劉 晶 郭 婷 郭天一,3 鄒佳文,3 周瀟恬,3 何 潔 石雨虹 羅非君,3

(1. 湘南學院化學生物與環(huán)境工程學院，湖南 郴州 423000；2. 中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院糧油深加工與品質控制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；3. 中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

中國是世界上重要的水稻種植大國之一，其中稻米加工的副產(chǎn)物米糠年產(chǎn)生量超過1.100×107t。米糠中含有優(yōu)質的營養(yǎng)物質，如蛋白質、生育酚、纖維素、多糖和谷維素等[1-2]。但目前中國對米糠資源的深加工研究不足，僅用于飼料加工，不利于資源的有效利用。

近年來，米糠中的多糖引起眾多學者的研究與關注。米糠多糖(rice bran polysaccharide，RBP)是從稻糠中提取純化后的一種多糖，結構主要為α-1, 6糖苷鍵[3]。與Ito等[4]曾報道的米糠中提取α活性多糖有相似結構。已有藥理及臨床研究表明，處于初級研究與開發(fā)階段的米糠多糖和研究較為深入的香菇及云芝等中的多糖有類似的生物學作用，如抗腫瘤[5-7]、抗炎[8]、抗氧化[9-10]、提高機體免疫功能[11-12]、降血脂[13]、降血糖[14]等。

炎癥是機體對外界病毒、化學物質等入侵而引發(fā)的自發(fā)反應，但過度炎癥會造成機體組織的損傷。潰瘍性結腸炎是較為常見的慢性炎癥疾病，采用的藥物治療很難斷根，反復發(fā)作，因此，從天然產(chǎn)物中尋找無毒副作用的天然產(chǎn)物是重要的防治策略。植物多糖具有多種生物學功能，已有的研究[15-17]發(fā)現(xiàn)多種植物多糖具有抗炎功能。米糠多糖是否具有抗炎功能，目前尚無報道。DSS能造成小鼠結腸上皮的損傷，內(nèi)毒素入血，結腸水腫和過度炎癥。DSS誘導的小鼠結腸炎癥模型與臨床潰瘍性結腸炎病癥類似，是最常見的結腸炎癥模型。本研究使用DSS誘導ICR小鼠，建立結腸炎癥動物模型，評估米糠多糖的抗炎活性以及研究其分子機理，將為包含米糠多糖功能性食品的研究與開發(fā)提供基礎的理論數(shù)據(jù)及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

小鼠：采用ICR小鼠，約8周齡，數(shù)量為60只，隨機分為3組，每組雌雄各半，體重范圍為30.0～34.5 g，湖南斯萊克景達實驗動物公司；小鼠置湖南師范大學醫(yī)學院動物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為(22±2) ℃，相對濕度為40%～70%。動物使用許可證號：SYXK(湘)-2014-0112。飼養(yǎng)1周后，開始試驗。小鼠試驗期間，每天檢查動物房的飼養(yǎng)環(huán)境(包括溫度、濕度、飲用水、飼料等)，確保小鼠生長在相對穩(wěn)定的良好環(huán)境。

1.2 材料與試劑

米糠多糖：西安天瑞生物技術有限公司(經(jīng)本課題組進一步純化，多糖含量為90%，可分成兩種不同分子量，一種為500 ku，約占85%，另一種分子量為25 ku，約占15%。米糠多糖中含有甘露糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖四種單糖，且摩爾比為：1.35∶3.32∶1.00∶1.25，結構為雜單糖，單糖間主要由α-型糖苷鍵連接而成)；

DSS：純度99%，分子量36～50 ku，美國Pharmacia 公司；

總RNA提取試劑盒、RNA逆轉錄試劑盒、標記熒光的RT-qPCR試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；

