李穎秀 潘教文 李臻 王慶國 劉煒

摘要：類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinases， RLKs）作為重要的信號分子受體，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。RLKs主要通過胞內(nèi)的激酶區(qū)磷酸化其底物蛋白來發(fā)揮作用，因此鑒定RLKs的底物蛋白對于其功能的研究至關(guān)重要。本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)對FTPK1的互作蛋白進(jìn)行篩選，初步確定了兩個候選蛋白，為進(jìn)一步研究該激酶的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻;類受體蛋白激酶;FTPK1;酵母雙雜交系統(tǒng);互作蛋白

中圖分類號：S511.03??文獻(xiàn)標(biāo)識號：A??文章編號：1001-4942（2019）01-0001-07

Screening of Interacting Proteins of Rice

Receptor-Like Kinase FTPK1 by Yeast Two-Hybrid System

Li Yingxiu?Pan Jiaowen?Li Zhen?Wang Qingguo?Liu Wei

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial

Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China;

2.College of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014，China）

Abstract?Plant receptor-like kinases （RLKs） acting as signal receptors play key roles in plant growth and development. As RLKs execute functions by phosphorylation of downstream targets， identification of targets for RLKs is critical for kinase function identification and analysis. In this study， the yeast two-hybrid system was used to screen interacting proteins of FTPK1， and two candidate interacting proteins were preliminarily identified. This research would lay the foundation for further study of the FTPK1 function.

Keywords?Rice; Receptor-like kinase （RLKs）; FTPK1; Yeast two-hybrid system; Interacting protein

類受體蛋白激酶（receptor-like kinases， RLKs）是一類普遍存在于高等植物中的蛋白激酶，作為信號分子的受體參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。近年來該領(lǐng)域的研究受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。典型的RLK包括胞外能夠識別并結(jié)合配體的受體區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)保守的激酶區(qū)，當(dāng)配基結(jié)合到胞外受體區(qū)后激活胞內(nèi)的激酶區(qū)，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控植物的生長發(fā)育和抗性反應(yīng)[1，2]。

1990年在玉米中首次克隆到RLK，至今已在20多種植物中鑒定到類受體蛋白激酶，它是目前鑒定到的最大蛋白激酶家族之一。在水稻中鑒定到其1 131個成員，在擬南芥中鑒定到610個成員。根據(jù)胞外受體區(qū)的結(jié)構(gòu)特點至少可將RLK分為21個亞家族，包括富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeats， LRRs）LRR-RLKs 亞型、與細(xì)胞壁相聯(lián)的蛋白激酶（wall-associated receptor kinases， WAKs）WAK-RLKs 亞型、S-結(jié)構(gòu)域（S-domain， S）受體蛋白激酶S-RLKs和富含半胱氨酸（cysteine-rich repeat， CRR）的CRR-RLKs亞型等[3]。

雖然RLK廣泛參與植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但只有少部分RLK的功能被報道。在擬南芥中有35%的LRR-RLKs有功能報道[3]，水稻中有功能報道的不到10%。近幾年在其它作物（如大豆、小麥、谷子等）以及楊樹不同亞家族的RLKs也被鑒定出來[4-8]。RLKs主要通過胞內(nèi)的激酶區(qū)磷酸化其底物蛋白來發(fā)揮作用，如GUDK（GROWTH UNDER DROUGHT KINASE）磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子OsAP37介導(dǎo)干旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活后的OsAP37轉(zhuǎn)錄激活脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來增強(qiáng)抗旱性和水稻產(chǎn)量[9]。對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)LRR-RLK SIRK1能夠磷酸化并激活水孔蛋白PIP2F，從而參與調(diào)控蔗糖特異的滲透響應(yīng)[10]。冷脅迫激活類受體胞質(zhì)蛋白激酶CRPK1 （cold-responsive protein kinase 1），能夠磷酸化14-3-3蛋白，磷酸化的14-3-3蛋白由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，與CBF1和CBF3蛋白互作促進(jìn)其降解，從而精細(xì)地調(diào)控冷脅迫響應(yīng)[11]。Lectin RLKs、SIT1（salt intolerance 1）介導(dǎo)鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，SIT1通過激活MPK3/MPK6促進(jìn)乙烯和ROS的積累，最終導(dǎo)致氧化脅迫和生長抑制。因此篩選并鑒定RLKs底物互作蛋白，對于研究其功能至關(guān)重要[12]。

