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不同加入方式下金霉素對(duì)豬場污水厭氧消化系統(tǒng)的影響

2019-04-08 07:46:36曹俊超王小慶馬保華鄒永德廖新俤龐燕玲吳銀寶
關(guān)鍵詞:產(chǎn)甲烷菌金霉素產(chǎn)甲烷

曹俊超,王小慶,馬保華,鄒永德,廖新俤,龐燕玲,吳銀寶,2*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642;3.南海出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣東 佛山 528200)

近年來隨著規(guī)模化、集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,獸用抗生素用量顯著增長。2015年我國發(fā)布了首份抗生素使用量和排放量清單,清單顯示從2007年到2013年我國抗生素使用量也呈逐年增長的趨勢(shì),在2013年使用量達(dá)16.2萬t,使用量是英國和美國的近160倍和9倍[1]。獸用抗生素進(jìn)入畜禽體后,除殘留在畜禽機(jī)體組織和產(chǎn)品中外,有40%~90%會(huì)以原形和體內(nèi)代謝產(chǎn)物形式隨畜禽糞尿排出體外[2-4],經(jīng)不同途徑對(duì)土壤和水體造成污染。值得注意的是,獸用抗生素經(jīng)畜禽吸收后,隨排泄物進(jìn)入環(huán)境的除了獸用抗生素原形,還包括其活性代謝產(chǎn)物。Andrzej等[5]研究發(fā)現(xiàn),金霉素在pH為2~6時(shí)可轉(zhuǎn)化為4-差向異構(gòu)金霉素(4-epi-CTC),并且在豬腎中檢測(cè)到金霉素及4-epi-CTC的殘留。王小慶等[6]的研究表明,在豬飼料中加入75 mg·kg-1的金霉素,7 d用藥期內(nèi)豬糞中金霉素及代謝產(chǎn)物4-epi-CTC平均濃度分別為239.92 μg·g-1和217.79 μg·g-1。由于獸用抗生素活性代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和功能上與其原形有一定的共性,因此不可忽視其進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

厭氧發(fā)酵是畜禽糞污處理與利用的重要技術(shù)之一,但獸用抗生素及其活性代謝產(chǎn)物會(huì)隨畜禽糞污進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵系統(tǒng),對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)生影響。目前,已有一些學(xué)者關(guān)注并研究了四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類等獸用抗生素殘留對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響。如Huang等[7]研究表明,采用直接添加法在常溫厭氧消化系統(tǒng)中加入混有0.55 mg·g-1金霉素的豬糞時(shí),與對(duì)照組相比,7 d的加藥期內(nèi)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量被顯著抑制了15%,但該研究并未檢測(cè)并確認(rèn)金霉素活性代謝產(chǎn)物4-epi-CTC對(duì)厭氧消化系統(tǒng)功能的影響,也未檢測(cè)系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌多樣性,不能很好地解釋所得結(jié)果。Wang等[8]研究表明,在厭氧消化系統(tǒng)中加入經(jīng)飼料添加并經(jīng)豬體代謝后含12 mg·g-1泰樂菌素A的豬糞時(shí),與對(duì)照組相比對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的抑制率達(dá)35.52%,而且顯著高于直接添加法組對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的抑制率12.98%,其原因與經(jīng)豬體代謝后,豬糞中不僅含有泰樂菌素A,而且含有高濃度的體內(nèi)代謝產(chǎn)物泰樂菌素D相關(guān)。所以研究獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響時(shí),不應(yīng)忽視其活性代謝產(chǎn)物的影響。

由此,本文選用目前在養(yǎng)豬業(yè)中普遍使用的金霉素(Chlortetracycline,CTC)為研究對(duì)象,通過測(cè)定金霉素原形及其主要活性代謝產(chǎn)物4-epi-CTC在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度、系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量、沼液pH值以及產(chǎn)甲烷菌多樣性等參數(shù),研究采用直接添加法和經(jīng)體內(nèi)代謝法金霉素對(duì)豬場污水厭氧消化系統(tǒng)的影響,闡明兩種方法所得結(jié)果的差異性。本文可為獸用抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的合理使用、獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的影響及其生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金霉素:金霉素原料藥購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華天獸藥廠,金霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。

