宋阿會 佟琰 劉英莉

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一類具有多向分化和自我更新能力的細(xì)胞，大量研究證明了間充質(zhì)干細(xì)胞在各種疾病治療中的作用，尤其是可以通過自分泌和旁分泌等作用參與免疫疾病的調(diào)控[1-2]。MSCs能夠通過分泌細(xì)胞因子（如TGF-β、PGE2等）抑制T細(xì)胞增殖，促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，影響B(tài)細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生等，參與機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫，也能夠促使髓樣細(xì)胞分化，從而發(fā)揮抗炎和免疫負(fù)調(diào)控的作用[3]。最近研究表明，人臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞 （Human umbilical cord Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells，WJMSC）與BMSC具有類似的形態(tài)和細(xì)胞表型[4]，但WJ-MSC表達(dá)的HLA-ABC分子較少，免疫原性更低，且來源于丟棄的臍帶，不受倫理限制，更有希望應(yīng)用于各種疾病的治療[5]。

大電導(dǎo)鈣依賴性鉀（BK通道）分布于神經(jīng)元、各脈管系統(tǒng)、腎小球、腎小管等細(xì)胞膜上[6-8]，參與血壓調(diào)控，神經(jīng)遞質(zhì)釋放，維持鉀離子平衡等生理活動[9]。BK通道是由α亞基單獨或聯(lián)合不同類型的β亞基組成的G蛋白偶聯(lián)的跨膜蛋白，包含感應(yīng)膜電位的電壓敏感性跨膜域（Voltage sensing domain，VSD），結(jié)合鈣離子的胞質(zhì)內(nèi)域（Cytosolic domain），以及負(fù)責(zé)鉀離子內(nèi)流的門孔通道功能域（Pore gate domain，PGD）[8]。研究發(fā)現(xiàn)，BK通道也參與各種炎癥的調(diào)節(jié)作用，如哮喘疾病中BK通道激活劑能夠減輕氣道反應(yīng)[10]；同樣，BK同道還參與IL-1b誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[11]，有望成為炎癥治療的靶點。此外，有研究已經(jīng)在BMSC上發(fā)現(xiàn)了BK通道的表達(dá)和活性，且發(fā)現(xiàn)BK通道活性能夠影響B(tài)MSC的增殖和分化能力[12]。但是，目前尚無研究證實BK通道活性對WJ-MSC的細(xì)胞活性和凋亡的影響，以及是否影響WJ-MSC分泌細(xì)胞因子。本研究嘗試探索BK通道抑制劑預(yù)處理WJ-MSC后對其細(xì)胞活性和凋亡的影響，并通過檢測預(yù)處理后其炎癥因子（IL6，IL10）的表達(dá)，探究BK通道抑制劑是否影響WJMSC的旁分泌作用，明確BK通道抑制劑對WJMSC的免疫特性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和耗材

αMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（Bioind，以色列），青霉素和鏈霉素（Gibco，美國），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），CCK－8檢測試劑盒（Rainbio，上海睿安生物科技有限公司），Annexin-V-FITC/PI試劑盒（BD，美國），Elisa檢測試劑盒（Bioligand，美國），PBS溶液（Hyclone，美國），Hanks溶液（Gibco，美國），Paxilline（Alomone，美國），電轉(zhuǎn)液、電泳液（生工生物工程有限公司，中國），BKα抗體（Alomone，美國），GAPDH抗體（Proteintech，美國），RIPA（碧云天，中國），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（索萊寶，中國）。

超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek，美國），流式細(xì)胞分析儀（Beckman，美國），電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；超敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（GE公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理

1.2.1 原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)

經(jīng)孕產(chǎn)婦知情同意，取其剖宮產(chǎn)分娩時舍棄的新鮮臍帶組織（標(biāo)本來源于上海市第一婦嬰保健院），裝入事先預(yù)冷的含有1%青霉素和鏈霉素的PBS溶液中。將臍帶組織以PBS洗滌數(shù)次，去除血液后移至Hank's溶液中，去除兩條臍靜脈和一條臍動脈，剝離外皮，暴露中間的膠凍樣的華通膠，剪成小段。將剪成段的華通膠移入空培養(yǎng)皿中，晾干，將其剪至1 mm3大小，用勺子將其鋪至T75培養(yǎng)瓶底部，反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，在組織塊對側(cè)加入10 mL含有10%胎牛血清和1%雙抗的αMEM培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中過夜。8～16 h后，將培養(yǎng)瓶反轉(zhuǎn)使培養(yǎng)基漫過組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)約2周。至組織塊周圍有細(xì)胞爬出時，去除組織塊，用0.25%胰蛋白酶消化約30～60 sec，中止消化后1 000 r/min離心5 min，重懸后接種至新培養(yǎng)皿中，每3天換一次液。取第3～7代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 WJ-MSC預(yù)處理