前期研究發(fā)現(xiàn)水稻S-型RLK FTPK1 可能參與水稻穗發(fā)育。為進(jìn)一步解析該蛋白的功能，本研究利用膜系統(tǒng)酵母雙雜交（DUAL membrane starter kits）對FTPK1進(jìn)行互作蛋白的篩選鑒定，以期為下一步激酶功能的研究提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

供試植物材料為水稻品種中花11，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉農(nóng)場。

酵母（?Saccharomyces cerevisiae?）NMY51菌株、pPR3-N Prey Vector、pBT3-SUC Bait Vector、pBT3-N Bait Vector、pBT3-STE Bait Vector、pTSU2-APP Positive Control Bait Vector、pNubG-Fe65 Control Prey Vector、pOst1-NubI Control Prey Vector質(zhì)粒均購自上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。

Yeastmaker Yeast Transformation System 2、YPDA Broth、Minimal SD Base、Bacto Agar、OD Supplement-leu、OD Supplement -leu/-trp、OD Supplement-leu/-trp/-his 、OD Supplement-leu/-trp/-his/-ade均購自Clotech公司（美國）;TransStart Fast-Pfu DNA Polymerase試劑盒、pEASY-Blunt3 Cloning Kit試劑盒、2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans2K Plus DNA Marker均購于Transgen 公司（濟(jì)南雨同生物科技有限公司）;內(nèi)切酶?Sfi?Ⅰ購自BioLabs;T4 DNA Ligase購自?Thermo。

1.2?cDNA文庫的構(gòu)建及其保存

選取水稻中花11幼苗期的根、莖、葉;抽穗前、中、后期的幼穗及灌漿前、后期的穗作為材料，委托青島歐易公司提取RNA并構(gòu)建cDNA文庫。將構(gòu)建好的cDNA文庫，保存于-80℃冰箱備用。

1.3?誘餌載體的構(gòu)建

使用Primer Premier 5設(shè)計引物（表1）。擴(kuò)增FTPK1，經(jīng)測序正確后，利用?Sfi?Ⅰ酶切與不同的誘餌載體連接，構(gòu)建FTPK1誘餌載體pBT3-?N-?FTPK1、pBT3-STE-FTPK1、pBT3-SMC-FTPK1。

1.4?自激活檢測及功能驗證

以質(zhì)粒pTSU2-APP Positive Control Bait Vector和pPR3-N Prey Vector為陰性對照，質(zhì)粒pTSU2-APP Positive Control Bait Vector和pNubG-Fe65 Control Prey Vector為陽性對照。

將NMY51酵母菌種在YPDA平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)3天，直到克隆大小為2～3 mm;挑取幾個酵母克隆于50 mL的YPDA培養(yǎng)基中;在30℃搖床230～250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;測定培養(yǎng)菌液OD?546?值達(dá)到0.6～0.8時2 500×g離心5 min，收集菌體;倒去上清并用2.5 mL無菌水重懸菌體。

將3個FTPK1誘耳載體分別按照表2構(gòu)建反應(yīng)體系，每個反應(yīng)管加 300 μL PEG/LiOAc-Ⅰ（表3），輕輕斡旋混勻;每個反應(yīng)管加100 μL重懸細(xì)胞，斡旋1 min至各組分充分混勻;42℃ 水浴孵育45 min;700×g離心5 min;棄掉上清，用?0.9%??NaCl溶液150 μL重懸菌體。

1.5?篩選條件的選擇

誘餌如果存在自激活現(xiàn)象，則需要進(jìn)行篩選條件選擇，將FTPK1誘餌載體和空質(zhì)粒?pPR3-N??Prey Vector通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到表達(dá)誘餌質(zhì)粒的酵母菌中，分別涂布于含不同濃度?3-AT?（1、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的SD-leu/-trp/-his（三缺）、SD-leu/-trp/-his/-ade（四缺）培養(yǎng)基中，觀察酵母菌的生長情況。

