熊海容，汪斌，楊青，張莉

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

半纖維素酶(hemicellulase) 是分解半纖維素一類酶的總稱，主要包括β-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶.半纖維素酶可將木質(zhì)纖維性材料生物轉(zhuǎn)化為單細(xì)胞蛋白、乙醇或其他有用物質(zhì)，對(duì)其酶法水解還可得各種低聚糖，以低聚糖為功能性食品日益受到重視[1].因此，半纖維素酶已廣泛地應(yīng)用于食品、飼料、造紙等行業(yè)，但如何提高半纖維素酶的表達(dá)量使其更為高效的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中顯得尤為重要.

啟動(dòng)子通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用控制基因轉(zhuǎn)錄的起始和表達(dá)水平，是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控原件，啟動(dòng)子活性高低在較大程度上影響蛋白的表達(dá)水平[2].蔣慧慧等[3]以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因，比較PScgpd，PGAP和PAOX1啟動(dòng)子的調(diào)控效果，結(jié)果顯示PAOX1調(diào)控綠色熒光蛋白表達(dá)的效果最好，PScgpd效果最弱.因此，不同啟動(dòng)子調(diào)控同一外源蛋白能力相差較大，尋找活性較高的啟動(dòng)子對(duì)提高外源蛋白的表達(dá)量具有重要意義.

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前常用的真核表達(dá)系統(tǒng)，甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PAOX1在該表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用最為廣泛，已成功誘導(dǎo)多種外源蛋白在畢赤酵母中高效表達(dá)[4-6].但甲醇不適用于食品、醫(yī)藥等生產(chǎn)，且在大規(guī)模生產(chǎn)中存在火災(zāi)安全隱患[7].其他啟動(dòng)子如PFLD1,PGAP,PTEF1也在畢赤酵母中逐漸得到應(yīng)用.Resina等[8]利用PFLD1在畢赤酵母中成功表達(dá)了米根霉脂肪酶，Ahn等[9]利用PTEF1在畢赤酵母中成功表達(dá)了嗜熱芽孢桿菌脂肪酶，暴立娟等[10]更換pPIC9上的PAOX1為PGAP表達(dá)了木聚糖酶，最高酶活力達(dá)到98 U/mL.

本實(shí)驗(yàn)室前期獲得了2種耐熱半纖維素酶：甘露聚糖酶ManB和木聚糖酶DSB[11,12]，最適反應(yīng)溫度均在70 ℃以上，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景.為提高2種半纖維素酶在畢赤酵母中的胞外酶活，且避免以甲醇作為碳源，本研究選擇PFLD,PGAP,PTEF13個(gè)調(diào)控蛋白表達(dá)能力較強(qiáng)的啟動(dòng)子，分別表達(dá)了2種半纖維素酶，并與PAOX1比較，選擇了適合2種半纖維素酶高效表達(dá)的啟動(dòng)子.

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)Top 10菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏，含2種半纖維素酶基因的質(zhì)粒pPIC9K-DSB和pPIC9K-ManB由本室保藏，畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115和表達(dá)載體pPIC9K為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所惠贈(zèng).

1.2 工具酶及試劑

限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等工具酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)分子量 Marker(TaKaRa)；質(zhì)粒DNA小量試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒(上海AxyPrep)；底物角豆膠、燕麥木聚糖(Sigma);蛋白胨、酵母提取液(Oxoid);無氨基酵母氮源(YNB)、D-山梨醇、瓊脂、氨芐青霉素(Biosharp)；引物合成和重組質(zhì)粒測(cè)序(武漢擎科創(chuàng)新生物科技)；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純.

1.3 培養(yǎng)基

畢赤酵母組氨酸缺陷型選擇培養(yǎng)MD、畢赤酵母生長(zhǎng)/誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY/BMMY、大腸桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基LB、畢赤酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基YPD等培養(yǎng)基配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè).