總蛋白質提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限責任公司；

抗白細胞介素-1(interleukin-1β，IL-1β)兔抗(Cat#12507S)、抗誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)兔抗(Cat#13120)、抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNFα)兔抗(Cat#6945S)、環(huán)氧化合酶-2(cyclooxygenase-2, Cox-2)兔抗(Cat#12282)、β-Actin鼠抗(Cat#12620)、p44/42 MAPK(ERK1/2) 兔抗(Cat#9194)、phosphor-p44/42 MAPK (p-ERK1/2) 兔抗(Cat#4370)、p38 MAPK兔抗(Cat#9213)、phosphor-p38 MAPK (p-p38) 兔抗(Cat#4511)、JNK MAPK兔抗(Cat#9253)、phosphor-JNK MAPK (p-JNK) 兔抗(Cat#4668)：美國Cell Signaling Technology 公司；

無水乙醇、甲醇、氯仿、二甲苯、異丙醇等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

超純水系統(tǒng)：ZWM-UT1-10型，湖南中沃水務環(huán)?？萍加邢薰?；

精密分析天平：AUY220型，日本島津公司；

移液槍：P1000-1型，百得實驗室儀器(蘇州)有限公司；

低溫臺式離心機：22331 Hambrug型，德國Eppendorf公司；

-86 ℃超低溫冰箱：DW-HL388型，中科美菱科技有限責任公司；

光學顯微鏡：XDS-10型，上海團結儀器制造有限公司；

垂直電泳槽：Mini-PROTEAN Tetra System型，美國Bio-Rad公司；

電泳儀：PowerPacTMBasic型，美國Bio-Rad公司；

熒光定量PCR儀：CFX96TMReal-Time System型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像儀：ChemiDocTMXRS+型，美國Bio-Rad公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 米糠多糖的配制

(1) 小鼠米糠多糖灌胃溶液：稱取米糠多糖400 mg，置于裝有20 mL滅菌超純水的離心管中，蓋緊管蓋后上下顛倒，使米糠多糖粉末充分溶解并混勻，4 ℃保存。

(2) 米糠多糖細胞溶液：精確稱取米糠多糖100 mg，溶于10 mL滅菌超純水中，充分震蕩混勻后配制成10 mg/mL 米糠多糖工作液，使用0.45 μm微孔濾膜進行除菌過濾，分裝于1.0 mL EP管中，整個配制過程需在無菌環(huán)境下進行。

1.4.2 試驗小鼠的分組 小鼠進行1周喂養(yǎng)后，30只ICR雄性小鼠，隨機分成3組，30只ICR雌性小鼠也隨機分成3組，再隨機組合，每組雌雄各半，設為正常對照、DSS損傷、米糠多糖保護3組。對照組試驗小鼠自由攝食和飲水，損傷組試驗小鼠自由飲食2 d，從第3天開始飲用3.0% DSS溶液；保護組小鼠第1天起到試驗結束灌胃米糠多糖溶液[劑量為500 mg/(kg·d)]，第3天起到試驗結束飲用3.0% DSS溶液和自由攝食。小鼠試驗結束后，將試驗小鼠頸椎脫臼處死，先摘小鼠眼球，取血液樣本，然后解剖小鼠取出結腸、脾臟等器官組織，快速置低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分

每只小鼠從試驗開始至結束期間，每天早上8:30測定體重、飲水量和攝食量，并仔細觀察小鼠的精神狀態(tài)、大便形狀以及便血程度。按照表1的DAI評分標準，由同一個試驗員對各試驗小鼠進行DAI(DAI=便血分數(shù)+體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù))[18]評分。試驗小鼠糞便隱血測定：將少量的小鼠糞便用棉簽比較均勻地涂抹在載玻片上，分別滴加3～5滴鄰聯(lián)甲苯胺溶液和3.0% H2O2溶液，仔細觀察小鼠糞便的顏色，判斷小鼠糞便的隱血程度：① 隱血呈陰性：2 min內(nèi)幾乎無變化；② 隱血呈弱陽性：10 s左右由淺(藍)逐漸變深；③ 隱血呈陽性：由淺藍褐色逐漸變?yōu)樗{褐色；④ 隱血呈強陽性：立即顯現(xiàn)為藍褐色。

