董 捷，郭 蕊，郭海坤，李君竹，方勐鴿，王德前，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省淳安千島湖好清蜜蜜蜂專業(yè)合作社，浙江 杭州 311701； 4.浙江省淳安千島湖方興中蜂專業(yè)合作社，浙江 杭州 311701)

中華蜜蜂囊狀幼蟲病(簡(jiǎn)稱：中囊病)是由西方蜜蜂攜帶的囊狀幼蟲病毒(sacbrood bee virus，SBV)引起，對(duì)西方蜜蜂并不造成嚴(yán)重危害[1]，但中蜂感染后卻產(chǎn)生了新的變異株——中蜂囊狀幼蟲病病毒(Chinese sacbrood bee virus，CSBV)，造成中蜂個(gè)體乃至整個(gè)蜂群的大量死亡。該病毒自1972年在廣東首次發(fā)現(xiàn)并造成嚴(yán)重危害后，逐漸蔓延至全國(guó)，曾給我國(guó)中蜂產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性打擊[2]。目前，中囊病已經(jīng)發(fā)展成為一種慢性病，呈經(jīng)常性、局部性暴發(fā)特點(diǎn)，嚴(yán)重影響我國(guó)中蜂生產(chǎn)安全和中蜂資源保護(hù)[3]。

浙江省淳安縣，地處浙西丘陵山區(qū)，擁有世界三大千島湖之一的千島湖景區(qū)，該區(qū)域森林面積位居全省首位，生態(tài)資源豐富[4]。近年來，隨著浙江省農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展、生態(tài)發(fā)展戰(zhàn)略的深入推進(jìn)，淳安縣環(huán)千島湖地區(qū)的中蜂養(yǎng)殖量呈現(xiàn)暴發(fā)式增加態(tài)勢(shì)，由此引起的中蜂病害不斷暴發(fā)，不但制約中蜂產(chǎn)業(yè)發(fā)展，而且對(duì)當(dāng)?shù)匾吧蟹滟Y源造成損失。因此，做好蜜蜂病害監(jiān)控和及時(shí)采取有效措施是保障蜜蜂安全生產(chǎn)的重要策略。特別是危害中蜂最為嚴(yán)重的中囊病，目前該病害在本地區(qū)中蜂中的流行病學(xué)調(diào)查仍是空白。

中囊病病毒具有潛伏期長(zhǎng)、傳播速度快等特點(diǎn)，決定了該病害防治十分困難，生產(chǎn)中主要以預(yù)防為主、治療為輔[5]。在這種情況下，病害的快速檢測(cè)和準(zhǔn)確診斷尤為重要。目前，在中囊病診斷中已經(jīng)開發(fā)的診斷方法有RT-PCR[6]、半套式RT-PCR[7]、依賴病毒解旋酶擴(kuò)增檢測(cè)方法[8]以及熒光定量TaqMan探針法[9]，其中RT-PCR方法以其特異性強(qiáng)，步驟簡(jiǎn)單，成本較低等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于蜜蜂病毒的檢測(cè)。CSBV屬于RNA病毒，具有變異速度快的特點(diǎn)[10]，以最近報(bào)道的CSBV全基因組為參考序列開發(fā)RT-PCR診斷方法具有重要實(shí)際應(yīng)用意義。

本文以浙江省CSBV基因組全長(zhǎng)序列(登錄號(hào)：MH509439)為模板，選擇結(jié)構(gòu)蛋白的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立檢測(cè)中囊病的RT-PCR方法；并利用建立的方法開展浙江省淳安縣環(huán)千島湖地區(qū)17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)的中囊病流行病學(xué)調(diào)查，全面了解中囊病在該地區(qū)的流行情況，為合理制定中囊病防控措施提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)促進(jìn)該地區(qū)中蜂產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2017年11月1日至12月31日根據(jù)中蜂在千島湖周圍的分布情況，選擇淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)取2個(gè)中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)進(jìn)行樣品采集，同時(shí)記錄該時(shí)期主要蜜源植物以及養(yǎng)蜂點(diǎn)周圍是否存在意蜂蜂群。根據(jù)蜂群飼養(yǎng)規(guī)模，采集5～15群作為每個(gè)飼養(yǎng)點(diǎn)的代表，總共收集到307群中蜂樣品，每群采集50～100頭表面健康的工蜂，裝入帶有煉糖的蜂籠活體帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(6110A)、pMD19-T載體與內(nèi)切酶QuickCutTMBamHⅠ和QuickCutTMHindⅢ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Trans2K Plus DNA Marker、2×EasyTaqPCR Super Mix、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 中囊病RT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