取第3～7代WJ-MSC細(xì)胞，以106個/孔接種至6孔板，待其生長至80%融合時加入不同濃度的Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）孵育24 h，取上清或細(xì)胞用于后續(xù)檢測。

1.3 Western－b lot檢測BK通道的表達(dá)

取第3～7代WJ-MSC細(xì)胞，以106個/孔接種至6孔板，待其生長至80%融合時去除上清，加入RIPA和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物配置的裂解液，裂解細(xì)胞，用BCA法定量各組蛋白濃度后，加入適量5×loading buffer，100℃煮10 min。配置8%的SDSPAGE膠，將3個不同來源的臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞所提取的蛋白樣品在上樣前100℃煮5 min，以80 V恒壓電泳至染料達(dá)膠底部，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入一抗，4℃過夜孵育8～16 h，TBST洗3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后顯色。Image J軟件分析灰度值。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測編碼BK通道的KCNMA1基因表達(dá)

采用TRIzol法提取第3～7代細(xì)胞總RNA，利用Prime Script RT Master Mix （Takara036A）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR法擴增KCNMA1基因，所得產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖膠中進(jìn)行電泳。KCNMA1基因正向引物序列為：5’-GGCAGCAGTCTTAGAATGAGTAG-3’；反向引物序列為：5’-AAAGCCCACCACATGCGTT-3’。

1.5 CCK－8法檢測細(xì)胞活性

細(xì)胞預(yù)處理后，各孔加入10μL CCK－8，37℃孵育4 h后，用微孔酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值。

1.6 Annexin-V-FITC/PI檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞預(yù)處理后，用0.25%胰蛋白酶消化各孔細(xì)胞，取一組空白組作為空白對照，其余各孔細(xì)胞消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清，用100μL Annexin Buffer重懸后加入4μL AnnexinV，避光孵育10 min，加入4μL PI后立即上機檢測。

1.7 Elisa法檢測細(xì)胞因子

取細(xì)胞預(yù)處理后的上清，按照Elisa試劑盒步驟依次檢測各組IL6、IL10濃度。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均用GraphPad軟件統(tǒng)計分析3次獨立實驗結(jié)果，計算各組間均值和標(biāo)準(zhǔn)差，多組間差異比較用ANOVA one-way檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代WJ-MSC上BK通道的表達(dá)

光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代WJ-MSC為梭狀，似成纖維細(xì)胞，與間充質(zhì)干細(xì)胞描述一致（圖1）。Westernb lot檢測顯示，3個不同來源臍帶組織的原代WJMSC提取的蛋白質(zhì)，均可檢測到BK通道抗體表達(dá)（圖2）。同時，以瓊脂糖凝膠電泳在這3個不同標(biāo)本來源的間充質(zhì)干細(xì)胞上鑒定到了編碼BK通道的KCNMA1基因的表達(dá)（圖3），即不同來源的臍帶華通膠分離的間充質(zhì)干細(xì)胞均有BK通道的表達(dá)。

圖1 光鏡下原代WJ-MSC形態(tài)Fig 1 The morphology of primary WJ-MSC cells under optical microscope

圖2 不同標(biāo)本來源WJ-MSC中BK通道的表達(dá)Fig.2 The protein expression of BK channel in different WJ-MSC was detected

圖3 不同標(biāo)本來源WJ-MSC中編碼BK通道的KCNMA1Fig.3 The gene KCNMA1 encoding BK channel in WJ-MSC

2.2 不同濃度Paxilline對WJ-MSC活性的影響

不同濃度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）處理WJ-MSC 24 h后，用CCK-8試劑盒檢測各組在450 nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，低濃度的BK通道抑制劑Paxilline對細(xì)胞活性沒有明顯影響，而高濃度Paxilline（1μM、10μM）可顯著降低細(xì)胞活性（P<0.01）（圖4）。

圖4 CCK-8法檢測不同濃度BK通道抑制劑對WJ-MSC活性的影響Fig.4 The cell viability of WJ-MSC was detected by CCK－8 after treated with different