表1 DAI評分標準Table 1 Evaluation standard of DAI scoring

1.4.4 小鼠結腸組織髓過氧化物酶活性測定 髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)存在于免疫細胞(中性白細胞)中，利用其還原過氧化氫的能力，可以測定MPO的活性。MPO還原過氧化氫得到的復合物，經(jīng)供氫體鄰連茴香胺作用生成黃色化合物，測定該黃色化合物在460 nm處的吸光度得到其生成量，推算出MPO的活性。小鼠結腸組織MPO活性的測定按照試劑盒說明書進行，MPO活力單位以每克結腸組織濕片于37 ℃的反應體系中分解1 μmol過氧化氫為1個酶活力單位。

1.4.5 小鼠結腸組織丙二醛(MDA)含量的測定 根據(jù)Xu等[19]報道的方法稍做改正。取約90 mg小鼠結腸組織，在預冷的PBS溶液中清洗干凈，加入1.0 mL PBS溶液，然后在玻璃勻漿中勻漿，10 000 r/min 離心10 min，取上清，采用BCA法，測定樣本中總蛋白含量。取組織混懸液加入0.67%硫代巴比士酸和25%三氯乙酸，95 ℃維持45 min。13 000 r/min 離心20 min，取上清液，使用酶標儀檢測535 nm吸光值，計算MDA的含量。

1.4.6 結腸組織亞硝酸鹽含量的測定 參考Miranda等[20]的報道稍做改正，具體如下：取60 mg小鼠結腸組織，加入220 μL PBS中勻漿，取120 μL樣品加入到120 μL 甲醇中，3 500 r/min 離心10 min，取上清液。100 μL 試驗樣本，依次加入100 μL三氯化釩、50 μL磺胺和50 μL NEDD，在37 ℃下培養(yǎng)箱中孵育30 min，用酶標儀測定540 nm吸光值，然后計算結腸樣本中亞硝酸鹽的含量。

1.4.7 小鼠結腸組織病理學分析 試驗完成后，采用頸椎脫臼法，快速處死試驗小鼠，然后快速打開小鼠腹腔，分離小鼠的整個結腸，預冷的PBS溶液中清洗，取距離肛門約1 cm的小段結腸組織，用10%中性福爾馬林溶液，固定24～48 h，然后采用流水沖洗過夜，不同濃度梯度酒精依次脫水，用二甲苯透明，透蠟，用蘇木精染色液染色5～10 min，流水沖洗10～15 min，再用純水沖洗數(shù)秒，95%乙醇沖洗5 s。置伊紅染色液中染色1～2 min，純水洗2次，95%乙醇脫水2次。二甲苯透明約5 min。采用樹膠封存，在顯微鏡下觀察結腸組織病理學變化。

1.4.8 RT-qPCR測定結腸組織炎癥因子mRNA表達水平 提取RNA營造一個無RNA酶的環(huán)境，將提取RNA過程中使用的相關工具采用0.1%焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)溶液避光浸泡24 h，并高壓蒸汽滅菌再烘干處理。每組稱取動物結腸組織約100 mg，置于1.5 mL EP管中迅速放入液氮中，再倒入已用液氮預冷的研缽中研磨成粉。使用Trizol法嚴格按照Tranzol-up試劑盒說明書操作流程提取RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性并用超微量分光光度儀測定RNA濃度和純度。測定其濃度，用反轉錄試劑盒合成cDNA后進行PCR擴增反應。炎癥因子PCR引物序列參見劉博等[21]報道。qPCR反應條件：94 ℃，3 min；94 ℃，35 s；60 ℃，40 s；72 ℃，1 min；42個循環(huán)，采用2-ΔΔCt(RQ)法計算靶基因mRNA相對表達水平。

