn)甲烷菌H′的變化Table 2 Effect of chlortetracycline on methanogenic archaea diversity index H′

圖6 金霉素厭氧消化試驗(yàn)產(chǎn)甲烷菌相似性樹狀圖Figure 6 Dendrogram of the similarity of methanogenic archaea in anaerobic digestion

3 討論

3.1 金霉素在厭氧消化系統(tǒng)中的降解

環(huán)境中CTC的化學(xué)穩(wěn)定性主要取決于光照、溫度、基質(zhì)理化性質(zhì)和微生物學(xué)性質(zhì)等[11]。本研究各試驗(yàn)組溫度和基質(zhì)一致，并且試驗(yàn)均在避光厭氧條件下進(jìn)行，因此微生物降解可能是系統(tǒng)中CTC消失的主要途徑。

本研究表明，連續(xù)7 d在厭氧消化系統(tǒng)中加入CTC，系統(tǒng)中CTC和其代謝產(chǎn)物4-epi-CTC逐步累積，而且直接添加組也檢測(cè)到4-epi-CTC，說明在體外厭氧條件下，CTC也可降解為4-epi-CTC。停止加藥后，添加過CTC的試驗(yàn)組直至試驗(yàn)第25 d系統(tǒng)中才檢測(cè)不到CTC，而其主要代謝產(chǎn)物4-epi-CTC在試驗(yàn)第28 d才檢測(cè)不出，說明4-epi-CTC在厭氧消化系統(tǒng)中停留時(shí)間比CTC原形還要長，而且在試驗(yàn)后期系統(tǒng)中CTC濃度逐步降低時(shí)4-epi-CTC仍處于較高濃度。Arikan等[12]的研究也表明，33 d的試驗(yàn)中厭氧消化系統(tǒng)內(nèi)的CTC濃度從5.9 mg·L-1降低到1.4 mg·L-1，降低了76%；差向異構(gòu)CTC濃度從4.1 mg·L-1降到2.5 mg·L-1，降低了39%，說明4-epi-CTC在系統(tǒng)中停留時(shí)間比母體還要長，并且母體濃度降低時(shí)4-epi-CTC濃度仍較高。差向異構(gòu)化可使獸用抗生素的抗菌活性有所降低，如4-差向異構(gòu)土霉素大約為土霉素原形抗菌活性的30%，但其毒性增強(qiáng)了1.87倍[13]。因此，不能忽視4-epi-CTC進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

本研究還表明，在CTC添加濃度為310.54 mg·kg-1時(shí)，經(jīng)體內(nèi)代謝組厭氧消化系統(tǒng)中CTC的濃度顯著低于直接添加組，而且系統(tǒng)中4-epi-CTC的濃度也顯著高于直接添加組，其原因可能是采用經(jīng)體內(nèi)代謝法時(shí)，加入到厭氧系統(tǒng)中的豬糞微生物已經(jīng)對(duì)CTC有一定的適應(yīng)性，所以系統(tǒng)中CTC降解較快，其代謝產(chǎn)物4-epi-CTC的濃度也較高；而采用直接添加法時(shí)，空白豬糞和厭氧消化系統(tǒng)中微生物對(duì)CTC缺乏適應(yīng)性，所以CTC降解緩慢，4-epi-CTC的濃度也較低。本結(jié)果與Huang等[7]所得結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)在低溫厭氧消化系統(tǒng)中，CTC加入濃度為0.55 mg·g-1時(shí)，經(jīng)體內(nèi)代謝組CTC濃度顯著低于同濃度直接添加組。

值得注意的是，不同研究方法所得四環(huán)素類抗生素在厭氧消化系統(tǒng)中的降解速度不同。如本研究采用的是與生產(chǎn)實(shí)踐相近的動(dòng)態(tài)厭氧消化系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接添加法組直至試驗(yàn)第25 d厭氧消化系統(tǒng)中才檢測(cè)不到CTC。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，采用靜態(tài)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)時(shí)四環(huán)素初期降解很快，但低濃度時(shí)會(huì)在系統(tǒng)內(nèi)維持較長時(shí)間，直至第20 d檢測(cè)不到沼液中四環(huán)素殘留。童子林等[15]應(yīng)用間歇試驗(yàn)研究了外源添加含CTC的豬糞時(shí)，CTC在中溫（35℃）厭氧消化系統(tǒng)中的降解過程，結(jié)果表明，CTC的降解過程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，其半衰期為10 d，經(jīng)過45 d的厭氧消化處理后，CTC降解率為97.7%～98.2%。