1.4 不同啟動(dòng)子序列的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

利用重疊延伸PCR將pPIC9K中的PAOX1啟動(dòng)子分別替換成PFLD1,PTEF1和PGAP.擴(kuò)增啟動(dòng)子所需引物(見表1).膠回收PCR產(chǎn)物，PFLD1經(jīng)AatII和SnaB I雙酶切，PTEF1和PGAP經(jīng)AatII和EcoR I雙酶切后，連接到經(jīng)同樣雙酶切的載體pPIC9K上，獲得含不同啟動(dòng)子的表達(dá)載體.再將含2種半纖維素酶基因的質(zhì)粒pPIC9K-DSB和pPIC9K-ManB與上述構(gòu)建的含不同啟動(dòng)子的質(zhì)粒同時(shí)用EcoR I/NotI和SnaB I/NotI進(jìn)行雙酶切，分別連接獲得基于不同啟動(dòng)子的2種半纖維素酶的表達(dá)載體pFLD1-DSB,pTEF1-DSB,pGAP-DSB,pFLD1-ManB和pGAP-ManB.

1.5 重組畢赤酵母的構(gòu)建和篩選

以SalI線性化重組質(zhì)粒pFLD1-DSB,pTEF1-DSB,pGAP-DSB和pPIC9K-DSB；以BspE I線性化重組質(zhì)粒pFLD1-ManB,pGAP-ManB和pPIC9K-ManB.之后采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌P.pastorisGS115，于MD平板上涂板，于30 ℃倒置培養(yǎng)約48～72 h，菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子[13]，構(gòu)建得到基于不同啟動(dòng)子的DSB和ManB分泌表達(dá)的重組酵母GS115/pFLD1-DSB,GS115/pTEF1-DSB,GS115/pGAP-DSB,GS115/pPIC9K-DSB,GS115/pFLD1-ManB,GS115/pGAP-ManB和GS115/pPIC9K- ManB.

1.6 重組菌的搖瓶發(fā)酵及酶活力測(cè)定

為比較PFLD1,PTEF1,PGAP和PAOX1這4種啟動(dòng)子表達(dá)2種半纖維素酶的能力，將篩選得到重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵.其中PAOX1和PFLD1是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，PTEF1和PGAP是組成型啟動(dòng)子，將GS115/pFLD1-DSB,GS115/pFLD1-ManB,GS115/pPIC9K-DSB,GS115/pPIC9K-ManB接種至25 mL BMGY培養(yǎng)基的三角瓶中，將GS115/pTEF1-DSB,GS115/pGAP-DSB和GS115/pGAP-ManB接種至25 mLYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，于30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到2～6.測(cè)定各重組菌的OD600值監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)情況，取適量菌懸液離心收集菌體，誘導(dǎo)型重組菌細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至裝液量為25 mL BMMY培養(yǎng)基的三角瓶中，組成型重組菌細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至裝液量為25 mL YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，控制各重組菌起始OD600值為1，于30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至120 h，誘導(dǎo)型重組菌每隔24 h添加適量的甲醇至終濃度為1%.各重組菌在誘導(dǎo)表達(dá)的過程中每隔24 h取0.25 mL樣品測(cè)定OD600，監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)狀況，并使用DNS法分別測(cè)定上清液和胞內(nèi)的木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活力.所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，并以GS115為陰性對(duì)照.

表1 用于不同啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Sequence of PCR amplification primers for different promoters

注：表示酶切位點(diǎn)

1.7 SDS-PAGE電泳分析

參考文獻(xiàn)[14]，搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，取等體積各重組菌的上清液及胞內(nèi)溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同啟動(dòng)子基因片段的獲得

利用重疊延伸PCR獲得不同啟動(dòng)子基因片段的過程如圖1所示，第三步PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PFLD1,PTEF1和PGAP的大小分別約為1000,850,900 bp(見圖2)，與預(yù)期大小一致.

圖1 不同啟動(dòng)子基因片段獲得示意圖Fig.1 Schematic illustration of different promoter gene fragments

2.2 含不同啟動(dòng)子的DSB和ManB表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收后的各啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物連接到pPIC9K載體上，替換原載體上的PAOX1啟動(dòng)子獲得含不同啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒(見圖3).再將DSB和ManB基因片段(大小分別為585,906 bp，見圖4)插入到上述含不同啟動(dòng)子的表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處獲得基于不同啟動(dòng)子的DSB和ManB表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證以上5個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

M) DL2000 DNA Marker; 1) PFLD1; 2) PGAP; 3)PTEF1圖2 不同啟動(dòng)子基因片段PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis of different promoter gene fragments

圖3 含不同啟動(dòng)子的DSB和ManB表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖Fig.3 Schematic illustration of recombinant plasmids with DSB and ManB based on different promoter