1.4.9 Western blotting測定結腸組織炎癥因子和MAPK磷酸化蛋白的表達 每組稱取100 mg小鼠結腸組織，加液氮研磨成粉末，用含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA 裂解液充分裂解后，4 ℃下10 000 r/min離心10 min 后取上層透明液體，即為蛋白。取2 μL蛋白直接采用BCA法測定蛋白濃度。隨后按照1∶1 比例加入2×SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)上樣緩沖液，在95 ℃下加熱5 min使蛋白變性。根據(jù)目的基因分子量的大小配制適宜濃度的SDS-PAGE膠(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠)，取處理好的樣品進行電泳分離，然后將蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜上。轉膜完后，用1×TBST配制的5%牛血清蛋白(BSA)封閉液封閉1 h，再孵育1∶1 000稀釋的一抗，置于脫色搖床上過夜。第2天取出膜用1×TBST溶液清洗3次，10 min/次；接著孵育1∶5 000稀釋的二抗稀釋液，置于搖床上孵育1 h，之后采用一抗孵育完的清洗方式。最后將膜浸泡于自制顯影液中于凝膠成像儀中成像并采集圖片。目的蛋白的相對表達量為目的條帶(基因)積分光密度值與內(nèi)參照(β-Actin)的積分光密度值的比值。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件將試驗數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)結果用平均值±標準差(means±SD)表示，試驗設立3個平行組，組間比較采用方差分析和t檢驗，P<0.01有極顯著性差異，P<0.05有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 米糠多糖對DSS誘導小鼠宏觀表型的影響

正常對照組小鼠體重、飲食飲水量狀況保持穩(wěn)定增加，動作靈活，毛發(fā)有光澤，大便性狀正常，其他方面也均符合正常小鼠的生長狀況。DSS能造成小鼠結腸上皮的損傷，內(nèi)毒素入血，結腸水腫和過度炎癥。DSS損傷組小鼠慢慢呈現(xiàn)潰瘍性結腸炎癥癥狀：體重增長越來越慢，后期體重呈明顯的下降趨勢，同時，攝食量下降、精神狀態(tài)較差、活動量減少，不同程度的便稀、便血。相比于DSS損傷組，米糠多糖灌胃組小鼠體重有部分增加，而疾病活動指數(shù)也明顯下調，提示米糠多糖能明顯地改善小鼠的健康狀況，見圖1(a)和(b)。小鼠DSS處理后，小鼠出現(xiàn)嚴重腹瀉，腹瀉率高達90%，米糠多糖灌胃組小鼠也有80%出現(xiàn)了腹瀉，但癥狀相對較輕，見圖1(c)。同時，通過隱血試驗分析，DSS也導致90%小鼠出現(xiàn)便血，米糠多糖灌胃組小鼠則降為70%(P<0.05)，說明米糠多糖能部分改善小鼠的便血癥狀，見圖1(d)。本研究發(fā)現(xiàn)米糠多糖能明顯改善小鼠的健康狀況，說明米糠多糖可能是一種潛在防治潰瘍性結腸炎的功能活性成分。

2.2 米糠多糖對DSS 誘導小鼠結腸、脾臟的影響

小鼠飲用DSS能產(chǎn)生結腸炎癥典型特征，如試驗小鼠結腸呈現(xiàn)水腫、充血、形成潰瘍、小鼠結腸的腸壁明顯增厚、結腸的重量顯著增重和長度呈現(xiàn)縮短等，見圖2(a)。米糠多糖灌胃小鼠，結腸長度明顯增加，見圖2(b)。脾臟是重要的免疫器官，是機體的細胞免疫以及體液免疫的中心，脾臟組織中含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞。DSS也能促使小鼠脾臟水腫，形成炎癥，脾臟體積增大和重量增加，見圖2(c)和(d)。米糠多糖灌胃小鼠也能部分抑制小鼠脾臟的水腫和炎癥，脾臟體積和重量顯著降低(P<0.05)，見圖2(c)和(d)。結果提示米糠多糖能改善DSS誘導小鼠的結腸炎癥和脾臟炎癥，可能具有較廣泛的抗炎功效。

*：P<0.05 **：P<001 #：P>0.05圖1 米糠多糖對小鼠健康狀況的影響Figure 1 Effects of rice bran polysaccharide on health status of mice

*：P<0.05 **：P<001圖2 米糠多糖對小鼠結腸和脾臟的影響Figure 2 Effects of rice bran polysaccharide on colon and spleen of mice

