孫紅英，辛全偉，馬志慧，蘭思仁b，

（福建農(nóng)林大學(xué) a.國家菌草工程技術(shù)研究中心；b.林學(xué)博士后科研流動(dòng)站；c.林學(xué)院，福建 福州 350002）

中紅楊（原名中華紅葉楊）Populus×euramericana‘zhonghong’是黑楊派楊樹2025的芽變品種，2006年獲得原國家林業(yè)局新品種保護(hù)權(quán)[1]。中紅楊是目前國內(nèi)唯一的楊樹紅葉品種,葉面色彩鮮亮明快，顏色三季四變，觀賞價(jià)值極高，是園林彩葉樹種中成景速度最快的良種，在通道綠化、城鄉(xiāng)美化 、城區(qū)綠化中都具有十分廣闊的應(yīng)用前景，市場潛力巨大[2-3]。中紅楊作為綠化樹種，以適種區(qū)域廣、見效快、效益大等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大生產(chǎn)者和經(jīng)營者的青睞[4-5]。然而，隨著城市、園林、道路綠化建設(shè)力度的加大，優(yōu)良紅葉速生楊苗木緊缺的問題日益突出[5]。通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可以快速繁殖出大量的無菌苗木[6-8]，滿足彩葉市場對苗木的需求。此外，通過建立穩(wěn)定的植物再生體系，為進(jìn)一步開展轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料的中紅楊采自河南商丘，取1年生莖尖作為實(shí)驗(yàn)材料，通過組織培養(yǎng)方式獲得無菌組培苗， 在培養(yǎng)基MS + 0.3 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1KT上繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)周期30 d，繼代8代后，作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基類型對不定芽誘導(dǎo)的影響

將培養(yǎng)30 d的中紅楊組培苗在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作。以健壯的組培苗為試驗(yàn)材料，將較大的葉片切成4 mm×4 mm的塊狀，接種到WPM+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；DKW+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA 和 MS+0.5 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1NAA 3 種培養(yǎng)基上。將葉片上表面放于培養(yǎng)基表面，觀察對比不同培養(yǎng)基類型對紅葉楊葉片不定芽誘導(dǎo)的影響，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基類型培養(yǎng)的中紅楊葉片不定芽誘導(dǎo)率。

1.2.2 不同處理對不定芽誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，細(xì)胞分裂素6-BA，生長素NAA，蔗糖。6-BA設(shè)計(jì)為3個(gè)濃度梯度：0.1、0.5、1.0 mg·L-1；NAA設(shè)計(jì)3個(gè)梯度濃度為：0.1、0.2、0.3 mg·L-1；蔗糖3個(gè)梯度為10、20、30 g·L-1。接種25 d后統(tǒng)計(jì)不定芽再生數(shù)，計(jì)算不定芽再生率（見表1）。

表1 不同處理對不定芽再生影響的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)Table1 Orthogonal design L9(34) of effects of different treatments on adventitious bud regeneration

1.2.3 光照時(shí)間對葉片不定芽誘導(dǎo)的影響

將上述操作好的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)在0、8、16和24 h·d-1的光照環(huán)境條件下，培養(yǎng)30 d，觀察統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)的情況。

1.2.4 不定芽的壯苗

將不定芽從誘導(dǎo)的葉片切下，因切下的不定芽比較細(xì)弱，通過壯苗途徑促使不定芽生長復(fù)壯，將不定芽接種于 MS + 0.2 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d左右。

1.2.5 中紅楊組培苗的生根

將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)后，健壯的組培苗在超凈工作臺(tái)上切成2～3 cm長度，接種于生根培養(yǎng)基1/2 MS + 0.2 mgL-1IBA + 20 g·L-1蔗糖 + 6.5 gL-1瓊脂，pH值5.8左右，誘導(dǎo)其生根。