3.2 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響與獸用抗生素種類、研究方法、厭氧消化系統(tǒng)類型及運(yùn)行條件等直接相關(guān)。

本文的研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和經(jīng)體內(nèi)代謝組相比，直接添加組在加藥期顯著降低了厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量。其原因與直接添加組厭氧消化系統(tǒng)中CTC降解慢，其殘留濃度高于經(jīng)體內(nèi)代謝組有關(guān)。CTC殘留濃度高會(huì)抑制系統(tǒng)中古細(xì)菌和嗜乙酸甲烷菌等的活性，使系統(tǒng)中VFA累積導(dǎo)致pH下降[16-17]，在本研究中也出現(xiàn)相同的結(jié)果。采用直接添加法（即第三組和第五組）加藥期厭氧發(fā)酵系統(tǒng)沼液pH降低；同時(shí)由于CTC具有廣譜抗菌性，其濃度越高，對(duì)產(chǎn)甲烷菌的影響也越大，因此共同導(dǎo)致第三組（高濃度直接添加組）加藥期厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量被顯著抑制。Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，采用直接添加法在常溫厭氧消化系統(tǒng)中加入混有0.55 mg·g-1金霉素的豬糞時(shí)，7 d的加藥期內(nèi)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量被顯著抑制了15%。Fernandez等[18]也發(fā)現(xiàn)，直接加入濃度為 100～1000 mg·L-1的四環(huán)素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)氣量產(chǎn)生了抑制作用。這些研究所得結(jié)果類似，均表明直接在厭氧消化系統(tǒng)中加入四環(huán)素類獸用抗生素時(shí)，會(huì)影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量，進(jìn)而影響系統(tǒng)功能。

在厭氧消化過程中，產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)、活性直接影響厭氧發(fā)酵效率。由于獸用抗生素具有廣譜抗菌性，因此進(jìn)入?yún)捬跸到y(tǒng)的獸用抗生素就有可能影響產(chǎn)甲烷菌等厭氧微生物，進(jìn)而影響厭氧消化系統(tǒng)的功能。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接添加法這兩種CTC加入方式未顯著影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′，但試驗(yàn)第8 d加藥期結(jié)束時(shí)，經(jīng)體內(nèi)代謝組和直接添加組厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌群落多樣性的相似性降低，結(jié)合直接添加組產(chǎn)甲烷量顯著減少的結(jié)果，說明直接添加法可能會(huì)通過影響產(chǎn)甲烷菌群落進(jìn)而影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量。Sanz等[16]發(fā)現(xiàn)，金霉素可以通過干擾蛋白質(zhì)合成抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，進(jìn)而對(duì)厭氧消化過程產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用。James等[17]發(fā)現(xiàn)，金霉素對(duì)甲烷產(chǎn)量的抑制率為27.8%，而且金霉素處理組中兩種產(chǎn)甲烷毛菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌的豐度比空白組少。Shimada等[19]研究表明，在泰樂菌素添加劑量為167 mg·L-1時(shí)，厭氧系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷古菌物種的相對(duì)豐度明顯減少，并認(rèn)為該結(jié)果與系統(tǒng)中丙酸不斷累積有關(guān)。由此可知，厭氧消化系統(tǒng)中存在獸用抗生素殘留時(shí)，可能會(huì)通過影響產(chǎn)甲烷菌進(jìn)而影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量。

值得注意的是，本研究中直接在厭氧消化系統(tǒng)中加入混有CTC的豬糞時(shí)會(huì)顯著降低系統(tǒng)6～15 d時(shí)的產(chǎn)甲烷量，但添加經(jīng)豬體代謝后含CTC的豬糞未對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量產(chǎn)生顯著影響。這也說明研究方法會(huì)影響獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的作用，應(yīng)采用更接近養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐的經(jīng)體內(nèi)代謝法研究獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

4 結(jié)論

在厭氧消化系統(tǒng)中加入含金霉素濃度為310.54 mg·kg-1和160.05 mg·kg-1的豬糞時(shí)，與同濃度經(jīng)體內(nèi)代謝組相比，采用直接添加法的試驗(yàn)組顯著抑制了系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量，顯著降低了沼液pH，產(chǎn)甲烷菌群落多樣性的相似性降低，而且高濃度組厭氧消化系統(tǒng)中CTC殘留濃度顯著高于同濃度的經(jīng)體內(nèi)代謝組。

由于采用經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接添加法研究金霉素對(duì)豬場污水厭氧消化系統(tǒng)影響的結(jié)果不同，而且經(jīng)體內(nèi)代謝法更接近養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐，因此應(yīng)采用經(jīng)體內(nèi)代謝法研究獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。