2.3 米糠多糖對DSS誘導小鼠結腸組織MPO、MDA和亞硝酸鹽含量的影響

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又叫過氧化物酶，是由中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞分泌的血紅素蛋白酶。機體發(fā)生炎癥時，免疫細胞被征集到損傷組織，是重要的損傷指標之一。DSS誘導促使小鼠結腸炎癥，結果發(fā)現(xiàn)結腸組織MPO含量明顯上升，增加了3.46倍；米糠多糖能部分抑制MPO含量的增加，下調25.9%，見圖3(a)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可以通過測定MDA的含量來評估細胞膜損傷的程度，是組織重要的損傷指標之一。在DSS誘導的小鼠結腸組織中，MDA的含量顯著增加，增加了3.71倍，米糠多糖能部分抑制MDA含量的增加，下調33.4%，見圖3(b)。通過對小鼠結腸損傷的評估，提示米糠多糖能降低DSS誘導結腸組織的損傷。NO是一種重要的炎癥介質，但NO在組織中極不穩(wěn)定，快速形成硝酸鹽和亞硝酸鹽，因此，測定組織中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量，可間接定量組織中NO釋放量，在DSS誘導的小鼠結腸組織中，硝酸鹽的含量顯著增加3.54倍，米糠多糖能部分抑制硝酸鹽含量的增加，下調45.1%，見圖3(c)。試驗結果說明米糠多糖也能抑制炎癥介質NO的釋放。

*：P<0.05 **：P<001圖3 米糠多糖對小鼠結腸組織損傷的影響Figure 3 Effects of rice bran polysaccharide on the damage of colonic tissues in mice

2.4 米糠多糖對DSS誘導小鼠結腸組織病理的影響

由圖4可知，對照組小鼠結腸黏膜沒有損傷，無炎性細胞浸潤結腸組織；DSS損傷組試驗小鼠結腸組織中上皮細胞損傷嚴重，黏膜上皮充血、糜爛，杯狀細胞明顯減少，腺體隱窩不完全或完全缺失，并且大量炎性細胞浸潤結腸組織；相比DSS損傷組，米糠多糖灌胃小鼠的結腸組織損傷明顯減輕，結腸上皮相對完好，腺體隱窩排列比較規(guī)則，炎性細胞浸潤部分減少。結果進一步證實米糠多糖能減少DSS誘導的小鼠結腸組織損傷。

2.5 米糠多糖對DSS誘導小鼠結腸組織炎癥因子表達的影響

過度的炎癥反應產(chǎn)生大量的炎癥因子，從而對機體產(chǎn)生極大的損傷。TNFα在潰瘍性結腸炎患者血清中TNFα的濃度明顯增高，且與病情呈正相關。TNFα能促使單核細胞在炎癥組織局部聚集，同時也能產(chǎn)生許多炎癥因子或前體炎癥因子如白細胞介素和一氧化氮等，使炎癥大爆發(fā)，誘導結腸水腫，使得組織黏膜損傷壞死[22-23]。在DSS誘導結腸炎中，TNFα被認為是一種關鍵的促進炎子。取各組小鼠結腸組織提取總RNA，熒光實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)：正常結腸組織炎癥因子表達均很低；相對于正常小鼠結腸組織，當DSS誘導小鼠產(chǎn)生結腸炎癥后，結腸組織TNFαmRNA表達增加6.81倍，米糠多糖灌胃小鼠結腸組織TNFαmRNA表達下調29.4%[圖5(a)] 。這樣就能中斷TNFα引發(fā)的瀑布效應，米糠多糖對結腸炎癥組織的保護作用可能與減少TNFα表達相關。如有報道[24]采用siRNA干預小鼠結腸的TNFα表達量，能部分改善結腸炎患者的臨床病征。

圖4 米糠多糖對小鼠結腸組織損傷的影響 (200×)

Figure 4 Effects of rice bran polysaccharide on the pathological damages of colonic tissues in mice (200×)