豬糞:隨機(jī)選取30頭33 kg左右的成年二元雜母豬,預(yù)飼2周,期間日糧中不添加任何獸藥,臨床無異常后開始豬糞收集試驗(yàn)。豬糞收集試驗(yàn)分空白組和試驗(yàn)組,空白組日糧中不添加任何獸藥,試驗(yàn)組日糧中CTC的添加量為75 g·t-1飼料,用藥期7 d。分別收集空白組和試驗(yàn)組的豬糞,檢測(cè)CTC和4-epi-CTC濃度后用于厭氧消化試驗(yàn)。

0.01 mol·L-1Na2EDTA的Mcl-Vaine液:準(zhǔn)確稱取28.4 g Na2HPO4,用超純水溶解定容于1000 mL容量瓶中,簡稱A液;準(zhǔn)確稱取檸檬酸21.00 g,用超純水溶解定容于1000 mL容量瓶中,簡稱B液;取625 mL溶液A與1000 mL溶液B混勻,調(diào)節(jié)pH至4.0±0.5,簡稱C液;準(zhǔn)確稱取60.5 g Na2EDTA溶解于C液中,即成0.01 mol·L-1Na2EDTA的Mcl-Vaine液。

1.2 試驗(yàn)裝置及主要儀器

模型厭氧消化系統(tǒng):如圖1所示,該系統(tǒng)為有效容積1300 mL的定做的三口玻璃燒瓶[9],3個(gè)出口均采用橡膠塞封嚴(yán),頂部橡膠塞鉆出輸氣孔與吸收瓶相連,側(cè)邊出口分別用于取發(fā)酵液樣和加入新鮮豬糞樣。吸收瓶和集液瓶采用500 mL廣口瓶,吸收瓶用橡膠塞封口。吸收瓶橡膠塞上鉆孔連接玻璃和橡膠管路,用于導(dǎo)出厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生的的氣體及吸收瓶中的液體。

圖1 厭氧發(fā)酵裝置Figure 1 Anaerobic digestion device

主要儀器:包括高效液相色譜儀(Waters 600 Controller,Waters 717 plus Autosampler,Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector),固相萃取儀,凝膠成像系統(tǒng),PCR儀,基因突變檢測(cè)儀(DGGE)等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

厭氧消化試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組,每組3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組依據(jù)2種CTC加入方式和2種CTC加入濃度分為4種處理,2種加入方式分別為體內(nèi)代謝組(即在飼料中添加CTC后所獲含CTC和4-epi-CTC殘留的豬糞)和直接添加組(即在空白豬糞中加入相應(yīng)濃度的CTC),2種CTC加入濃度分別為310.54 mg·kg-1干豬糞(高濃度)和160.05 mg·kg-1干豬糞(低濃度)。試驗(yàn)分組如表1所示。厭氧消化溫度設(shè)定為30℃。

表1 厭氧消化試驗(yàn)分組Table 1 The design of anaerobic digition trial

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量及沼液pH

采用排水法計(jì)算系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量[10];以pH計(jì)測(cè)定沼液pH。

1.4.2 金霉素及4-差向異構(gòu)金霉素濃度

取10 mL沼液沼渣混合物,加入10 mL 0.01 mol·L-1Na2EDTA的Mcl-Vaine液,漩渦混合30 s,超聲10 min,4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min,上清液倒入另一干凈離心管中,沉淀中加入5 mL提取液,重復(fù)上述步驟再次提取,混合兩次上清液,4 ℃、13 000 r·min-1離心5 min,取上清液過固相萃取小柱。固相萃取小柱先用1 mL甲醇激活,1 mL水平衡,然后將上清液過柱,使藥物吸附在萃取小柱上,加水3 mL清洗小柱,頂空1 min,然用0.5 mL甲醇和0.5 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫。洗脫液用0.22μm濾膜過濾后,用于高效液相色譜儀檢測(cè)。

CTC色譜條件:紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長355 nm;色譜柱采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm,100 ?);柱溫40℃;進(jìn)樣量20μL;流動(dòng)相,乙腈∶0.01 mol·L-1草酸=18∶82;流速 1.0 mL·min-1;檢測(cè)限 0.01μg·mL-1;CTC回收率62.25%。在上述檢測(cè)條件下,能將沼液沼渣中CTC與其他物質(zhì)分開,其保留時(shí)間為17.377 min。