1.2.6 煉苗與移栽

經(jīng)上述生根后的組培苗放于室外陰涼處3～5 d后開蓋噴水保濕，保證葉片舒展，開蓋放置3 d左右，將苗從組培瓶中取出，在清水中洗凈粘在根上培養(yǎng)基，在5‰的高錳酸鉀溶液中消毒30 ～60 s，用清水清洗干凈根部殘留的高錳酸鉀溶液，移栽到大棚或大田中。

1.3 數(shù)據(jù)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%；不定芽再生率=產(chǎn)生再生芽的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%；葉片平均不定芽數(shù)=再生芽總數(shù)/產(chǎn)生再生芽的葉片數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對不定芽的影響

MS培養(yǎng)基與WPM、DKW培養(yǎng)基對中紅楊愈傷組織誘導(dǎo)的差異顯著，而在愈傷組織誘導(dǎo)中，培養(yǎng)基WPM和DKW之間的差異不顯著（圖1 a，P＜0.01），說明在中紅楊愈傷組織誘導(dǎo)過程中基本培養(yǎng)基MS優(yōu)于WPM和DKW培養(yǎng)基。3種基本培養(yǎng)基對中紅楊不定芽形成率有較大影響，3種培養(yǎng)基間差異顯著，MS、WPM和DKW不定芽誘導(dǎo)率分別是77%、32.33%和13.67%（圖1 b，P＜0.001），說明在中紅楊不定芽形成過程中，基本培養(yǎng)基MS優(yōu)于WPM和DKW培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基MS的平均出芽數(shù)為3.6個(gè)，WPM培養(yǎng)基的平均出芽數(shù)是1.3個(gè)，DKW培養(yǎng)基的出芽數(shù)是0.5個(gè)（圖1 c,P＜0.001），說明在中紅楊平均出芽數(shù)方面，基本培養(yǎng)基MS優(yōu)于其它兩種基本培養(yǎng)基。

2.2 不同濃度6-BA、NAA和蔗糖對不定芽誘導(dǎo)的影響

從表2分析出，不同激素對中紅楊葉片不定芽誘導(dǎo)都有較大影響，通過極差分析，在中紅楊葉片不定芽誘導(dǎo)的過程中，6-BA、NAA和蔗糖對不定芽誘導(dǎo)的影響從大到小的順序是：6-BA ＞NAA ＞ 蔗糖。從所設(shè)6-BA 3個(gè)梯度濃度所得到K值38、59.7、42.3，中紅楊葉片誘導(dǎo)不定芽不是隨著6-BA的濃度增加而增加。從正交實(shí)驗(yàn)中得出，中紅楊不定芽誘導(dǎo)最優(yōu)的培養(yǎng)基為：MS + 0.5 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-11 NAA + 30 g·L-1蔗糖。

圖1 培養(yǎng)基對不定芽再生的影響Fig.1 Effect of medium types on adventitious bud regeneration

表2 不同濃度6-BA、NAA和蔗糖對不定芽誘導(dǎo)的影響Table2 Effects of 6-BA, NAA and sugar with different concentrations on adventitious bud regeneration

方差分析（表3）表明，在中紅楊葉片誘導(dǎo)不定芽的過程中，細(xì)胞分裂素6-BA對不定芽誘導(dǎo)影響最大，其F值為177.769，在0.01水平達(dá)到顯著。其次，對中紅楊誘導(dǎo)不定芽影響大的NAA，其F值21.308，在0.05水平達(dá)到顯著。蔗糖對中紅楊誘導(dǎo)不定芽的影響不顯著。

表3 不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA和蔗糖對不定芽誘導(dǎo)影響的方差分析Table3 Variance analysis on effects of 6-BA, NAA and sugar with different concentrations on adventitious bud regeneration