以GenBank已公布的浙江中蜂囊狀幼蟲病毒(CSBV-ZJ)全基因組(登錄號(hào)：MH509439)為參考序列，應(yīng)用BioEdit 7.2和Primer Premier 5.0軟件，在其保守的結(jié)構(gòu)蛋白基因區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物：5’-ACAAGAACGTCCACTACACCG-3’；下游引物：5’-GGCGCACACTTAGCGTGAGTT-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為496 bp，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

選擇感染中囊病的幼蟲，經(jīng)液氮研磨，參照總RNA提取試劑盒操作步驟，提取病樣總RNA；根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，取1 μg病樣的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR退火溫度的優(yōu)化

以1.2.2節(jié)步驟制備的中囊病病樣cDNA為模板，參考所設(shè)計(jì)引物的Tm值，優(yōu)化PCR反應(yīng)溫度。反應(yīng)體系(50 μL)：cDNA 1 μL；2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL；上游和下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，其余用ddH2O補(bǔ)足。

PCR擴(kuò)增過程：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇最適退火溫度。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將1.2.3節(jié)步驟獲得的單一條帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1中，通過藍(lán)白斑篩選及質(zhì)粒小提等步驟獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-CSBV；再通過雙酶切試驗(yàn)進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定，雙酶切反應(yīng)體系(30 μL)：10×QuickCut Buffer 3 μL，pMD19-T-CSBV 1 μg，Q.CutBamHⅠ1 μL，Q.CutHindⅢ 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至30 μL；酶切反應(yīng)條件：30 ℃保溫10 min，37 ℃保溫10 min；反應(yīng)結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。最后，將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過NCBI中的BLAST進(jìn)行比對(duì)，檢查序列的正確性。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的中囊病RT-PCR檢測(cè)方法分別對(duì)蜜蜂殘翅病毒(deformed wing virus，DWV)、黑蜂王臺(tái)病毒(black queen cell virus，BQCV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus，IAPV)和CSBV的陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

利用重組質(zhì)粒pMD19-T-CSBV作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，通過超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度，然后依次進(jìn)行10倍梯度稀釋(101～1011)，每個(gè)稀釋度各取1 μL按照已建立的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)條帶模板的最高稀釋倍數(shù)，確定模板濃度并推算最低檢出拷貝數(shù)。

1.2.7 重復(fù)性及可靠性試驗(yàn)

選擇6份不同的CSBV陽(yáng)性樣品和6份CSBV陰性樣品，利用建立的方法重復(fù)檢測(cè)3次，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性；選擇陽(yáng)性PCR產(chǎn)物按照1.2.4節(jié)步驟進(jìn)行克隆測(cè)序比對(duì)，驗(yàn)證該方法的可靠性。

1.3 浙江省淳安縣中囊病流行病學(xué)調(diào)查

1.3.1 樣品處理

將采集的307群蜜蜂樣品，每群取30只工蜂混合進(jìn)行勻漿處理，按照1.2.2節(jié)步驟分別對(duì)待檢樣品進(jìn)行總RNA提取和cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)

用1.2節(jié)步驟建立的中囊病RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)307份待檢樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件統(tǒng)計(jì)307份樣品的CSBV陽(yáng)性檢出率，按照地理位置統(tǒng)計(jì)分析中囊病在不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測(cè)方法的建立

2.1.1 退火溫度的優(yōu)化

采用本文設(shè)計(jì)的中囊病檢測(cè)引物，以中囊病病樣為模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示，在約500 bp的位置檢測(cè)到一條單一條帶，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小一致(圖1)。通過將退火溫度由50 ℃到65 ℃進(jìn)行梯度改變，結(jié)果顯示：退火溫度從50 ℃到63 ℃均能夠擴(kuò)增出單一條帶，且無(wú)明顯引物二聚體，表明該引物特異性好；根據(jù)條帶的亮度及PCR的特異性，本文選擇56 ℃作為中囊病RT-PCR檢測(cè)的退火溫度(圖1)。

1～12代表不同退火溫度。1，50.0 ℃；2，51.5 ℃；3，53 ℃；4，54.5 ℃；5，56 ℃；6，57.5 ℃；7，59 ℃；8，60.5 ℃；9，61.5 ℃；10，63 ℃；11，65 ℃；12，陰性對(duì)照；M，DL 1000 DNA marker。1-12 represented different annealing temperatures. 1， 50.0 ℃; 2， 51.5 ℃; 3， 53 ℃; 4， 54.5 ℃; 5， 56 ℃; 6， 57.5 ℃; 7， 59 ℃; 8， 60.5 ℃; 9， 61.5 ℃; 10， 63 ℃; 11， 65 ℃; 12， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.圖1 RT-PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimizing of RT-PCR annealing temperature

