鄭 玲,張歡歡,張延召

(洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471000)

在自然界中，高等植物的信號轉(zhuǎn)導、形態(tài)建成、抗逆反應以及生長發(fā)育等生命活動都離不開轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[1]。Squamosa啟動子結(jié)合蛋白(Squamosa promoter binding protein,SBP)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[2]。SBP蛋白中包含一段非常保守的DNA結(jié)構(gòu)域，大約編碼79個氨基酸殘基，被稱為SBP結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點是含有2個鋅指結(jié)構(gòu)[即C3H(C-C-C-H)、C2HC(C-C-H-C)]和雙向核定位信號(Nuclear localization signal,NLS)[3]。SBP結(jié)構(gòu)域的C端為核定位信號區(qū)域,可引導SBP蛋白進入細胞核行使功能。

到目前為止，在擬南芥中共鑒定到16個SBP基因家族成員，它們在擬南芥的種子形成、枝條發(fā)育、花發(fā)育、葉原基間隔期形成、營養(yǎng)與生殖階段的轉(zhuǎn)變、葉片發(fā)育、可育性、植物激素信號轉(zhuǎn)導等多個方面發(fā)揮著重要作用。此外，關(guān)于不同植物中SBP基因功能的研究也越來越多。玉米中LG1(Liguleless1)基因編碼SBP轉(zhuǎn)錄因子，缺失該基因的突變體沒有形成舌葉和葉耳[4]。KROPAT等[5]發(fā)現(xiàn)，非種子植物衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中的銅應答調(diào)控子1(Copper response regulator 1,CRR1)基因編碼的蛋白質(zhì)包含SBP結(jié)構(gòu)域，從而能夠識別GTAC的核心基序。擬南芥SBP8和SBP14基因分別與調(diào)控花粉發(fā)育和真菌毒素FB1誘導的程序性死亡的抗性相關(guān)[6],水稻基因組SBP轉(zhuǎn)錄因子主要在花和愈傷組織中表達[7]。番茄SBP基因(LeSPL-CNR)是控制果實發(fā)育的關(guān)鍵基因[8]。目前，關(guān)于棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定和分析尚未見報道。鑒于此，采用生物信息學方法鑒定棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并對其進行染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化樹及表達模式的分析，為進一步研究棉花SBP家族基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

棉花SBP家族的基因序列、蛋白質(zhì)序列、編碼區(qū)序列(CDS)和擬南芥SBP蛋白序列來源于NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)、Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)、PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/family)三大數(shù)據(jù)庫。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定 利用NCBI的本地BLAST軟件構(gòu)建棉花全基因組序列蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。在Pfam網(wǎng)站下載SBP結(jié)構(gòu)域的HMM模型文件PF03110，以此蛋白質(zhì)序列為Query，對棉花基因組數(shù)據(jù)庫進行本地BLAST搜索。將獲得的結(jié)果與從PlantTFDB、Phytozome數(shù)據(jù)庫下載的棉花SBP家族基因的蛋白質(zhì)序列進行對比整合。隨后將整合得到的序列在Interpro上進行驗證，確定是否存在SBP結(jié)構(gòu)域，從而鑒定出所有的棉花SBP蛋白序列。

1.2.2 棉花SBP家族成員的特性分析和進化分析 在Phytozome數(shù)據(jù)庫中獲得棉花SBP蛋白的基本性質(zhì)，如等電點、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、平均親水系數(shù)等。利用ClustalX軟件將棉花SBP家族各成員的結(jié)構(gòu)域進行多序列比對。為了便于分析結(jié)果，通過GeneDoc軟件著色，并標注灰度，保存圖片。

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫下載擬南芥SBP家族的蛋白質(zhì)序列，將其與棉花SBP家族的蛋白質(zhì)序列整合在1個fas文件里，利用軟件MAGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用棉花全基因組的CDS序列和基因組序列確定棉花SBP基因在染色體上的位置，用MapInspect軟件繪制基因的染色體定位圖。利用GSDS在線系統(tǒng)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析棉花SBP基因的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)。

