李文學(xué)， 青學(xué)剛， 陳寶瑞， 肖文福， 鄒邦興， 劉俊鳳

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所，四川 南充 637000)

僵蠶為常用大宗藥材，來源于蠶蛾科昆蟲家蠶(Bombyxmori)4～5齡幼蟲感染(或人工接種)白僵菌(Beauveriabassiana)致死的干燥體[1]。主產(chǎn)于四川、江蘇、浙江、廣東及山東等省，以四川省產(chǎn)量最大，為川產(chǎn)藥材主流品種。其味咸、辛，性平；歸肝、肺、胃經(jīng)；具有祛風(fēng)定驚，化痰散結(jié)的功效；常用于驚風(fēng)抽搐，咽喉腫痛，皮膚瘙癢；頜下淋巴結(jié)炎，面神經(jīng)麻痹等病癥的治療[2]?！吨袊幍洹访鞔_指出，僵蠶只能是由球孢白僵菌感染致死的才能入藥。基于白僵蠶擁有的獨特中藥藥效和巨大市場開發(fā)空間，國內(nèi)眾多專家學(xué)者在白僵蠶人工培養(yǎng)方面開展了相關(guān)研究。王印安等[3-4]探索出“制種-接種-培養(yǎng)-采集”的技術(shù)方案，分析了不同濃度孢子懸浮液對家蠶感染率，濕度對分生孢子侵染蠶體的影響。李冬生等[5]通過研究湖北養(yǎng)蠶區(qū)僵蠶白僵菌的基本生物學(xué)特性，為分離純化培養(yǎng)白僵菌并人工接種到蠶蛹上，使之培養(yǎng)加工轉(zhuǎn)化為白僵蠶蛹提供了可行的技術(shù)支撐。路國兵等[6]對山東省主要蠶區(qū)白僵菌進行分離、培養(yǎng)、鑒定和基礎(chǔ)生物學(xué)特性研究，為白僵菌篩選技術(shù)方案的建立及人工生產(chǎn)提供了可靠的技術(shù)依據(jù)[6]。孫偉屹等[7]從自然感病僵蠶身上提取到5株白僵菌菌株，并對其基礎(chǔ)生物學(xué)特性及對家蠶的毒力進行研究。

近年來，隨著養(yǎng)蠶技術(shù)的提高，嚴(yán)格防控各類家蠶病蟲害發(fā)生，自然感病獲得的僵蠶數(shù)量日益減少，已不能滿足藥材市場對僵蠶的需求[8]。而市場上僵蠶質(zhì)量魚目混珠，參差不齊，甚至以裹石灰、廣灰等手段冒充僵蠶，嚴(yán)重影響藥品質(zhì)量安全[9]。目前，四川蠶區(qū)已開展白僵蠶專門人工養(yǎng)殖，在生產(chǎn)中使用的菌種多是感病死亡僵蠶孢子粉，未進行純化優(yōu)選，而且人工培養(yǎng)生產(chǎn)的方式簡單粗放，菌種施用濃度隨意性大，僵化死亡率得不到保證，僵蠶收益率普遍較低。在規(guī)模化人工飼養(yǎng)僵蠶生產(chǎn)中，球孢白僵菌的施用濃度是影響僵蠶收益率的關(guān)鍵因素。施用濃度過高，不僅增加菌種成本，而且造成僵蠶蠶體較小就集中死亡，影響收益[10]；施用濃度過低，白僵菌侵染家蠶后發(fā)病死亡時間較長，部分家蠶死亡時已形成繭殼，增加削繭取僵蛹的工作，難以收集，同樣影響收益。鑒于此，采用形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對從自然感病僵蠶上分離的致病菌株進行鑒定，并研究其人工飼養(yǎng)僵蠶的最適使用濃度，以期為僵蠶人工飼養(yǎng)提供優(yōu)良菌株并提高僵蠶的養(yǎng)殖效益。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蠶 僵蠶分離株為自然感病白僵蠶，來源于四川省南部縣興盛鄉(xiāng)蠶業(yè)合作社；人工飼養(yǎng)家蠶品種為“川山×蜀水”，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所家蠶育種研究室提供。

1.1.2 試劑 PDA培養(yǎng)基，自制；70%乙醇、0.5%吐溫80、E.Z.N.A.TMFungal DNA Miniprep Kits試劑盒、引物ITS-F (5’-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3’)、引物ITS-R ( 5’-GGAAGTAAAAGT

CGTAACAAGG-3’)、模板DNA、10×PCR緩沖液、dNTP、5 U/μL Taq酶和滅菌水，市購。

1.1.3 儀器設(shè)備 OLYMPUS BX53+CCD DP73，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 白僵菌的分離純化 在無菌操作臺上用70%乙醇將自然感病死亡的白僵蠶表面消毒1 min，酒精燈火焰灼燒1 s后，再用無菌水沖洗2～3次，放置于無菌培養(yǎng)皿中，在25℃、空氣相對濕度(RH) 80%的無菌環(huán)境條件下培養(yǎng)，5 d后蠶體遍布白色菌絲。挑取少量菌絲體經(jīng)PDA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，2 d后挑取單菌落再次擴大培養(yǎng)，供后續(xù)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定及病原擴繁等使用。

1.2.2 分離菌株的鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。將擴繁的單菌落菌株用0.5%吐溫80液配制成濃度為1×107個/mL的孢懸液，用接種針將孢懸液接種于 PDA 平板培養(yǎng)基，然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7天觀察記錄菌株菌落形態(tài)特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察該菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)[11]。