4-epi-CTC色譜條件:紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長365 nm;色譜柱采用Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm,100 ?);柱溫40℃;進(jìn)樣量20μL;流動(dòng)相,乙腈∶0.01 mol·L-1草酸=22∶78;流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)限0.01μg·mL-1;4-差向異構(gòu)CTC回收率67%。在上述檢測(cè)條件下,能將沼液沼渣中4-差向異構(gòu)金霉素與其他物質(zhì)分開,其保留時(shí)間為15.230 min。

1.4.3 產(chǎn)甲烷菌多樣性

將20 mL沼液沼渣樣品5000 r·min-1室溫離心3 min,去上清液后取1 g沼渣,加入10 mL PBS(pH為7.2~7.4),漩渦,然后5000 r·min-1離心10 min,倒掉上清液;固體加1 mL TE buffer和5 mg·mL-1的溶解酶,漩渦,37 ℃水浴30 min,5000 r·min-1離心10 min,去掉上清液,固體采用OMEGA公司E.Z.N.A.TMSoil DNA Kit試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。

采用50μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系對(duì)產(chǎn)甲烷菌16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為:1μL模板,1 μL dNTP,10×PCR buffer 1 μL,0.5 μL Ex?TagDNA聚合酶,1μL上游引物,1μL下游引物,加ddH2O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)上下游引物分別為:A934F 5 "-AGG AAT TGG CGG GGG AGC A-3 "和1390R 5 "-ACG GGC GGT GTG TCA A-3 "[8],其中在引物1390R的5 "端加入33個(gè)GC夾(5 "-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGC GGG GGC ACG GGC GGT GTG TCA A-3 "),以增加產(chǎn)物的穩(wěn)定和片段電泳分離度。梯度反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s;58℃退火30 s;72℃延伸45 s;38個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測(cè)樣品中產(chǎn)甲烷菌多樣性。首先配制變性劑范圍為35%~60%的變性梯度凝膠,并放入充滿預(yù)熱至60℃的1×TAE電泳液的電泳槽內(nèi),然后將20μL PCR產(chǎn)物與4μL 6×loading buffer混合,用移液器加入點(diǎn)樣孔中,最后以80 V電壓,60℃電泳16 h。電泳完畢后,用去離子水漂洗凝膠2 min,加入350 mL固定液(10%乙醇,0.5%乙酸)中,靜置15 min;倒掉固定液,去離子水漂洗2 min。漂洗完成后加入350 mL銀染液(10%乙醇,0.5%乙酸,用之前加入0.2%AgNO3,0.1%甲醛),放置在搖床上避光搖動(dòng)染色10 min;倒掉銀染液,用去離子水漂洗兩次,每次5~10 s,加入350 mL顯色液(3%NaOH,0.1%甲醛)顯色,待條帶顯示清楚停止顯色;倒掉顯色液,加入350 mL終止液(10%乙醇,0.5%乙酸)。將銀染后的DGGE凝膠放置在白光投影儀上,用數(shù)碼相機(jī)拍照保存圖片。使用Phoretix 1D Pro(Totallb)軟件分析DGGE圖像,計(jì)算Shannon "s多樣性參數(shù)H′。H′的計(jì)算公式為:

式中:s為每個(gè)泳道條帶數(shù);pi為每個(gè)條帶強(qiáng)度占總條帶強(qiáng)度的比例;H′值越大說明樣品的多樣性程度越高。

利用Phroetix-1D和Phroetix-1D pro軟件對(duì)DG?GE電泳圖譜進(jìn)行相似性分析,得出戴斯系數(shù)(Dice coefficient,Cs),根據(jù)Cs得到各個(gè)泳道相似性系數(shù)矩陣圖,用非加權(quán)組平均法(Unweighted pair group mean average,UPGMA)將相似性系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)化為聚類樹狀圖,然后對(duì)聚類樹狀圖進(jìn)行分析[8]。聚類樹狀圖中的Distance表示泳道間條帶差異性,當(dāng)Distance為0時(shí)表示差異性為0,泳道間的條帶完全相同,當(dāng)Distance為1時(shí)則相反,表示差異性為1,泳道間的條帶完全不同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多重比較采用鄧肯極差檢驗(yàn)法,顯著水平P值設(shè)為0.05,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素及4-差向異構(gòu)金霉素在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度變化