*：P<0.05；**：P<001圖5 米糠多糖對小鼠結腸組織炎癥因子mRNA表達的影響Figure 5 Effect of rice bran polysaccharide on the mRNA expressions of inflammatory factors in colonic tissues of mice

炎癥因子IL-1β也是炎癥的主要驅動因子，IL-1β主要由浸潤結腸黏膜的單核細胞(巨噬細胞)分泌[25]。IL-1β也能與其他的促炎因子協(xié)同，引發(fā)炎癥反應和組織損傷的梯級炎癥反應，從而進一步加重炎癥[26]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)結腸炎患者IL-1β明顯升高[27]。本研究發(fā)現(xiàn)相對于正常小鼠結腸組織，炎癥因子IL-1βmRNA表達在DSS損傷組小鼠結腸組織上升了3.86倍，米糖多糖下調IL-1βmRNA表達50.1%[圖5(b)]。與TNFα類似，也能中斷IL-1β和其他的細胞因子協(xié)同引發(fā)的炎癥瀑布效應。同時，米糠多糖也可能與部分改善小鼠的便血相關，如用紫草萘醌降低小鼠的IL-1β表達，能促進糞便的形成，減少便血[28]。

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)為一種在正常組織中較少表達的誘導酶，而當細胞受到炎癥刺激時大量表達。由于Cox-2可以快速應答一系列促炎介質和細胞因子，因此，長久以來一直被認為在炎癥發(fā)生的病理過程中扮演重要角色。Cox-2 mRNA表達水平在DSS損傷組小鼠結腸組織上升了5.12倍，米糠多糖下調Cox-2 mRNA表達30.1%[圖5(c)]；試驗結果提示米糠多糖能抑制DSS誘導小鼠結腸組織炎癥的轉錄。

NO也是一種炎癥介質，可以直接殺滅入侵的細菌，在炎癥狀態(tài)下，可以作為炎癥遞質起到信號傳導作用。在機體處于急性炎癥反應的時候，許多中性粒細胞和少量巨噬細胞便會激活誘生型一氧化氮合酶(iNOS)，誘導精氨酸生出大量的NO，在潰瘍性結腸炎中主要是iNOS起作用，測定結腸組織iNOS、NO 水平可作為反映潰瘍性結腸炎病變程度和判斷預后的一個客觀指標[29]。本研究發(fā)現(xiàn)結腸組織中iNOS有少量的表達，DSS誘導小鼠結腸組織iNOS表達顯著上升，米糠多糖能明顯抑制iNOS表達和結腸組織亞硝酸鹽的形成[圖5(d)]。

通過Western blotting 進一步分析顯示，正常對照組小鼠結腸組織中IL-1β和iNOS蛋白表達極低，TNFα和Cox-2蛋白表達較低；DSS誘導組小鼠結腸組織IL-1β蛋白表達水平增加了5.47倍，米糠多糖灌胃使小鼠結腸組織IL-1β蛋白表達水平下降26.5%[圖6(a)]；炎癥因子TNFα在DSS損傷組小鼠結腸組織中蛋白表達水平上升3.43倍，米糠多糖灌胃使小鼠結腸組織IL-1β蛋白表達水平下降61.8%[圖6(b)]；相對于正常小鼠結腸組織，DSS損傷組小鼠結腸組織Cox-2蛋白表達水平上升4.85倍，米糠多糖灌胃使小鼠結腸組織Cox-2蛋白表達水平下降26.4%[圖6(c)]；iNOS是炎癥因子NO釋放的關鍵調控酶，在DSS損傷組小鼠結腸組織中蛋白表達水平上調了9.87倍，米糠多糖灌胃使小鼠結腸組織iNOS蛋白表達水平下降達70.9%[圖6(d)]。小鼠結腸組織蛋白表達分析進一步證實了米糠多糖能抑制DSS誘導小鼠結腸組織炎癥因子的表達。

米糠多糖+DSS組與DSS組比較，*：P<0.05；**：P<001圖6 米糠多糖對小鼠結腸組織炎癥因子蛋白表達的影響

Figure 6 Effect of rice bran polysaccharide on the protein expressions of inflammatory factors in colonic tissues of mice