1，重組質(zhì)粒pMD19-T-CSBV；2，酶切產(chǎn)物；3，空質(zhì)粒pMD19-T；M，DL 2000 plus DNA marker。1， Recombinant plasmid pMD19-T-CSBV; 2， Restriction products; 3， Empty plasmid pMD19-T; M， DL 2000 plus DNA marker.圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Recombinant plasmid of pMD19-T-CSBV digested with restriction enzymes

2.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定

通過TA克隆將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，獲得pMD19-T-CSBV重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切及電泳后，檢測(cè)到兩個(gè)大小約為500 bp和2 600 bp條帶，與擴(kuò)增目的片段和pMD19-T質(zhì)粒片段長(zhǎng)度一致(圖2)，將酶切鑒定的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該方法擴(kuò)增的目的片段與NCBI公布的CSBV序列同源性最高為100%，表明該RT-PCR方法可準(zhǔn)確擴(kuò)增獲得目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)靈敏性試驗(yàn)。

2.1.3 靈敏度試驗(yàn)

以不同稀釋倍數(shù)的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，測(cè)試新建方法的靈敏性，結(jié)果顯示，當(dāng)模板濃度最高稀釋至1010倍，仍可擴(kuò)增出清晰的目的條帶，經(jīng)換算，此時(shí)模板質(zhì)粒的量為10 copies(圖3)，因此，該中囊病RT-PCR檢測(cè)方法的最低檢測(cè)量為10 copies·μL-1，質(zhì)量濃度為37 fg·mL-1。

1～11代表不同模板稀釋倍數(shù)。1，101；2，102；3，103；4，104；5，105；6，106；7，107；8，108；9，109；10，1010；11，1011；12，陰性對(duì)照；M，DL 1000 DNA marker。1-11 represented different dilution ratios of templates. 1， 101; 2， 102; 3， 103; 4， 104; 5， 105; 6， 106; 7， 107; 8， 108; 9， 109; 10， 1010; 11， 1011; 12， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.圖3 RT-PCR檢測(cè)方法靈敏性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of RT-PCR

2.1.4 特異性驗(yàn)證

利用已建立的中囊病RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法能夠特異性擴(kuò)增CSBV，產(chǎn)物大小約為500 bp；而以DWV、BQCV和IAPV的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，故該方法可特異性檢測(cè)中囊病病毒(圖4)。

2.1.5 重復(fù)性及可靠性驗(yàn)證

通過對(duì)CSBV陽(yáng)性和陰性樣品重復(fù)檢測(cè)3次，獲得的檢測(cè)結(jié)果一致，表明本文建立的中囊病RT-PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性；對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，經(jīng)NCBI的BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)6條序列與NCBI公布的部分結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列同源性均在98.3%以上，因此，該方法的可靠性高。

2.2 浙江省淳安縣中囊病流行病學(xué)調(diào)查

1～4代表不同模板。1，CSBV；2，DWV；3，BQCV；4，IAPV；5，陰性對(duì)照；M，DL 1000 DNA marker。1-4 represented different templates. 1， CSBV; 2， IAPV; 3， DWV; 4， BQCV; 5， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.圖4 RT-PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)Fig.4 Specificity test result of RT-PCR

2.2.1 檢測(cè)結(jié)果

通過上一步建立的中囊病RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)淳安縣環(huán)千島湖地區(qū)采集的307份工蜂樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示陽(yáng)性條帶清晰易分辨(圖5)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)總共有96份樣品呈陽(yáng)性，

1～11代表不同樣品；12，陰性對(duì)照；M，DL 1000 DNA marker。1-11 represented different samples; 12， Negative control; M， DL 1000 DNA marker.圖5 部分樣品的CSBV RT-PCR檢測(cè)電泳圖Fig.5 Gel profiles of some samples for CSBV detection by RT-PCR

經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，全部陽(yáng)性條帶均為CSBV，表明該方法臨床應(yīng)用效果好，且穩(wěn)定可靠。