CTC在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度變化如圖2a所示。由圖可知,7 d的加藥期內(nèi)除空白組外,其他各試驗(yàn)組CTC濃度均逐步上升,表明每日加入到厭氧消化系統(tǒng)中的CTC不會(huì)被完全降解,而會(huì)逐漸累積。加藥期結(jié)束時(shí)(8 d),除空白組未檢出CTC外,第2~4試驗(yàn)組系統(tǒng)中CTC的濃度分別達(dá)到0.59±0.07、0.61±0.16、0.36±0.02、0.56±0.04 mg·kg-1。進(jìn)入停藥期后,各試驗(yàn)組CTC濃度逐漸降低,在試驗(yàn)第15 d時(shí),各試驗(yàn)組CTC濃度降至0.1 mg·kg-1左右,直至試驗(yàn)第25 d時(shí)系統(tǒng)中才檢測(cè)不到CTC殘留。

方差分析表明,在厭氧消化系統(tǒng)中添加CTC濃度為310.54 mg·kg-1的豬糞時(shí),第二組(高濃度體內(nèi)代謝組)在加藥期內(nèi)CTC平均濃度顯著低于第三組(高濃度直接添加組)(P<0.05),但當(dāng)CTC添加濃度為160.05 mg·kg-1時(shí),第四組(低濃度體內(nèi)代謝組)與第五組(低濃度直接添加組)在加藥期內(nèi)CTC平均濃度無顯著差異(P>0.05)。由此表明,不同加入方式對(duì)厭氧消化系統(tǒng)中CTC濃度的影響與CTC的加入濃度有關(guān),CTC加入濃度高時(shí)經(jīng)體內(nèi)代謝組CTC的消失速度快于直接添加組。

CTC在糞便中的主要代謝產(chǎn)物是4-差向異構(gòu)金霉素(4-epi-CTC)[9],因此本文檢測(cè)了各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)中4-epi-CTC的濃度(圖2b)。由圖可知,除空白組外,隨著含CTC豬糞的加入,在加藥期各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)中4-epi-CTC逐步累積。由于直接添加組所加豬糞中不含4-epi-CTC,但在系統(tǒng)中也能檢測(cè)到4-epi-CTC,說明4-epi-CTC不但可以由畜禽體內(nèi)代謝產(chǎn)生,而且也可在厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)生。進(jìn)入停藥期后,各試驗(yàn)組4-epi-CTC濃度逐漸降低,直至試驗(yàn)第28 d系統(tǒng)中檢測(cè)不到4-epi-CTC殘留。

方差分析表明,在厭氧消化系統(tǒng)中添加CTC濃度為310.54 mg·kg-1的豬糞時(shí),第二組(高濃度體內(nèi)代謝組)在加藥期內(nèi)4-epi-CTC平均濃度顯著高于第三組(高濃度直接添加組)(P<0.05),但當(dāng)CTC添加濃度為160.05 mg·kg-1時(shí),第四組(低濃度體內(nèi)代謝組)與第五組(低濃度直接添加組)在加藥期內(nèi)4-epi-CTC平均濃度無顯著差異(P>0.05)。其原因可能為在豬糞中CTC濃度為310.54 mg·kg-1時(shí),與直接添加組相比,經(jīng)體內(nèi)代謝組系統(tǒng)中CTC的降解速度更快,由此導(dǎo)致4-epi-CTC的累積量更多。

2.2 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

CTC對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響如圖3所示,對(duì)整個(gè)試驗(yàn)期不同試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量進(jìn)行方差分析,結(jié)果顯示各試驗(yàn)組厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量與空白組相比無顯著差異(P>0.05),表明28 d的試驗(yàn)期內(nèi),豬糞中殘留的CTC未顯著影響厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量。

方差分析表明,在厭氧消化系統(tǒng)中添加CTC濃度為310.54 mg·kg-1和160.05 mg·kg-1的豬糞時(shí),直接添加組與相同CTC濃度的經(jīng)體內(nèi)代謝組相比,加藥期內(nèi)產(chǎn)甲烷量分別顯著降低了4.40%、5.22%(P<0.05),而經(jīng)體內(nèi)代謝組與空白組無顯著差異(P>0.05)。這可能是由于直接添加組厭氧消化系統(tǒng)中CTC濃度顯著高于經(jīng)體內(nèi)代謝組,因此其對(duì)系統(tǒng)中微生物的抑制作用更強(qiáng),從而使厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量顯著降低。