1.2.3 棉花SBP基因在棉花不同組織中的表達分析 以棉花SBP基因的CDS序列作為Query，在NCBI棉花EST數(shù)據(jù)庫中通過BLAST搜索，得到棉花SBP基因在不同組織中表達的信息并進行列表，明確棉花SBP基因的轉(zhuǎn)錄表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定和分析

共鑒定出83個棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，依據(jù)基因在染色體上所處的位置信息對棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員進行命名(棉花Gossypiumhirsutum的縮寫是Gh)，具體如表1所示。從表1可見，棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的氨基酸數(shù)量介于85～1 083個，分子質(zhì)量9.28～119.88 ku，等電點(5.86～10.85)變化范圍較小。大部分成員的等電點均在堿性范圍內(nèi)，說明這些蛋白質(zhì)含有很多的堿性氨基酸。所有SBP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)平均親水系數(shù)全為負值，表明此家族成員全部為疏水性蛋白質(zhì)。而GhSBP19和GhSBP78蛋白的平均親水系數(shù)很低，分別為-1.322、-1.348，說明這2類蛋白質(zhì)疏水性較強。

表1 GhSBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員特征Tab.1 Characteristics of SBP transcription factor family in G.hirsutum

續(xù)表1 GhSBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員特征Tab.1(Continued) Characteristics of SBP transcription factor family in G.hirsutum

續(xù)表1 GhSBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員特征Tab.1(Continued) Characteristics of SBP transcription factor family in G.hirsutum

注：N/A表示暫無錄登號。

Note: N/A means no login number.

2.2 棉花SBP家族成員的結(jié)構(gòu)域分析

對83個棉花SBP蛋白的保守SBP結(jié)構(gòu)域進行多重序列比對，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，大部分棉花SBP蛋白的SBP結(jié)構(gòu)域均包含74個氨基酸殘基，且具有2個鋅指結(jié)構(gòu),分別為C3H和C2HC類型,即Zn1和Zn2;其中,GhSBP62、GhSBP48、GhSBP44只含有Zn1結(jié)構(gòu)而缺失Zn2結(jié)構(gòu);另外，除了GhSBP62、GhSBP48、GhSBP37、GhSBP44,其他轉(zhuǎn)錄因子在SBP保守結(jié)構(gòu)域的C端都有1個NLS位點。

大部分棉花SBP蛋白(不包括GhSBP81/61/60)第1位點的C(半胱氨酸)、第16個位點的Y(酪氨酸)高度保守。除GhSBP62/48/37/44之外，其他SBP蛋白在第65位點的L(亮氨酸)、68位點的H(組氨酸)和69位點的N(天冬酰胺)均高度保守。第15位點的D(天冬氨酸)在GhSBP2/31/68/7/66等蛋白質(zhì)中也較為保守。

2.3 擬南芥與棉花SBP 轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2顯示，GhSBP2、GhSBP68、GhSBP31和AtSBP15、AtSBP3來自于同一個進化分支；GhSBP82、GhSBP50、GhSBP20、GhSBP45、GhSBP60、GhSBP15與AtSBP28、AtSBP29、AtSBP30來源于同一個進化分支。處于同一分支的轉(zhuǎn)錄因子同源性較高。

此外，在物種內(nèi)還發(fā)現(xiàn)較多的SBP轉(zhuǎn)錄因子基因旁系同源基因，如GhSBP68和GhSBP31、GhSBP40和GhSBP8、GhSBP21和GhSBP51、GhSBP16和GhSBP46等，表明在SBP基因家族中，大量SBP轉(zhuǎn)錄因子基因在物種內(nèi)以同源基因的形式存在。