2) 分子生物學(xué)鑒定。取50 mg分離菌株的孢子粉用E.Z.N.A.TMFungal DNA Miniprep Kits試劑盒提取基因組DNA，利用通用引物ITS-F和ITS-R進行rRNA基因ITS序列的PCR擴增。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括模板DNA 1 μL、10×PCR緩沖液 2.5 μL、dNTP 2 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL和17.5 μL滅菌水；擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s，54℃ 1 min，72℃ 30 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸 10 min。由上海生物工程股份有限公司測序。將菌株ITS序列擴增片段測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫已登錄真菌ITS序列進行比對，下載部分菌株序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；選用蠟蚧輪枝菌(Lecanicilliumlecanii) ICAL-7 的同源序列作為外群，500次重復(fù)[12-13]。

1.2.3 不同濃度分離菌株孢懸液對家蠶的致病力 用含0.5%吐溫80的無菌水將分離菌株孢子粉制備成1×108個/mL、5×107個/mL、1×107個/mL、1×106個/mL及5×105個/mL的孢懸液備用。試驗設(shè)5個處理，對5齡及以上蠶的體表分別均勻噴施上述5個濃度的孢懸液，以噴施清水為對照，每個處理噴施家蠶500頭，3次重復(fù)。噴施環(huán)境控制在(26±2)℃，RH≥80%。噴施接種白僵菌后逐日記錄發(fā)病死蠶數(shù)，將僵蠶及時揀出，充分僵化后經(jīng)60℃烘干至恒重，調(diào)查各處理僵化死亡率及僵蠶平均單條重量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，并繪制僵化死亡率折線圖及僵蠶平均單條重量柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

從圖1可見，經(jīng)25℃培養(yǎng)7 d后分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落正面呈白色絮狀，質(zhì)地緊密，略隆起；背面呈淺褐色，無可溶性色素。無特化的分生孢子梗；產(chǎn)孢細胞燒瓶狀，簇生于菌絲頂端或其分枝上，直或彎曲，大小(6.1～35.8)μm×(1.5～2.2)μm，頸部細長，頂端“之”字形延伸，寬度不足1 μm；分生孢子寬橢圓形或近球形，無色，壁光滑，大小1.5～3.0 μm，未見有性態(tài)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。

注：A，PDA培養(yǎng)基上的菌落；B，菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。Note: A,colonies cultured on PDA medium; B,conidiogenous structure of the strain.

2.2 分離菌株的ITS序列測定與系統(tǒng)發(fā)育進化

PCR擴增獲得分離菌株的 rRNA-ITS 序列長度為525 bp(GeneBank登錄號：MG230317)，通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫在線比對發(fā)現(xiàn)，該菌株rRNA-ITS序列與球孢白僵菌(Beauveriabassiana) CCTu0007 (Genebank登錄號：KM249032)等的序列高度相似。從圖2可見，分離菌株與多個球孢白僵菌聚為一類，其相似度99%以上，表明親緣關(guān)系最近。其中，8株球孢白僵菌聚在一個較大的分支上，和布氏白僵菌(BeauveriabrongniartiiCCRC32838)分屬于白僵菌的不同進化支，而蠟蚧輪枝菌作為外群處于一個單獨的分支，與白僵菌的親緣關(guān)系最遠。結(jié)合對分離菌株分生孢子和菌落形態(tài)的觀察結(jié)果，確定該菌株為球孢白僵菌，命名為BeauveriabassianaNB。

圖2 采用ML法構(gòu)建不同來源白僵菌的系統(tǒng)發(fā)育樹NFig.2 Phylogenetic dendrogram of B.bassiana strains from different source based on ML method

2.3 白僵菌在人工飼養(yǎng)僵蠶中的應(yīng)用

從圖3可見，在噴施時間、環(huán)境溫濕度完全一致條件下，不同濃度處理家蠶僵化死亡率差異明顯，隨濃度遞減其死亡率呈遞減，發(fā)病死亡時間呈遞增的線性關(guān)系。其中，濃度為1×108個/mL時家蠶染病死亡最快，處理4～5 d即集中死亡，第5天死亡率達100%；濃度為5×105個/mL時家蠶染病、死亡較慢，處理4 d時尚無死蠶，至第7天死亡率僅40%。從圖4可知，BeauveriabassianaNB的最佳施用濃度為(1～5)×107個/mL，該濃度下家蠶僵化死亡率達98%，且僵蠶平均單條重為0.9 g，僵蠶收益率最高。

圖3 不同濃度白僵菌接種5齡蠶的僵化死亡率NFig.3 Inactivation mortality rate of B.mori larvae with 5th instar inoculated with different concentrations of B.bassiana NB

圖4 不同濃度白僵菌接種5齡蠶僵蠶的平均單條重量NFig.4 Average weight/stiff larva from B.mori larvae with 5th instar inoculated with different concentrations of B.bassiana NB

3 結(jié)論與討論

該研究在廣泛收集、分離僵病致病菌的基礎(chǔ)上，分離鑒定得到1株球孢白僵菌(BeauveriabassianaNB)。其最佳施用濃度為(1～5)×107個/mL，該濃度下家蠶僵化死亡率達98%，且僵蠶平均單條重為0.9 g，僵蠶收益率最高。研究結(jié)果為僵蠶人工規(guī)?；曫B(yǎng)提供了科學(xué)合理的致病病原及其最優(yōu)施用濃度，確保了僵蠶收益最大化。

僵蠶致病白僵菌菌株眾多，目前已報道的菌株有球孢白僵菌、卵孢白僵菌及布氏白僵菌。不同菌株的生物學(xué)特性差異較大，其生長速度、產(chǎn)孢量和毒力高低不盡相同[14]。因此，后期研究有必要對僵蠶白僵菌進行評價，從僵蠶收益率和僵蠶藥效等方面綜合考慮，確定可用于規(guī)模化人工飼養(yǎng)僵蠶的最優(yōu)白僵菌菌株。