1.6?膜體系酵母雙雜交文庫篩選

將經(jīng)過功能驗證符合要求的表達(dá)誘餌蛋白的NMY51酵母菌轉(zhuǎn)化后（轉(zhuǎn)化方法見1.4）涂布在SD-leu平板上，30℃倒置培養(yǎng)3天左右，直到克隆大小為2～3 mm;挑取新鮮的表達(dá)誘餌蛋白的酵母菌置于10 mL SD-leu培養(yǎng)液中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)8 h;將搖好的菌液接入100 mL的SD-leu液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min過夜;取3 mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，2 500× g離心5 min，將沉淀重懸于3 mL水中;室溫?700×?g離心5 min 以收集菌體;以水為空白對照，測量樣品的OD?546?值。以30 個OD?546?單位計算菌液的數(shù)量，將這種數(shù)量級的過夜菌液置于50 mL離心管中;700× g 離心5 min;用10 mL 30℃預(yù)熱的2×YPDA培養(yǎng)基重懸沉淀，然后轉(zhuǎn)移到1 L錐形搖瓶中;用40 mL 30℃預(yù)熱的2×YPDA培養(yǎng)基沖洗離心管后轉(zhuǎn)移到1 L錐形瓶中;再加150 mL 30℃預(yù)熱的2×YPDA培養(yǎng)基到錐形搖瓶中，確保最終菌液OD?546?值為?0.15;?30℃，220 r/min培養(yǎng)至OD?546?值達(dá)到0.6～0.7，可能需要3～5 h，此時細(xì)胞經(jīng)歷兩次分裂，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最優(yōu)。

準(zhǔn)備single-strand carrier DNA，99℃變性5 min，冰上2 min，重復(fù)一次。

將200 mL菌液分裝到4個離心管中，每管50 mL，700×g離心5 min;倒去上清，每管用30 mL無菌水重懸，700×g離心5 min;倒去上清，每管用1 mL LiOAc/TE溶液（表5）重懸，并轉(zhuǎn)到?1.5??mL離心管中，700×g離心5 min;每管加入600 μL LiOAc/TE溶液（表5）吹打均勻，備用。

準(zhǔn)備4個15 mL離心管，按照表6構(gòu)建反應(yīng)體系。斡旋1 min，至所有組分充分混勻;30℃水浴45 min，每15 min搖菌一次;加入160 μL DMSO，輕輕搖勻;42℃水浴熱激20 min，每10 min上下顛倒混勻一次;700×g離心5 min;加入3 mL ?2×?YPDA，30℃、150 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)90 min;?700×?g離心5 min，收集菌體;每管加入0.9% NaCl懸浮菌體，終體積4.8 mL左右。

其余菌液涂布于含有20 mg/L X-gal的篩選平板上，每個平板300 μL，每管涂16塊;30℃，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5天，至有克隆生長。

1.7?LacZ基因表達(dá)檢測

將陽性克隆菌落影印于濾紙上。將濾紙完全浸于液氮中，時間長于30 s，取出后晾干。培養(yǎng)皿加入適量顯色液（Z buffer/X-gal solution新鮮配制），墊一層濾紙，讓其完全浸潤，將凍溶后的濾紙鋪在上面，使顯色液滲透到表層。9 cm培養(yǎng)皿加2 mL顯色液，15 cm培養(yǎng)皿加5 mL顯色液。蓋上皿蓋，避光放于37℃培養(yǎng)箱中。20 min后開始觀察有無變藍(lán)的陽性結(jié)果并記錄，一般以3 h為準(zhǔn)，特殊情況下可觀察過夜是否變藍(lán)。反應(yīng)過后打開皿蓋，將濾紙烘干，保存并記錄。

1.8?陽性克隆酵母質(zhì)粒的抽提

準(zhǔn)備滅菌的1.5 mL EP管，每個管中加入35 μL滅菌超純水，取單克隆菌落分別混合于水中;65℃ 水浴5 min后液氮冷凍30 s，反復(fù)凍融5次;12 000 r/min離心2 min，吸取約35 μL上清至新EP管中;上清即為酵母質(zhì)粒，可直接用于下一步菌落PCR模板。