2.3 不同濃度Paxilline對WJ-MSC凋亡的影響

不同濃度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）處理WJ-MSC 24 h后，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞，通過Annexin-V-FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，高濃度Paxilline（10μM）可明顯增加Annexin-V單陽細(xì)胞的比例，促進(jìn)WJ-MSC細(xì)胞的凋亡（P<0.01），而低濃度Paxilline對WJ-MSC細(xì)胞的凋亡無明顯影響（圖5）。

圖5 流式細(xì)胞分析儀檢測不同濃度BK通道抑制劑處理WJ-MSC后凋亡細(xì)胞比例Fig.5 The cell apoptosis ratio of WJ-MSC was detected by flow cytometry after treated with different concentration of BK channel inhibitors

2.4 不同濃度Paxilline對WJ-MSC分泌IL6、IL10的影響

不同濃度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）處理WJ-MSC 24 h后，用Elisa檢測試劑盒檢測各組上清中IL6和IL10的濃度。結(jié)果顯示，各濃度Paxilline均能夠促進(jìn)WJ-MSC分泌IL6（P<0.01），但并不增加IL10的分泌（圖6）。

圖6 Elisa法檢測不同濃度BK通道抑制劑對WJ-MSC分泌的IL6和IL10的表達(dá)Fig.6 The expression of IL6 and IL10 secreted by WJMSC was detected by Elisa after treated with different concentration of BK channel inhibitors

3 討論

大量的研究均肯定了間充質(zhì)干細(xì)胞在各種疾病中存在的治療作用，亦可通過分泌細(xì)胞因子、生長因子、胞外囊泡等發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)控等作用[2，13－14]。由于表面分子表達(dá)的差異，不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具備的免疫特性有所差異[15]。其中，WJ-MSC來源更原始，免疫原性更低。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，通過一些干預(yù)方法預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞能夠改變其免疫調(diào)節(jié)能力[16]，如使用低濃度LPS預(yù)處理MSC后，能夠增強MSC對高濃度LPS介導(dǎo)的凋亡的耐受作用[17]。本研究利用組織貼壁法成功從人臍帶組織中分離培養(yǎng)出WJ-MSC，利用Western－b lot檢測了WJ-MSC上BK通道的表達(dá)，與BMSC研究結(jié)果一致，BK通道也存在于WJ-MSC上[12]。Paxilline可選擇性抑制BK通道，在不同濃度（0μM、0.1μM、1μM、10μM）預(yù)處理下，高濃度Paxilline能夠抑制WJ-MSC的細(xì)胞活性，促進(jìn)其凋亡。表明抑制BK通道活性能夠降低WJ-MSC的細(xì)胞活性，促進(jìn)其凋亡。

研究表明，BK通道參與各種炎癥過程的調(diào)節(jié)，如BK通道抑制劑能夠減少LPS刺激下巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子（TNFα），能夠減輕胰腺炎小鼠模型中巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)等，但目前尚無研究探究BK通道抑制劑對WJ-MSC分泌的炎癥因子的影響。細(xì)胞因子IL6可由多種類型細(xì)胞分泌產(chǎn)生[18]，發(fā)揮不同的效應(yīng)：①可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞合成急性時相蛋白（如C反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A）等，啟動急性炎癥反應(yīng)[19]；②作用于骨髓，可促進(jìn)血小板釋放[20]；③與TGF-β共同促進(jìn)CD4+的T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，上調(diào)Th17/Treg細(xì)胞的比例，促進(jìn)自身免疫性疾病以及慢性炎癥的發(fā)展[21]。細(xì)胞因子IL10則主要由受刺激的髓樣細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[22]，能夠抑制促炎因子的分泌，增強B淋巴細(xì)胞分化及抗體的產(chǎn)生[23]。這兩種細(xì)胞因子的平衡有助于調(diào)節(jié)多種疾病的炎癥反應(yīng)過程[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制BK通道后可明顯增加WJ-MSC分泌IL6的水平，但不影響其IL10的分泌。表明BK通道的活性能夠影響WJ-MSC細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而影響其在免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

本研究存在一定的局限性。首先，還需通過細(xì)胞電生理實驗，以進(jìn)一步驗證WJ-MSC上BK通道的活性；其次，針對BK通道的抑制只使用了抑制劑，或可利用shRNA敲減WJ-MSC上的BK通道后進(jìn)行驗證，同時由于一直沒有探索出原代干細(xì)胞的過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建條件，尚缺乏過表達(dá)BK通道以進(jìn)一步檢驗上述結(jié)論。此外，雖然BK通道抑制劑能夠促進(jìn)WJ-MSC分泌的IL6水平，但抑制BK通道后對WJ-MSC的免疫負(fù)調(diào)控作用的影響尚需進(jìn)一步研究明確。