M) DL15000 DNA Marker; 1) ManB; 2) DSB圖4 DSB和ManB基因片段的凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of DSB and ManB gene fragment

2.3 不同啟動(dòng)子對(duì)木聚糖酶DSB表達(dá)水平的影響

對(duì)GS115/pFLD1-DSB、GS115/pPIC9K-DSB、GS115/

pGAP-DSB和GS115/pTEF1-DSB進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶比較分析，各重組菌生長(zhǎng)曲線和DSB酶活力曲線見圖5. 由圖5可見：?jiǎn)?dòng)子為誘導(dǎo)型的PAOX1和PFLD1的重組菌在甲醇培養(yǎng)基中發(fā)酵到96 h后菌體濃度和酶活力增長(zhǎng)變慢，發(fā)酵到120 h時(shí)上清液酶活力分別為846,512 U/mL，此時(shí)的OD600分別為53和52. 而啟動(dòng)子為組成型的PGAP和PTEF1的重組菌前24 h生長(zhǎng)非常迅速，之后OD600在43附近波動(dòng)，且在整個(gè)發(fā)酵過程中上清液酶活力的變化幅度不大，最高酶活力分別為167,190 U/mL.

圖5 不同啟動(dòng)子調(diào)控的DSB重組酵母的生長(zhǎng)曲線(a)和發(fā)酵上清液的酶活曲線(b)Fig.5 Growth curve(a) and enzyme activity curve(b) of fermented supernatant of recombinants for expression of DSB with different promoter

當(dāng)各重組菌發(fā)酵至120 h時(shí)，取相同體積的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖6.

1) GS115/pPIC9K-ManB; 2) GS115/pFLD1-ManB; 3) GS115/pGAP-ManB;M) Premixed protein marker(broad); 4) GS115/pPIC9K -DSB; 5) GS115/pFLD1-DSB; 6) GS115/pGAP-DSB;7) GS115/pTEF1-DSB; 8) GS115 in BMMY; 9) GS115 in YPD圖6 各重組菌發(fā)酵上清液(a)和胞內(nèi)溶液(b)的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of supernatant (a) and intracellular sample(b) of the recombinant bacteria fermentation

如圖6所示：DSB大小為23 KDa，且各重組菌上清液中蛋白含量與酶活測(cè)定結(jié)果一致，說明含組成型啟動(dòng)子的重組酵母酶活達(dá)到最大值的時(shí)間比含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組酵母短很多，但對(duì)于木聚糖酶DSB來說，在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)時(shí)PAOX1的調(diào)控效果最好.

2.4 不同啟動(dòng)子對(duì)甘露聚糖酶ManB表達(dá)水平的影響

對(duì)GS115/pFLD1-ManB,GS115/pPIC9K-ManB和GS115/pGAP-ManB進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶比較分析，各重組菌生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)ManB酶活曲線如圖7所示. 由圖7可見：含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子重組菌GS115/pPIC9K-ManB和GS115/pFLD1-ManB的OD600值和發(fā)酵上清液ManB酶活均隨著時(shí)間的增加而增加，96 h之后增長(zhǎng)變緩，發(fā)酵至120 h時(shí)最高酶活分別達(dá)到222,188 U/mL. 而含有組成型啟動(dòng)子PGAP的重組菌GS115/pGAP-ManB在培養(yǎng)24 h后OD600達(dá)45，隨后維持穩(wěn)定，其上清液酶活力在整個(gè)發(fā)酵過程中變化幅度也不大，最大值為27.3 U/mL. 結(jié)合各重組菌的發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果ManB大小為34 KDa，且各重組菌上清液中蛋白含量與酶活測(cè)定結(jié)果一致.說明含組成型啟動(dòng)子的重組酵母酶活達(dá)到最大值的時(shí)間比含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組酵母短很多.而對(duì)于甘露聚糖酶ManB來說，在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)時(shí)，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PFLD1調(diào)控時(shí)酶活力最高.