1.9?酵母質(zhì)粒PCR檢測及測序

以所提取的質(zhì)粒為模板，用文庫載體通用引物S1：5′-GTCGAAAATTCAAGACAAGG-3′、A1：5′-GTAATTAGTTATGTCACGCTT-3′，對所提取的酵母質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將條帶長度大于750 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物送到青島擎科公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索比對，獲得候選基因的序列全長及預(yù)測功能。

1.10?酵母質(zhì)粒的擴(kuò)增

將抽提的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，利用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.11?Prey質(zhì)粒與Bait質(zhì)粒一對一互作驗證

將誘餌質(zhì)粒和篩選出的文庫質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化NMY51酵母菌株，涂布在SD-leu/-trp平板和含有20 mg/L X-gal的篩選平板上，30℃培養(yǎng)4天左右。觀察菌株生長情況，若菌落在含X-gal的篩選平板上正常生長并且變藍(lán)說明誘餌與獵物蛋白能夠在酵母菌中發(fā)生互作。

2?結(jié)果與分析

2.1?誘餌載體的構(gòu)建

將測序正確的FTPK1，經(jīng)?Sfi?Ⅰ酶切分別連接誘餌載體質(zhì)粒pBT3-N、pBT3-STE、pBT3-SUC，菌落PCR驗證正確后，提取質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定（圖1），大小都正確，即為pBT3-N-FTPK1、pBT3-STE-FTPK1、pBT3-SUC-FTPK1重組質(zhì)粒，將正確質(zhì)粒放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2?自激活檢測及功能驗證

將目的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株后，均勻涂布于不同篩選培養(yǎng)基上。2天后觀察菌落生長情況發(fā)現(xiàn)，含有pBT3-N-FTPK1和pOst1-NubI質(zhì)粒的酵母菌株在三缺和四缺培養(yǎng)基上沒有生長，說明該誘餌載體不能進(jìn)行下一步試驗;而含有pBT3-STE-FTPK1和pOst1-NubI、pBT3-SUC-FTPK1和pOstl-NubI質(zhì)粒的菌株在三缺和四缺培養(yǎng)基上均有菌落長出，說明誘餌在酵母菌中能正常表達(dá)，并且具有功能，可以進(jìn)行下一步試驗。

2.3?篩選條件的選擇

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株后涂布于含不同濃度3-AT 的SD-leu/-trp/-his（三缺）、SD-leu/-trp/-his/-ade（四缺）固體篩選培養(yǎng)基上，統(tǒng)計酵母菌的生長情況。試驗結(jié)果如表7所示，pBT3-SUC-FTPK1在三缺培養(yǎng)基上的的活性比pBT3-STE-FTPK1高，所以擬選用pBT3-SUC-FTPK1進(jìn)行文庫篩選;而pBT3-SUC-?FTPK1?在3-AT濃度不同的三缺板上幾乎都有酵母菌生長，所以選用不含3-AT的四缺培養(yǎng)基進(jìn)行文庫篩選。

M：Trans2K???Plus DNA Marker，下同;1：FTPK1加酶切位點后酶切;2：pBT3-N載體質(zhì)粒酶切;3：pBT3-N質(zhì)粒未酶切對照;4：pBT3-N-FTPK1連接后酶切鑒定;5：FTPK1加酶切位點后酶切;6：pBT3- STE載體質(zhì)粒酶切;7：pBT3- STE質(zhì)粒未酶切對照;8：pBT3- STE-FTPK1連接后酶切鑒定;9：FTPK1加酶切位點后酶切;10：pBT3- SUC載體質(zhì)粒酶切;11：pBT3- SUC質(zhì)粒未酶切對照;12：pBT3-???SUC-FTPK1連接后酶切鑒定。