2.3 金霉素對(duì)沼液pH的影響

由圖4可知,各試驗(yàn)組pH變化趨勢(shì)基本一致。在7 d的加藥期內(nèi),各試驗(yàn)組沼液平均pH值分別為6.15±0.10、6.17±0.11、5.98±0.11、6.18±0.05、5.95±0.04。方差分析表明,采用直接添加組的沼液pH顯著低于經(jīng)體內(nèi)代謝組和空白組(P<0.05),而經(jīng)體內(nèi)代謝組沼液pH變化與空白組相比無顯著差異(P>0.05);同時(shí)對(duì)于同種研究方法(經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接添加法),不同試驗(yàn)濃度間無顯著差異(P>0.05)。由此說明,直接添加法會(huì)導(dǎo)致厭氧消化系統(tǒng)中pH顯著降低,進(jìn)而使系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量顯著低于其他試驗(yàn)組。

2.4 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響

2.4.1 產(chǎn)甲烷菌16S rDNA可變區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)各試驗(yàn)組第0、4、8、28 d沼液沼渣混合樣品提取微生物總DNA,并用產(chǎn)甲烷菌的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖5所示。由圖可知,所得PCR產(chǎn)物的分子量約為500 bp,片段大小與引物所能擴(kuò)增的產(chǎn)物大小一致,且條帶單一,可進(jìn)行后續(xù)DGGE分析。

圖2 金霉素與4-差向異構(gòu)金霉素在厭氧消化系統(tǒng)中的濃度變化Figure 2 The concentration of chlortetracycline and 4-epi-CTC in anaerobic digestion system

圖3 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響Figure 3 Effect of chlortetracycline on the methane volume of anaerobic digestion system

圖4 金霉素對(duì)沼液pH的影響Figure 4 The effect of chlortetracycline on the pH value of anaerobic digestion system

圖5 樣品產(chǎn)甲烷菌16S rDNA可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 5 Electrophoregram of PCR amplified products derived from methanogenic archaea 16S rDNA

2.4.2 產(chǎn)甲烷菌多樣性的DGGE分析

CTC對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′的影響如表2所示,方差分析表明,在各時(shí)間段,兩種研究方法未顯著影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′(P>0.05),且均與空白組無顯著差異(P>0.05)。

對(duì)所獲的DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖6。在試驗(yàn)開始時(shí),各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌相似性水平為0.86。加藥期第4 d,各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌相似性上升為0.90,但總條帶數(shù)減少,因此在試驗(yàn)第4 d時(shí)各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷量較試驗(yàn)開始時(shí)略低。試驗(yàn)第8 d加藥期結(jié)束時(shí),各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌條帶數(shù)增多,此時(shí)各試驗(yàn)組的產(chǎn)甲烷量比試驗(yàn)開始時(shí)也有所增加,不同初始濃度的體內(nèi)代謝法組和直接添加組分別聚為一類,相似性為0.90和0.95,但所有試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷菌相似性水平為0.82,說明不同CTC加入方法會(huì)影響厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌群落多樣性,使其相似性降低,這也可能是直接添加組產(chǎn)甲烷量顯著低于其他試驗(yàn)組的原因之一。整個(gè)試驗(yàn)期結(jié)束時(shí),各試驗(yàn)組產(chǎn)甲烷細(xì)菌相似性水平為0.90。

表2 金霉素厭氧消化產(chǎn)甲烷菌H′的變化Table 2 Effect of chlortetracycline on methanogenic archaea diversity index H′

圖6 金霉素厭氧消化試驗(yàn)產(chǎn)甲烷菌相似性樹狀圖Figure 6 Dendrogram of the similarity of methanogenic archaea in anaerobic digestion

3 討論

3.1 金霉素在厭氧消化系統(tǒng)中的降解

環(huán)境中CTC的化學(xué)穩(wěn)定性主要取決于光照、溫度、基質(zhì)理化性質(zhì)和微生物學(xué)性質(zhì)等[11]。本研究各試驗(yàn)組溫度和基質(zhì)一致,并且試驗(yàn)均在避光厭氧條件下進(jìn)行,因此微生物降解可能是系統(tǒng)中CTC消失的主要途徑。

