王 姍， 張巧丹， 李世峰， 徐 洪， 楊 方， 楊 潔

研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)介導(dǎo)的皮膚成纖維細胞遷移和向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化是影響損傷修復(fù)和傷口愈合的重要因素，同時其異?；罨彩墙閷?dǎo)瘢痕疙瘩形成的重要機制之一[1-2]。Rho GTP酶家族之一Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Ras related C3 botulin substrate 1, Rac1)能夠調(diào)控細胞遷移，也是參與Rho介導(dǎo)的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化和促進瘢痕形成的關(guān)鍵調(diào)控因子之一[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)能夠抑制TGF-β1活化和阻斷Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而發(fā)揮拮抗肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化和改善矽肺纖維化的作用[4]。本研究通過原代培養(yǎng)大鼠皮膚成纖維細胞，旨在觀察Ac-SDKP通過阻斷Rac1抑制皮膚成纖維細胞遷移和向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)(德國PAA公司)；Ac-SDKP(瑞士Bachem AG公司)；TGF-β1、兔抗心肌蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(myocardin-related transcription factor, MRTF-A)(美國Sigma公司)；兔抗α-SMA、兔抗Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ, ColⅠ)及兔抗GAPDH(美國Abcom公司)；兔抗Rac1(美國Epitomics公司)；兔抗血清應(yīng)答因子(serum response factor, SRF)(中國Bilworld公司)。二步法通用型免疫組織化學試劑盒(PV6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二抗山羊抗兔IgG(美國KPL公司)；ECL顯色試劑盒(美國GE公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組 出生1～2 d的乳鼠[中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,動作合格證號:SCXK(京)2010-0007]斷頸處死，消毒，剪開頸背部的皮膚并分離，PBS浸洗后剪成2 mm×10 mm細條，置于0.25%的Dispase酶中，4 ℃冰箱中消化過夜。次日PBS洗1次，眼科鑷分離皮膚組織的真皮和表皮，PBS浸洗1次，將真皮剪成1 mm3的組織塊。采用組織貼壁法，置于37 ℃培養(yǎng)箱，在含有10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)條件下進行細胞培養(yǎng)。取第2代細胞進行實驗。實驗分組：空白對照組，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；TGF-β1誘導(dǎo)組，無血清培養(yǎng)條件下，加入終濃度為100 nmol/L的TGF-β1誘導(dǎo)；Ac-SDKP預(yù)處理組，無血清培養(yǎng)條件下，先給予100 nmol/L的Ac-SDKP預(yù)處理1 h，再給予TGF-β1誘導(dǎo)。

1.2.2劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將第2代細胞種植于6孔板，待細胞生長至融合狀態(tài)時，用100 μL的無菌槍頭以6點的方向劃痕，PBS沖洗除去細胞碎片后，按實驗設(shè)計分組刺激24 h后，倒置顯微鏡下觀測劃痕愈合。

1.2.3免疫細胞化學法檢測α-SMA及Rac1的表達 參照文獻[5]中的細胞爬片制備方法，固定，高壓修復(fù)，一抗(1∶150)4 ℃孵育過夜，37 ℃孵育二抗30 min，鏡下控制DAB顯色和復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.4Western-blot法檢測α-SMA，SRF，MRTF-A，ColⅠ及Rac1蛋白的表達 提取總蛋白，BCA試劑盒測量蛋白濃度后，按照20 g蛋白/泳道上樣，常規(guī)電泳和電轉(zhuǎn)，5%牛血清白蛋白封閉，一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)法顯色，伯樂凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對蛋白條帶進行積分光密度(integral optical density, IOD)值定量分析，所得指標與相應(yīng)內(nèi)參的比值作為該蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1Ac-SDKP對TGF-β1介導(dǎo)的皮膚成纖維細胞Rac1表達的調(diào)節(jié)作用 免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)組的細胞體積明顯增大，細胞核內(nèi)Rac1棕褐色陽性表達明顯，而Ac-SDKP預(yù)處理組可明顯抑制Rac1的陽性表達(圖1)。Western-blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組的Rac1蛋白表達上調(diào)2倍，給予Ac-SDKP預(yù)處理后，Rac1表達下調(diào)至TGF-β1誘導(dǎo)組的18.75%，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2，表1)。

2.2Ac-SDKP對TGF-β1介導(dǎo)的皮膚成纖維細胞遷移能力的調(diào)節(jié)作用 倒置顯微鏡下觀察顯示，與空白對照組比較，TGF-β1可以明顯促進乳鼠成纖維細胞向劃痕空白區(qū)域遷移生長，給予Ac-SDKP預(yù)處理后再接受TGF-β1誘導(dǎo)，則可顯著降低細胞遷移，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

A：空白對照組；B：TGF-β1誘導(dǎo)組；C：Ac-SDKP預(yù)處理組.圖1 皮膚(肌)成纖維細胞Rac1的表達Fig 1 The expression of Rac1 in skin (myo)fibroblasts

C：空白對照組；T：TGF-β1誘導(dǎo)組；Ac：Ac-SDKP預(yù)處理組.圖2 皮膚(肌)成纖維細胞Rac1，α-SMA，SRF，MRTF-A及Col Ⅰ的定量表達Fig 2 The expression of Rac1，α-SMA，SRF，MRTF-A，Col Ⅰ in skin (myo)fibroblasts

分 組α-SMASRFColⅠMRTF-ARac1空白對照組0.70±0.101.08±0.240.98±0.330.82±0.270.97±0.05TGF-β1誘導(dǎo)組1.26±0.09☆1.83±0.03☆1.96±0.15☆1.44±0.48☆2.08±0.69☆A(yù)c-SDKP預(yù)處理組0.72±0.10☆#1.24±0.49☆#1.40±0.17☆#0.75±0.09☆#0.39±0.17☆#

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；α-SMA：α平滑肌肌動蛋白；Col Ⅰ：Ⅰ型膠原. 與空白對照組比較，☆：P<0.05；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，#：P<0.05.