圖7 不同啟動(dòng)子調(diào)控的ManB重組酵母的生長(zhǎng)曲線(a)和發(fā)酵上清液(b)的酶活曲線Fig.7 Growth curve(a) and enzyme activity curve(b) of fermented supernatant(b) of recombinants for expression of ManB with different promoter

2.5 各重組菌DSB或ManB胞內(nèi)滯留情況的分析

為分析不同啟動(dòng)子調(diào)控下DSB或ManB分泌表達(dá)時(shí)胞內(nèi)滯留情況，發(fā)酵結(jié)束后取等量細(xì)胞進(jìn)行破碎，對(duì)胞內(nèi)溶液的酶活測(cè)定結(jié)果見圖8. 結(jié)合SDS-PAGE電泳結(jié)果可知：無論使用何種啟動(dòng)子，DSB或ManB在重組菌胞內(nèi)均有一定的滯留，但誘導(dǎo)型啟動(dòng)子重組菌胞內(nèi)滯留量明顯高于組成型啟動(dòng)子，而含PAOX1的重組菌胞內(nèi)滯留量又明顯高于含PFLD1的重組菌.胞內(nèi)滯留酶活最高的是GS115/pPIC9K-ManB，達(dá)到52 U/mL.說明表達(dá)不同的外源蛋白時(shí)，應(yīng)選擇合適的啟動(dòng)子以減少外源蛋白在胞內(nèi)的滯留，在一定程度上提高外源蛋白的分泌量.

圖8 不同啟動(dòng)子調(diào)控的ManB和DSB胞內(nèi)酶活Fig.8 DSB and ManB intracellular enzyme activity of recombinants with different promoter

3 討論

使用高效的啟動(dòng)子是提高畢赤酵母外源蛋白表達(dá)和節(jié)約生產(chǎn)成本的有效途徑之一.半纖維素酶廣泛存在于自然界中，木聚糖酶和甘露聚糖酶作為其最主要的組成部分，在飼料、食品和造紙等工業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，提高半纖維素酶的表達(dá)量可有效地降低工業(yè)生產(chǎn)成本.本研究前期獲得了2個(gè)耐熱半纖維素酶，耐熱木聚糖酶DSB和耐熱甘露聚糖酶ManB(最適反應(yīng)溫度分別為75 ℃和70 ℃)，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景.

調(diào)控表達(dá)外源蛋白時(shí)，不同啟動(dòng)子的調(diào)控能力相差較大，目前很多學(xué)者致力于尋找不同的啟動(dòng)子來替換PAOX1，安全高效地提高外源蛋白表達(dá)量.張軒薇等[15]利用啟動(dòng)子PGCW14,PTEF,PGAP和PAOX1搖瓶發(fā)酵南極假絲酵母脂肪酶(CALB)的酶活力分別為649.8，499.2，266.7，684.3 U/g；對(duì)于CALB的表達(dá)，PAOX1與PGCW14的調(diào)控效果相當(dāng).戰(zhàn)榮榮等[16]利用PFLD，PGAP和PAOX1調(diào)控菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在畢赤酵母中的表達(dá)，最高酶活分別為6.5，5.3和11.9 U/mL，PAOX1的調(diào)控效果最好.本研究選擇PFLD,PGAP和PTEF13個(gè)調(diào)控蛋白表達(dá)能力較強(qiáng)的啟動(dòng)子，分別分泌表達(dá)DSB和ManB，并與PAOX1進(jìn)行比較.搖瓶發(fā)酵的結(jié)果顯示：對(duì)于DSB，使用PAOX1時(shí)酶活力明顯高于其他啟動(dòng)子，最高酶活達(dá)846 U/mL；對(duì)于ManB，使用PFLD1時(shí)酶活力略高于PAOX1，但明顯高于PGAP，最高酶活達(dá)222 U/mL.在外源蛋白表達(dá)時(shí)，尋找合適的啟動(dòng)子是提高外源蛋白表達(dá)量的重要手段之一，因此在畢赤酵母GS115中表達(dá)DSB時(shí)應(yīng)選用PAOX1，而表達(dá)ManB時(shí)應(yīng)選用PFLD1.

為了進(jìn)一步提高兩種半纖維素酶的分泌表達(dá)效率，后續(xù)研究可對(duì)PFLD1,PTEF和PGAP進(jìn)行改造，使其在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中更好地發(fā)揮功能，為高效而安全地表達(dá)半纖維素酶奠定基礎(chǔ)，使畢赤酵母表達(dá)出的半纖維素酶可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等更廣闊的領(lǐng)域中.