本研究表明,連續(xù)7 d在厭氧消化系統(tǒng)中加入CTC,系統(tǒng)中CTC和其代謝產(chǎn)物4-epi-CTC逐步累積,而且直接添加組也檢測(cè)到4-epi-CTC,說明在體外厭氧條件下,CTC也可降解為4-epi-CTC。停止加藥后,添加過CTC的試驗(yàn)組直至試驗(yàn)第25 d系統(tǒng)中才檢測(cè)不到CTC,而其主要代謝產(chǎn)物4-epi-CTC在試驗(yàn)第28 d才檢測(cè)不出,說明4-epi-CTC在厭氧消化系統(tǒng)中停留時(shí)間比CTC原形還要長,而且在試驗(yàn)后期系統(tǒng)中CTC濃度逐步降低時(shí)4-epi-CTC仍處于較高濃度。Arikan等[12]的研究也表明,33 d的試驗(yàn)中厭氧消化系統(tǒng)內(nèi)的CTC濃度從5.9 mg·L-1降低到1.4 mg·L-1,降低了76%;差向異構(gòu)CTC濃度從4.1 mg·L-1降到2.5 mg·L-1,降低了39%,說明4-epi-CTC在系統(tǒng)中停留時(shí)間比母體還要長,并且母體濃度降低時(shí)4-epi-CTC濃度仍較高。差向異構(gòu)化可使獸用抗生素的抗菌活性有所降低,如4-差向異構(gòu)土霉素大約為土霉素原形抗菌活性的30%,但其毒性增強(qiáng)了1.87倍[13]。因此,不能忽視4-epi-CTC進(jìn)入環(huán)境后的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

本研究還表明,在CTC添加濃度為310.54 mg·kg-1時(shí),經(jīng)體內(nèi)代謝組厭氧消化系統(tǒng)中CTC的濃度顯著低于直接添加組,而且系統(tǒng)中4-epi-CTC的濃度也顯著高于直接添加組,其原因可能是采用經(jīng)體內(nèi)代謝法時(shí),加入到厭氧系統(tǒng)中的豬糞微生物已經(jīng)對(duì)CTC有一定的適應(yīng)性,所以系統(tǒng)中CTC降解較快,其代謝產(chǎn)物4-epi-CTC的濃度也較高;而采用直接添加法時(shí),空白豬糞和厭氧消化系統(tǒng)中微生物對(duì)CTC缺乏適應(yīng)性,所以CTC降解緩慢,4-epi-CTC的濃度也較低。本結(jié)果與Huang等[7]所得結(jié)果相似,其研究發(fā)現(xiàn)在低溫厭氧消化系統(tǒng)中,CTC加入濃度為0.55 mg·g-1時(shí),經(jīng)體內(nèi)代謝組CTC濃度顯著低于同濃度直接添加組。

值得注意的是,不同研究方法所得四環(huán)素類抗生素在厭氧消化系統(tǒng)中的降解速度不同。如本研究采用的是與生產(chǎn)實(shí)踐相近的動(dòng)態(tài)厭氧消化系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接添加法組直至試驗(yàn)第25 d厭氧消化系統(tǒng)中才檢測(cè)不到CTC。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn),采用靜態(tài)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)時(shí)四環(huán)素初期降解很快,但低濃度時(shí)會(huì)在系統(tǒng)內(nèi)維持較長時(shí)間,直至第20 d檢測(cè)不到沼液中四環(huán)素殘留。童子林等[15]應(yīng)用間歇試驗(yàn)研究了外源添加含CTC的豬糞時(shí),CTC在中溫(35℃)厭氧消化系統(tǒng)中的降解過程,結(jié)果表明,CTC的降解過程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程,其半衰期為10 d,經(jīng)過45 d的厭氧消化處理后,CTC降解率為97.7%~98.2%。

3.2 金霉素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響

獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量的影響與獸用抗生素種類、研究方法、厭氧消化系統(tǒng)類型及運(yùn)行條件等直接相關(guān)。

