栗永華，車路平，仇旭升，譚磊，孫英杰，劉煒煒，宋翠萍，廖瑛，丁鏟，王金泉，孟春春

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

0 引言

【研究意義】新城疫（newcastle disease，ND）是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)嚴(yán)重疫病之一，研究表明新城疫病毒（NDV）可誘導(dǎo)受感染細(xì)胞中 caspase依賴的內(nèi)源性和外源性凋亡途徑[1]，從而產(chǎn)生病變效應(yīng)[2]。細(xì)胞凋亡的特征是細(xì)胞形態(tài)和生化變化，包括細(xì)胞膜泡、caspase活化和DNA斷裂[3]。P53抑癌蛋白在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和抑制惡性發(fā)展中起著重要作用，P53抑癌蛋白通過協(xié)調(diào) DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡、衰老和維持基因組穩(wěn)定性等多種機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲力[4]，防止腫瘤的形成[5-8]。【前人研究進(jìn)展】BENSAAD等提出p53在細(xì)胞代謝中起著直接作用，TP53誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR）是p53下游的靶基因，具有調(diào)節(jié)糖酵解和抗氧化作用的蛋白[9]。在細(xì)胞中 TIGAR表達(dá)降低了果糖-2,6-二磷酸的水平來抑制磷酸果糖激酶(PFK)，進(jìn)而有利于果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F(xiàn)-6-P）和葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphatase，G-6-P）的形成，從而抑制了糖酵解[5]。TIGAR可通過增加磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP）[10-12]，促進(jìn)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的產(chǎn)生，從而去除活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[13]，研究證實(shí) ROS 在 p53 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中有著重要調(diào)節(jié)作用，可以由多種途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡[14-15]、自噬[16-18]。YE等用RNA干擾沉默HepG 2細(xì)胞中的TIGAR mRNA后，主要通過細(xì)胞凋亡和自噬作用抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。細(xì)胞內(nèi)ROS水平的降低而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)p53以及其他與ROS相關(guān)凋亡信號(hào)的敏感性[11,20-21]。TIGAR可以在缺氧條件下與線粒體的己糖激酶2形成復(fù)合體，從而提高己糖激酶2的活性，降低線粒體膜電位，減少ROS產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損傷并保持線粒體的完整性[22-24]。KO等在研究中表明 TIGAR在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的代謝分化和線粒體的乳酸和谷氨酰胺分解代謝，是一種很有潛力的乳腺癌治療方法[25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人已擴(kuò)增出人、鼠、牛等動(dòng)物的TIGAR基因，并研究TIGAR的抗凋亡及在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用。本研究首次從SPF雞的脾臟中擴(kuò)增出雞的TIGAR基因，并研究了其抗凋亡的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】驗(yàn)證本研究擴(kuò)增出的TIGAR是否具有抗凋亡功能，過表達(dá) TIGAR基因后再感染病毒是否可以增加病毒滴度，并有利于病毒感染細(xì)胞的存活；為后續(xù)構(gòu)建過表達(dá)TIGAR的細(xì)胞系和篩選適合新城疫病毒繁殖的高產(chǎn)細(xì)胞株提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2018年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

限制性內(nèi)切酶（EcoR I、BamH I）、Trizol、Alexa FlourTM 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit為Thermo公司產(chǎn)品，Taq聚合酶、dNTP、T4DNA連接酶為諾唯贊公司產(chǎn)品，M-MLV、RNasin、FuGen為Promega公司產(chǎn)品，DH5α感受態(tài)細(xì)胞為天根公司產(chǎn)品，ECL發(fā)光液為圣爾公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR擴(kuò)增TIGAR全長(zhǎng) 取SPF雞的脾臟，加PBS反復(fù)研磨3次，7 000 r/min離心10 min，取上清。采用Trizol裂解細(xì)胞提取RNA，加入隨機(jī)引物 6nt和 Olig18t各 1 μL，70℃10 min，冰浴 5 min，按照 Promega公司試劑盒的操作方法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄的溫度為37℃ 2 h、42℃ 2 h，75℃ 5 min滅活。根據(jù) GenBank（GenBank登錄號(hào)：XM_417232.6）上預(yù)測(cè)的原雞 TIGAR序列設(shè)計(jì)并合成上游引物（5′-CCGGAATTCATGGTTCGCTTCGGG CTGACC-3′，限制性內(nèi)切酶為EcoR I）和下游引物（5′-CGCG GATCCGAACATTTTCGGAGCTACACA TTCAGCACC-3′，限制性內(nèi)切酶為BamH I），以 cDNA為模板利用PCR擴(kuò)增出雞TIGAR的CDS區(qū)（擴(kuò)增程序：95℃ 預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min）。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下觀察，用膠回收試劑盒收集PCR產(chǎn)物，并送至上海生物工程公司測(cè)序。