2.3 光照條件對不定芽再生的影響

在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，暗培養(yǎng)和光照8 h·d-1處理間無顯著差異（圖2 a,P＞ 0.05），有利于誘導(dǎo)愈傷組織，光照16 h·d-1和24 h·d-1處理間也無顯著差異（圖2 a,P＞ 0.05），但不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。在光照對中紅楊不定芽誘導(dǎo)有顯著差異，光照16 h·d-1不定芽誘導(dǎo)率最高75%，光照8 h·d-152%，而光照 0 h·d-1和 24 h·d-1不定芽誘導(dǎo)率分別是17%，31.7%（圖2 b,P＜0.001）。

2.4 中紅楊不定芽再生及壯苗生根

葉片接種10 d后，葉片卷曲，葉片邊緣有顆粒狀愈傷組織形成，接觸培養(yǎng)基的部分開始有綠色芽點(diǎn)長出，小部分已經(jīng)形成芽，并逐漸形成叢生芽（圖3 a）。接種20 d后，葉片形成較大的愈傷組織，形成芽點(diǎn)處為翠綠色，無芽點(diǎn)形成的地方褐色甚至微黑色，形成的芽約0.5 ～ 1.0 cm（圖3 b）。30 d后，將形成約0.5～1.0 cm的芽切下，接種到壯苗培養(yǎng)基中壯苗，培養(yǎng)30 d（圖3 c）。經(jīng)過壯苗，苗長至2 ～ 3 cm，切下接種到生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根（圖3 d）。

圖2 光照條件對不定芽再生的影響Fig.2 Effects of light conditions on regeneration of adventitious buds

圖3 中紅楊葉片直接誘導(dǎo)不定芽與植株再生Fig.3 Direct induct adventitious bud and regeneration of adventitious buds of Populus × euramericana ‘zhonghong’

3 結(jié)論與討論

中紅楊不定芽誘導(dǎo)過程中，MS培養(yǎng)基有利于中紅楊的不定芽誘導(dǎo)，MS基本培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率較高，不定芽形成個(gè)數(shù)較多。6-BA對不定芽誘導(dǎo)有較大影響，添加適量的6-BA有利于不定芽的形成。然而，低濃度6-BA不利于不定芽的形成，高濃度的6-BA雖然能形成較多的不定芽，但有效芽數(shù)較少，這是由于高濃度的6-BA導(dǎo)致不定芽玻璃化[9]，減少了有效芽數(shù)。生長素NAA有利于不定芽誘導(dǎo)，最佳誘導(dǎo)濃度并不是隨著NAA濃度的升高而升高，這與生長素的特性相關(guān)，低濃度促進(jìn)生長，高濃度抑制生長[9]。外源添加蔗糖對不定芽的誘導(dǎo)影響不大，與潘梅等[10]的研究結(jié)果一致。光照對不定芽的形成有一定影響，暗培養(yǎng)有利于形成愈傷組織，但不利于不定芽的形成，全光照培養(yǎng)不利于愈傷組織的形成，有利于不定芽的誘導(dǎo)[11]。中紅楊誘導(dǎo)不定芽最佳光照條件為每天16 h光照 + 8 h暗處理。在中紅楊不定芽誘導(dǎo)過程中，雖然不定芽數(shù)量較多，但高度較低，必須通過壯苗才可以達(dá)到生根要求，這與前人的研究結(jié)果相同[12]。綜上，本試驗(yàn)直接從中紅楊葉片直接再生不定芽，省掉了誘導(dǎo)愈傷組織階段，獲得了較高的不定芽誘導(dǎo)率，為工廠化育苗奠定了理論基礎(chǔ)。下一步，我們將在較高不定芽誘導(dǎo)率的前提下，改良培養(yǎng)基配方，促進(jìn)不定芽的伸長，提高生根有效苗數(shù)，減少生產(chǎn)中的壯苗階段，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本，為工廠化育苗提高良好的技術(shù)基礎(chǔ)。進(jìn)一步，結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將抗蟲基因轉(zhuǎn)入中紅楊，提高中紅楊的抗蟲性。