2.2.2 中囊病流行病學(xué)分析

通過對(duì)淳安縣環(huán)千島湖地區(qū)的中蜂進(jìn)行中囊病流行病學(xué)調(diào)查研究，結(jié)果顯示：秋末冬初淳安縣主要蜜源為野桂花，在所有鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，臨岐鎮(zhèn)和屏門鄉(xiāng)的中蜂取樣點(diǎn)周圍存在意蜂蜂群，采集的樣品中總共有96群中蜂的CSBV檢測(cè)呈陽(yáng)性，病毒總檢出率為31.3%(表1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可知：17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，共有4個(gè)地方未檢出CSBV，分別為威坪鎮(zhèn)、鳩坑鄉(xiāng)、富文鄉(xiāng)和界首鄉(xiāng)，表明淳安縣約有76.5%的地方存在CSBV的感染；在13個(gè)感染CSBV的地方，共有6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)病毒檢出率達(dá)到50%以上，分別為安陽(yáng)鄉(xiāng)50%、臨岐鎮(zhèn)57%、里商鄉(xiāng)、浪川鄉(xiāng)、瑤山鄉(xiāng)和屏門鄉(xiāng)各60%。

表1中蜂樣品采集信息及檢測(cè)結(jié)果

Table1Information of collected samples and CSBV detection

序號(hào)No.采集鄉(xiāng)鎮(zhèn)Town是否有意蜂Apis mellifera蜂群(群)Colony陽(yáng)性數(shù)(群)Positive numberCSBV檢出率Positive rate/%1威坪鎮(zhèn) Weiping否 No100 02千島湖鎮(zhèn) Qiandao Lake否 No305 17.93金峰鄉(xiāng) Jinfeng否 No3010 34.64臨岐鎮(zhèn) Linqi是 Yes3017 56.75宋村鄉(xiāng) Songcun否 No201 5.06文昌鎮(zhèn) Wenchang否 No102 20.07安陽(yáng)鄉(xiāng) Anyang否 No105 50.08里商鄉(xiāng) Lishang否 No159 60.09鳩坑鄉(xiāng) Jiukeng否 No180 010富文鄉(xiāng) Fuwen否 No150 011浪川鄉(xiāng) Langchuan否 No106 60.012姜家鎮(zhèn) Jiangjia否 No208 40.013左口鄉(xiāng) Zuokou否 No153 20.014瑤山鄉(xiāng) Yaoshan否 No1911 60.015屏門鄉(xiāng) Pingmen是 Yes106 60.016楓樹嶺鎮(zhèn) Fengshuling否 No3012 40.017界首鄉(xiāng) Jieshou否 No150 0合計(jì) Total3079631.3

3 討論

中囊病以其潛伏期長(zhǎng)，傳播速度快等特點(diǎn)對(duì)我國(guó)中蜂產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了不同程度的危害[11-13]。該病害的病原CSBV，屬于小RNA病毒家族的小核糖核酸病毒科，具有編碼多結(jié)構(gòu)蛋白的開放閱讀框[10]，這種RNA病毒具有極高的突變率。選擇病毒基因組序列的保守區(qū)域進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)方法的建立，對(duì)于準(zhǔn)確診斷病害具有重要的指導(dǎo)作用[14]。本文以浙江省CSBV基因組序列為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)方法的建立，通過試驗(yàn)驗(yàn)證了該方法具有較高的靈敏性、特異性、重復(fù)性及可靠性。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本方法擴(kuò)增獲得的特異性片段包含了馬鳴瀟等[6]報(bào)道的檢測(cè)方法所擴(kuò)增的片段，檢測(cè)DNA的濃度最低為37 fg·mL-1(圖3)，顯著低于之前方法中最低10 pg的DNA檢出量。因此，新方法的建立提高了CSBV的檢測(cè)靈敏性，為中囊病的準(zhǔn)確診斷提供了新的技術(shù)支持。

開發(fā)蜜蜂病害快速診斷方法、科學(xué)調(diào)查不同地域病害發(fā)生和發(fā)展動(dòng)態(tài)，可為合理制定蜜蜂病害防控措施提供科學(xué)依據(jù)；其中，調(diào)查對(duì)象的合理選擇是病害流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，中囊病病毒在成年工蜂中的潛伏期很長(zhǎng)，可終身帶毒，影響工蜂的采食行為和蜂群健康[15]；如果發(fā)現(xiàn)蜂群表現(xiàn)中囊病的典型癥狀，則表明蜂群已嚴(yán)重患病，生產(chǎn)中則錯(cuò)過了最佳干預(yù)時(shí)機(jī)[16]，另外，當(dāng)蜂群內(nèi)的病毒累積到一定程度時(shí)，群勢(shì)減弱或氣候改變等因素均可引起中囊病的大暴發(fā)，造成不可挽回的損失。因此，除了通過幼蟲表型癥狀診斷外，開展成蜂、蜂群隱性感染的診斷也十分重要，特別是表面健康工蜂攜帶的病毒量對(duì)于病害暴發(fā)的預(yù)警具有重要意義。本文在建立中囊病RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，調(diào)查對(duì)象選擇表面健康的成年工蜂，開展了淳安縣環(huán)千島湖地區(qū)中囊病的流行病學(xué)調(diào)查，明確了CSBV在該地區(qū)中蜂蜂群內(nèi)的傳播和攜帶情況，為提早制定中囊病的防控措施提供依據(jù)。