2.4?cDNA文庫篩選結(jié)果

進(jìn)行篩庫反應(yīng)4天后，四缺培養(yǎng)基上的酵母菌落數(shù)共有167個，將每個菌落劃線于新的四缺固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生長2天后將每個菌落影印于濾紙上進(jìn)行LacZ染色，結(jié)果（圖2）顯示，除82號菌落以外均變藍(lán)，共計166個，對其進(jìn)行質(zhì)粒提取并保存。

2.5?文庫篩選單克隆菌落質(zhì)粒的提取、菌落PCR及序列比對

利用酵母文庫質(zhì)粒上的通用引物對所提質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR，選擇條帶大小在1 000 bp以上的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序（圖3），測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast，檢索得到對應(yīng)的基因，并記錄其預(yù)測功能。

PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果中，有若干重復(fù)序列，忽略不計重復(fù)的結(jié)果，在NCBI上進(jìn)行序列比對，查找基因全長，共得到17個基因?；虻腘CBI登錄號及預(yù)測功能如表8所示。

2.6?利用酵母雙雜交系統(tǒng)重新驗證FTPK1與候選互作蛋白的互作

根據(jù)篩選結(jié)果，我們選取2個候選蛋白b5、SNARE，與誘餌蛋白FTPK1重新轉(zhuǎn)化酵母菌株，在含有X-gal的四缺培養(yǎng)基上進(jìn)一步驗證。如圖4 A所示，F(xiàn)TPK1與b5共轉(zhuǎn)酵母菌株在含有?X-?gal的四缺培養(yǎng)基上正常生長并且變藍(lán)，說明可能發(fā)生互作，還需要其它體內(nèi)和體外試驗做進(jìn)一步驗證。圖4 B是陽性對照和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母后的培養(yǎng)結(jié)果。

3?討論與結(jié)論

利用酵母雙雜交技術(shù)篩選互作蛋白是研究蛋白互作的經(jīng)典傳統(tǒng)技術(shù)，能夠利用酵母cDNA文庫篩選誘導(dǎo)蛋白的互作蛋白，但也存在很多弊端，如假陽性率比較高，有些蛋白翻譯后需要后期的加工修飾，在酵母系統(tǒng)中常常形成錯誤的構(gòu)象而影響篩選結(jié)果，后期需要利用其它技術(shù)來進(jìn)行驗證[13]。膜系統(tǒng)酵母雙雜交（DUAL membrane starter kits）是將泛素分為兩部分表達(dá)，即其N端部分（NubI）和C端部分（Cub），后者融合有能啟動核內(nèi)報告基因表達(dá)的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在細(xì)胞中組成可分離的泛素蛋白（[NubI∶Cub]-reporter）體系。該系統(tǒng)能夠利用膜蛋白作為誘餌在細(xì)胞膜上原位檢測蛋白-蛋白間的相互作用而無需核定位信號。類受體蛋白激酶作為一種膜定位的蛋白激酶主要通過磷酸化下游底物來發(fā)揮作用。本研究利用膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術(shù)，初步篩選得到17個與FTPK1可能互作的候選蛋白，從中挑選2個與發(fā)育相關(guān)的基因，重新轉(zhuǎn)化酵母做進(jìn)一步的驗證，發(fā)現(xiàn)FTPK1可能與b5和SNARE蛋白發(fā)生互作。由于酵母雙雜交結(jié)果假陽性率較高。下一步我們將會結(jié)合其它體內(nèi)、體外互作試驗，如雙分子熒光互補(bǔ)試驗、pulldown技術(shù)、Co-IP等，對候選蛋白進(jìn)一步驗證。

另外，根據(jù)近兩年的報道，利用磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)分析來尋找RLK下游的底物蛋白也受到越來越多的關(guān)注[9，14]。該方法主要是通過獲得目的RLK的突變體，然后進(jìn)行磷酸化組學(xué)分析，根據(jù)差異的磷酸化底物蛋白來確定候選底物蛋白。我們目前也正在利用Crisp-Cas9系統(tǒng)來敲除FTPK1基因，希望通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)合酵母雙雜交試驗進(jìn)一步確定該蛋白的候選互作蛋白。

本試驗結(jié)果為進(jìn)一步研究FTPK1的功能及探究FTPK1的下游信號調(diào)控通路奠定了基礎(chǔ)。

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