A～C：倒置顯微鏡下觀察. A：空白對照組(C組)；B：TGF-β1誘導(dǎo)組(T組)；C：Ac-SDKP預(yù)處理組(Ac組); D:3組細胞遷移面積比較，與空白對照組比較，☆：P<0.05；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，#：P<0.05.圖3 皮膚(肌)成纖維細胞劃痕實驗Fig 3 Wound healing test of skin (myo)fibroblasts

2.3Ac-SDKP對TGF-β1介導(dǎo)的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用 免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后，細胞內(nèi)的α-SMA強陽性表達，呈纖絲狀平行交叉排列，給予Ac-SDKP干預(yù)后，α-SMA表達明顯減弱(圖4)。Western-blot檢測結(jié)果顯示，對照組的α-SMA，SRF，MRTF-A及ColⅠ表達水平均較低，給予TGF-β1刺激后，各蛋白的表達水平分別上調(diào)至對照組的1.8，1.69，1.76和2倍；而Ac-SDKP預(yù)處理組與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，α-SMA，SRF，MRTF-A及ColⅠ分別下調(diào)至57%，68%，52%及71%(圖2，表1)。以上差別經(jīng)統(tǒng)計學分析，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：空白對照組；B：TGF-β1誘導(dǎo)組；C：Ac-SDKP預(yù)處理組.圖4 皮膚(肌)成纖維細胞α-SMA的表達Fig 4 The expression of α-SMA in skin(myo)fibroblasts

3 討 論

瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合中，由于膠原合成代謝機能異常和持續(xù)亢進，引起瘢痕組織過度生長的一種病理性過程。病理性瘢痕不但影響美觀，而且顯著影響患者的生理機能和生活質(zhì)量[1-2]。目前針對病理性瘢痕尚無較好的治療方案。對瘢痕疙瘩的治療一直是皮膚科和整形外科的難點之一。

研究表明，TGF-β1在介導(dǎo)正常損傷修復(fù)和病理性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。體內(nèi)外研究均顯示，TGF-β1能夠顯著促進人皮膚成纖維細胞α-SMA和膠原蛋白表達上調(diào)，促進其遷移能力提高，導(dǎo)致瘢痕組織膠原沉積和病理性攣縮[6-8]。Rac1蛋白在正常的皮膚損傷愈合中，能夠促進成纖維細胞遷移和傷口收縮[9]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Rac1在硬皮病患者的成纖維細胞中可調(diào)節(jié)N-甲酰肽受體介導(dǎo)活性氧生成[10]，針對Rac1的阻斷能夠抑制來源于硬皮病患者的成纖維細胞膠原的合成和肌成纖維細胞的分化[11]，提示Rac1在成纖維細胞中的高表達可能是其分泌膠原和促進肌成纖維細胞分化的重要機制之一。本研究也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠顯著促進皮膚成纖維細胞Rac1蛋白表達，同時Ⅰ型膠原和肌成纖維細胞的相關(guān)指標SRF，MRTF-A和α-SMA表達顯著上調(diào)，并伴有成纖維細胞遷移能力的提高，提示Rac1可能參與了對皮膚成纖維細胞遷移能力和肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控。

筆者所在課題組多年來圍繞Ac-SDKP抗纖維化作用進行了系列研究，發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP對成纖維細胞的增殖、肌成纖維細胞分化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制，是其抗器官纖維化作用的主要機制[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP能夠通過促進血管生成、誘導(dǎo)上皮再生等機制促進大鼠皮瓣移植的存活率[14]。國內(nèi)研究也顯示，Ac-SDKP能夠抑制人真皮成纖維細胞增殖，以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA的表達，還能夠抑制成纖維細胞分泌TGF-β1[15-16]，提示Ac-SDKP具有潛在的抑制病理性瘢痕的作用。本研究結(jié)果顯示，Ac-SDKP能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細胞分化和遷移能力的提高，同時抑制了Rac1蛋白的表達。這些結(jié)果將為系統(tǒng)研究Ac-SDKP的抗器官纖維化效應(yīng)機制，以及作為潛在的抗纖維化藥物提供進一步的理論和實驗依據(jù)。然而，本研究仍存在一些局限性，由于缺乏信號抑制劑，或是Rac1沉默或過表達的對照組，因此，很難明確判斷Ac-SDKP對Rac1起到何種調(diào)節(jié)作用。此外，目前僅從體外研究發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP對病理性瘢痕的潛在作用機制，但缺乏體內(nèi)研究的進一步論證。這也將是課題組未來研究的重點方向之一。