中囊病的暴發(fā)與氣候、蜜源等因素都有密切聯(lián)系。通常情況下，中囊病一年四季都有可能發(fā)生，但由于氣候、溫度和群勢(shì)變化等因素影響，幼蟲在每年的初春和秋末冬初發(fā)病率較高[17]。每年11月到12月，隨著氣溫逐漸降低，此時(shí)正是南方中囊病較易發(fā)生的時(shí)期，因此，本研究選擇這個(gè)時(shí)間開展淳安縣中囊病的流行病學(xué)調(diào)查，可以更好地評(píng)估該地CSBV的感染情況。本次調(diào)查結(jié)果顯示，淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中有13個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均檢測(cè)到CSBV，說明該病毒在此地區(qū)的中蜂蜂群內(nèi)普遍存在，應(yīng)引起重視。根據(jù)取樣點(diǎn)周圍情況分析發(fā)現(xiàn)，CSBV檢出率較高的地點(diǎn)均為淳安縣中蜂養(yǎng)殖集中區(qū)，如金峰鄉(xiāng)、臨岐鎮(zhèn)等；另外，4個(gè)未檢出CSBV的地方可能與其所處地理位置有關(guān)，如界首鄉(xiāng)采樣點(diǎn)位于湖中小島，而鳩坑鄉(xiāng)采樣點(diǎn)位于340 m海拔山峰，優(yōu)越的地理隔離條件為蜂群提供了良好的生物安全防護(hù)。

在蜜蜂飼養(yǎng)中，意蜂對(duì)中蜂的影響也不容忽視。據(jù)劉榮平等[18]報(bào)道，淳安縣不但分布大量中蜂蜂群，還存在意蜂的放養(yǎng)，該地的意蜂主要分布區(qū)為臨岐鎮(zhèn)、屏門鄉(xiāng)、左口鄉(xiāng)、文昌鎮(zhèn)等，其中，臨岐鎮(zhèn)、屏門鄉(xiāng)存在意蜂的情況與本次調(diào)查結(jié)果一致(表1)，其余兩個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)未調(diào)查到意蜂放養(yǎng)的情況，這可能與蜂群轉(zhuǎn)地有關(guān)。通過統(tǒng)計(jì)分析，有意蜂分布的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，中蜂的CSBV檢出率均呈陽(yáng)性，尤其是蜂群密集的臨岐鎮(zhèn)和屏門鄉(xiāng)，CSBV檢出率均超過了50%。如上所述，中蜂飼養(yǎng)生產(chǎn)中應(yīng)控制蜂群飼養(yǎng)密度，提高中蜂飼養(yǎng)技術(shù)，及時(shí)了解蜂場(chǎng)周圍的意蜂放養(yǎng)狀況，減少意蜂對(duì)中蜂的不利影響，積極推進(jìn)中蜂保護(hù)區(qū)的建設(shè)，促進(jìn)當(dāng)?shù)刂蟹滹曫B(yǎng)業(yè)的健康發(fā)展。

本研究建立了中囊病RT-PCR檢測(cè)方法，提高了該檢測(cè)方法的靈敏性，再利用新方法對(duì)浙江省淳安縣環(huán)千島湖地區(qū)的中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)進(jìn)行了中囊病的流行病學(xué)調(diào)查，明確了秋末季節(jié)CSBV在該地區(qū)中蜂蜂群中的感染情況，為進(jìn)一步采取病害防控措施提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，本研究只在一個(gè)時(shí)期對(duì)淳安縣進(jìn)行了中囊病的普查，為了保障此區(qū)域中蜂養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，周年監(jiān)測(cè)該地區(qū)中囊病動(dòng)態(tài)變化的研究仍有待深入開展。

致謝：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所李繼蓮博士贈(zèng)送中蜂其他病毒陽(yáng)性樣品用于本文特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃家興博士審閱論文并提出修改建議，淳安縣17個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)中蜂飼養(yǎng)點(diǎn)的養(yǎng)蜂師傅在野外調(diào)查中給予大力支持，在此一并表示感謝!