本文的研究結(jié)果表明,與空白對(duì)照組和經(jīng)體內(nèi)代謝組相比,直接添加組在加藥期顯著降低了厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量。其原因與直接添加組厭氧消化系統(tǒng)中CTC降解慢,其殘留濃度高于經(jīng)體內(nèi)代謝組有關(guān)。CTC殘留濃度高會(huì)抑制系統(tǒng)中古細(xì)菌和嗜乙酸甲烷菌等的活性,使系統(tǒng)中VFA累積導(dǎo)致pH下降[16-17],在本研究中也出現(xiàn)相同的結(jié)果。采用直接添加法(即第三組和第五組)加藥期厭氧發(fā)酵系統(tǒng)沼液pH降低;同時(shí)由于CTC具有廣譜抗菌性,其濃度越高,對(duì)產(chǎn)甲烷菌的影響也越大,因此共同導(dǎo)致第三組(高濃度直接添加組)加藥期厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷量被顯著抑制。Huang等[7]研究發(fā)現(xiàn),采用直接添加法在常溫厭氧消化系統(tǒng)中加入混有0.55 mg·g-1金霉素的豬糞時(shí),7 d的加藥期內(nèi)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量被顯著抑制了15%。Fernandez等[18]也發(fā)現(xiàn),直接加入濃度為 100~1000 mg·L-1的四環(huán)素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)氣量產(chǎn)生了抑制作用。這些研究所得結(jié)果類似,均表明直接在厭氧消化系統(tǒng)中加入四環(huán)素類獸用抗生素時(shí),會(huì)影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量,進(jìn)而影響系統(tǒng)功能。

在厭氧消化過程中,產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)、活性直接影響厭氧發(fā)酵效率。由于獸用抗生素具有廣譜抗菌性,因此進(jìn)入?yún)捬跸到y(tǒng)的獸用抗生素就有可能影響產(chǎn)甲烷菌等厭氧微生物,進(jìn)而影響厭氧消化系統(tǒng)的功能。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接添加法這兩種CTC加入方式未顯著影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷菌多樣性指數(shù)H′,但試驗(yàn)第8 d加藥期結(jié)束時(shí),經(jīng)體內(nèi)代謝組和直接添加組厭氧消化系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌群落多樣性的相似性降低,結(jié)合直接添加組產(chǎn)甲烷量顯著減少的結(jié)果,說明直接添加法可能會(huì)通過影響產(chǎn)甲烷菌群落進(jìn)而影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量。Sanz等[16]發(fā)現(xiàn),金霉素可以通過干擾蛋白質(zhì)合成抑制產(chǎn)甲烷菌的活性,進(jìn)而對(duì)厭氧消化過程產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用。James等[17]發(fā)現(xiàn),金霉素對(duì)甲烷產(chǎn)量的抑制率為27.8%,而且金霉素處理組中兩種產(chǎn)甲烷毛菌和產(chǎn)甲烷八疊球菌的豐度比空白組少。Shimada等[19]研究表明,在泰樂菌素添加劑量為167 mg·L-1時(shí),厭氧系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷古菌物種的相對(duì)豐度明顯減少,并認(rèn)為該結(jié)果與系統(tǒng)中丙酸不斷累積有關(guān)。由此可知,厭氧消化系統(tǒng)中存在獸用抗生素殘留時(shí),可能會(huì)通過影響產(chǎn)甲烷菌進(jìn)而影響系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量。

值得注意的是,本研究中直接在厭氧消化系統(tǒng)中加入混有CTC的豬糞時(shí)會(huì)顯著降低系統(tǒng)6~15 d時(shí)的產(chǎn)甲烷量,但添加經(jīng)豬體代謝后含CTC的豬糞未對(duì)厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量產(chǎn)生顯著影響。這也說明研究方法會(huì)影響獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的作用,應(yīng)采用更接近養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐的經(jīng)體內(nèi)代謝法研究獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

4 結(jié)論

在厭氧消化系統(tǒng)中加入含金霉素濃度為310.54 mg·kg-1和160.05 mg·kg-1的豬糞時(shí),與同濃度經(jīng)體內(nèi)代謝組相比,采用直接添加法的試驗(yàn)組顯著抑制了系統(tǒng)產(chǎn)甲烷量,顯著降低了沼液pH,產(chǎn)甲烷菌群落多樣性的相似性降低,而且高濃度組厭氧消化系統(tǒng)中CTC殘留濃度顯著高于同濃度的經(jīng)體內(nèi)代謝組。

由于采用經(jīng)體內(nèi)代謝法和直接添加法研究金霉素對(duì)豬場污水厭氧消化系統(tǒng)影響的結(jié)果不同,而且經(jīng)體內(nèi)代謝法更接近養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐,因此應(yīng)采用經(jīng)體內(nèi)代謝法研究獸用抗生素對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。

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