1.2.2 繪制哺乳動(dòng)物、水生動(dòng)物的TIGAR基因進(jìn)化樹TIGAR基因位于12號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶3亞帶，含6個(gè)可能編碼外顯子的區(qū)域和2個(gè)P53結(jié)合位點(diǎn)[9,26-27]，BENSAAD發(fā)現(xiàn)在脊椎動(dòng)物中（從魚到人）高度保守[9]。利用GenBank上找到脊椎動(dòng)物的TIGAR基因以及本研究擴(kuò)增的TIGAR基因構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞 在200 μL的Opti-MEM轉(zhuǎn)染試劑中加入6 μL FuGen，室溫靜置5 min，再加入Flag-TIGAR或Flag-CMV14 2 μg，輕輕混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板中，于37℃培養(yǎng)4—6 h，更換成10%DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 TIGAR蛋白表達(dá)檢測(cè)和PARP檢測(cè) 將細(xì)胞接種至6孔板（細(xì)胞密度為1×105），待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)轉(zhuǎn)染 2 μg重組質(zhì)粒（Flag-TIGAR）和空載體（Flag-CMV14），轉(zhuǎn)染24 h后感染Herts33（1MOI），在感染后18、24、30、36 h收集樣品，每孔加入200 μL 2×Loading Buffer裂解細(xì)胞，收集入離心管，100℃煮樣10 min，12 000 r/min離心3 min。取等量樣品上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入5%脫脂乳室溫封閉2 h；按照1:1 000稀釋一抗（Flag、NP、PARP）4℃封閉過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min；按照1:5 000稀釋二抗室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。用化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.2.5 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種至6孔板（細(xì)胞密度為1×105），待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒（Flag-TIGAR）和空載體（Flag-CMV14），轉(zhuǎn)染后24、48 h收集細(xì)胞，用PBS洗后，加500 μL不含EDTA的胰酶消化2 min，用PBS吹下細(xì)胞并收集入離心管中，4℃1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μL PI（用1×Binding Buffer做10倍稀釋）、25 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，用流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 TIGAR的擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

擴(kuò)增的全長(zhǎng)TIGAR基因經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小為 843 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

本研究擴(kuò)增的TIGAR基因全長(zhǎng)3 206 bp，CDS區(qū)843 bp編碼281個(gè)氨基酸，已上傳至GenBank并獲得登錄號(hào)（MH511993.1），將擴(kuò)增的雞TIGAR基因的序列與其他脊椎動(dòng)物的TIGAR基因的序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2），發(fā)現(xiàn)TIGAR基因在脊椎動(dòng)物中高度保守。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增雞TIGAR基因Fig. 1 Amplification chicken TIGAR gene with RT-PCR

2.2 Flag-TIGAR真核質(zhì)粒的鑒定

將Flag-TIGAR重組質(zhì)粒和空載轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染后24、36、48 h的樣品利用Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的樣品在30 kD的位置出現(xiàn)了條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致；轉(zhuǎn)染空載體（Flag-CMV14）和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的樣品未出現(xiàn)條帶，表明Flag-TIGAR重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖3）。

2.3 Western Blot檢測(cè)PARP

將Flag-TIGAR重組質(zhì)粒和空載轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染后 24 h 感染 Herts/33（1MOI），Western Blot檢測(cè)NP、FLAG、PARP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的樣品均表達(dá)TIGAR；感染組均表達(dá)NP；在30 h、36 h的樣品中PARP均有裂解條帶且轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒（Flag-TIGAR）的樣品裂解出PARP的表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（MOCK）組的樣品，且差異極顯著（P＜0.01）（圖4）。