2.6 米糠多糖對DSS誘導小鼠結腸組織MAPK信號通路的影響

MAPK是機體最重要的信號傳導通路，參與多種生物學功能。MAPK也是炎癥啟動和發(fā)展的重要信號通路，MAPK家族包括ERK1、ERK2、JNK、p38等成員，其均與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關[30]。為了進一步探討米糠多糖抗炎性質的機理，研究了米糠多糖對重要炎癥信號通路MAPK的影響。采用非磷酸化ERK1/2、JNK和p38抗體Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，對照組、DSS損傷組和米糠多糖保護組小鼠結腸組織ERK1/2、JNK和p38表達無明顯變化，提示DSS誘導并不能調控此3種蛋白基因的轉錄和翻譯，同時，米糠多糖灌胃也不能改變小鼠結腸組織ERK1/2、JNK和p38基因的轉錄和翻譯。采用磷酸化ERK1/2抗體Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，DSS誘導促使小鼠結腸組織ERK1/2磷酸化蛋白含量增加，上升了2.24倍，米糠多糖灌胃ERK1/2磷酸化蛋白含量下降了30.8%[圖7(a)]；JNK磷酸化蛋白含量在DSS損傷組小鼠結腸組織中蛋白表達水平上升2.78倍，米糠多糖灌胃使小鼠結腸組織JNK磷酸化蛋白含量下降51.4%[圖7(b)]；相對于ERK1/2和JNK磷酸化蛋白含量，p38磷酸化蛋白含量在正常小鼠結腸組織中極低，DSS損傷組小鼠結腸組織p38磷酸化蛋白含量增加了3.35倍，米糠多糖灌胃使小鼠結腸組織Cox-2蛋白表達水平下降26.0%[圖7(c)]。ERK1/2、JNK和p38蛋白磷酸化是MAPK的激活狀態(tài)，米糠多糖能抑制結腸組織ERK1/2、JNK和p38蛋白的磷酸化，說明米糠多糖能抑制MAPK信號通路的活化，參與其抗炎作用。MAPK家族成員能使促轉錄因子AP-1(如c-Jun)和NF-κB (p65)的磷酸化，促使轉錄因子活化和核移位[31-32]。在炎癥因子IL-1β、TNFα和基因啟動子區(qū)域，均存在一個或多個AP-1和NF-κB，調控炎癥因子的表達[33-35]。本研究發(fā)現(xiàn)米糠多糖能部分抑制DSS誘導的小鼠結腸組織MAPK活化，提示米糠多糖可能通過抑制MAPK信號通路，下調轉錄因子AP-1和NF-κB的活性，從而抑制炎癥因子表達。

米糠多糖+DSS組與DSS組比較，*：P<0.05；**： P<001圖7 米糠多糖對小鼠結腸組織MAPK信號通路的影響Figure 7 Effect of rice bran polysaccharide on MAPK signaling pathway in colonic tissues of mice

3 結論

米糠多糖無毒副作用且具有抗結腸炎癥的作用，為防治結腸炎癥提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)米糠多糖可明顯改善DSS誘導的結腸炎癥小鼠健康狀況，減輕DSS導致的小鼠結腸組織的損傷，下調結腸中炎癥因子的表達，對 DSS 誘導的小鼠結腸炎癥具有一定的防治功能，提示添加米糠多糖可能開發(fā)相關輔助藥物和預防腸炎的功能性食品、保健食品提供科學理論依據(jù)。

當前已證實有許多食品來源的多糖具有抗炎作用，但其作用的分子機理尚不清楚[16]。米糠多糖能抑制MAPK信號通路，但MAPK通路如何調控炎癥因子的表達尚需要進一步研究，同時，米糠多糖如何調控MAPK通路，也需要進一步探索。除此之外，多糖是一類結構非常復雜的混合物，不同的分子量組分可能呈現(xiàn)相反的生物學功能[16]，因此，多糖的結構差異、分子量大小與免疫調節(jié)的關系還需要采用新的技術手段來解決。