圖2 哺乳動(dòng)物、水生動(dòng)物的TIGAR基因的進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of TIGAR gene in mammals and aquatic animals

2.4 FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染TIGAR對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

將Flag-TIGAR和Flag-CMV14轉(zhuǎn)染入DF1細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24、48 h收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（收集樣品前2 h用藥物Staurosporine誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，按照1：1 000的比例使用）。結(jié)果顯示，24 h轉(zhuǎn)染Flag-CMV14后細(xì)胞總凋亡率為11%（早期凋亡7.8%，晚期凋亡3.2%），而轉(zhuǎn)染Flag-TIGAR后細(xì)胞總凋亡率為4%（早期凋亡3.7%，晚期凋亡0.3%），轉(zhuǎn)染 Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于轉(zhuǎn)染 Flag-TIGAR組，且差異顯著（P＜0.05）；48 h轉(zhuǎn)染Flag-CMV14后細(xì)胞總凋亡率為20.3%（早期凋亡14.3%，晚期凋亡6.0%），而轉(zhuǎn)染Flag-TIGAR后細(xì)胞總凋亡率為6.4%（早期凋亡4.8%，晚期凋亡1.6%），轉(zhuǎn)染 Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于轉(zhuǎn)染Flag-TIGAR組，且差異極顯著（P＜0.01）（圖5）。

圖3 Flag-TIGAR真核質(zhì)粒表達(dá)(Flag抗體)Fig. 3 Expression of Flag-TIGAR with Western Blot（Flag antibody）

圖4 Western Blot檢測(cè)PARP表達(dá)Fig. 4 Detection PARP expression with Western Blot

3 討論

TIGAR是具有調(diào)節(jié)糖酵解和抗氧化作用的蛋白，是存在于機(jī)體內(nèi)的p53基因誘導(dǎo)的糖酵解和凋亡調(diào)節(jié)因子，通過抑制糖酵解途徑，增加磷酸戊糖途徑（PPP），可產(chǎn)生大量的5-磷酸核糖，是DNA修復(fù)和合成的重要原料[26]；還可以通過維持還原型谷胱甘肽所需的 NADPH水平來調(diào)節(jié) ROS水平，保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損傷并保持線粒體的完整性，細(xì)胞內(nèi)NADPH升高，活性氧（ROS）和自噬活性降低，因此 TIGAR既可以抑制細(xì)胞凋亡又抑制自噬[21, 28]。

本試驗(yàn)利用雞脾臟組織cDNA為模板擴(kuò)增出雞的TIGAR基因，經(jīng)測(cè)序分析后，并將TIGAR基因序列上傳至GenBank。本研究通過檢測(cè)凋亡蛋白（PARP）以及流式檢測(cè)，結(jié)果表明擴(kuò)增的雞 TIGAR基因具有抗凋亡的功能。

圖5 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Fig. 5 Detection the rate of apoptosis with FCM

研究表明TIGAR在抗細(xì)胞凋亡及在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用。周駿浩通過試驗(yàn)預(yù)測(cè) TIGAR在腦預(yù)適應(yīng)中的作用可能是中風(fēng)預(yù)防和治療[29]。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)維持細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)的正常的分解代謝活動(dòng)， 通過溶酶體將長(zhǎng)壽蛋白、損傷的細(xì)胞器以及外源病原微生物吞噬、降解的過程,是機(jī)體內(nèi)一種重要的保護(hù)和防御機(jī)制。馮婧等干擾TIGAR蛋白后，細(xì)胞色素c在胞質(zhì)內(nèi)含量明顯增加而在線粒體內(nèi)含量減少，且干擾組細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明細(xì)胞凋亡增加；并檢測(cè)細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1表達(dá)顯著上升，同時(shí)P62表達(dá)下降，表明細(xì)胞自噬增強(qiáng)[30]。細(xì)胞發(fā)生凋亡后不利于病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[31-33]，所以本研究為建立一株抑制病毒凋亡和自噬，利于病毒復(fù)制的細(xì)胞系奠定了前期基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

首次擴(kuò)增出雞的 TIGAR基因，并對(duì)其功能進(jìn)行研究，確認(rèn)其具有抗凋亡的作用。為進(jìn)一步研究雞TIGAR基因在減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖能力方面的研究提供了借鑒。

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