根據(jù)擬南芥SBP家族分類原則[9]，將棉花和擬南芥的SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ共8個亞族，大部分亞族同時包含了棉花和擬南芥的SBP轉(zhuǎn)錄因子，推測在棉花和擬南芥這2個物種分化之前，SBP轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)發(fā)生了分化。在第Ⅲ亞族中，棉花有13個SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，而擬南芥只有1個，表明從棉花形成之后，該亞家族內(nèi)部SBP轉(zhuǎn)錄因子可能被復制了很多次。在第Ⅳ亞族內(nèi)部，棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員數(shù)目是擬南芥的4.5倍。在第Ⅲ亞族中，棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員數(shù)目是擬南芥的13倍。棉花和擬南芥SBP轉(zhuǎn)錄因子在這2個亞族中數(shù)量變化差異較大，推測在棉花和擬南芥分化以后，各個亞族也發(fā)生了不同的進化事件。

圖1 棉花SBP蛋白結(jié)構(gòu)域的多重序列比對Fig.1 Conserved domain analysis of SBP family proteins in G.hirsutum

圖2 棉花與擬南芥SBP轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of SBP transcription factors in G. hirsutum and A. thaliana

2.4 GhSBP基因的表達模式分析

由表2可見，有40個GhSBP基因在棉花的分生組織、莖、花、花芽、花藥以及棉纖維中轉(zhuǎn)錄表達，它們在根、葉和種子中都不表達。而GhSBP52只在幼期胚珠中表達，推測該基因可能只參與調(diào)控幼期胚珠的生長發(fā)育過程。GhSBP49和GhSBP51不僅在幼期胚珠中表達，還在棉纖維中表達，推測這2個基因可能共同調(diào)控了幼期胚珠和棉纖維的生長發(fā)育。此外，還發(fā)現(xiàn)GhSBP2、GhSBP4、GhSBP6等20多個基因在花藥和棉纖維中均有表達，推測花藥和棉纖維的生長發(fā)育由這些基因共同調(diào)控。9個GhSBP基因(GhSBP7/19/27/30/36/53/57/66/81)在分生組織、莖、花和花芽4個部位均有表達，表明這些基因可能同時調(diào)控分生組織的分化、莖的發(fā)育以及花的形成。

表2 GhSBP基因家族在棉花組織中的表達模式Tab.2 Expression pattern of GhSBP genes in different tissues of G.hirsutum

續(xù)表2 GhSBP基因家族在棉花組織中的表達模式Tab.2(Continued) Expression pattern of GhSBP genes in different tissues of G.hirsutum

注：+為SBP基因有表達；-為SBP基因沒有表達。

Note: + means expression ofSBPgenes; -means no expression ofSBPgenes.

結(jié)合進化樹亞族分類進行分析。第Ⅷ亞族內(nèi)部成員(GhSBP19/48/78)和第Ⅶ亞族成員(GhSBP6/35/49/18/83)在棉花的分生組織、莖、花、花芽、花藥以及棉纖維中各有表達，表明這2個亞族和棉花的生長發(fā)育過程密切相關(guān)。第Ⅷ亞族成員(GhSBP19/48)在莖中均有表達，推測該亞族和莖的發(fā)育有聯(lián)系。第Ⅶ亞族成員(GhSBP6/35/18/83)在花藥與纖維中均有表達，推測這個亞族與花藥、棉纖維的生長發(fā)育關(guān)系密切。

2.5 GhSBP基因在染色體上的定位

由圖3可知，83個GhSBP基因在1—8號染色體以及11—13號染色體上成簇分布。8號染色體以及12號染色體上的基因集中分布在染色體的一端，而3、7、11這3條染色體上的基因則主要分布在染色體的兩端。1號和3號染色體上都分布了5個基因，2號染色體上分布的基因數(shù)量最多，高達13個，4號和6號染色體上均有2個基因，5號染色體上則有12個基因，7號和8號染色體上分布了10個基因，11號染色體上分布了6個基因，12號染色體上則分布了7個基因，13號染色體上的基因數(shù)量也較多，為11個。

圖3 GhSBP基因在棉花染色體上的分布Fig.3 Distribution of GhSBP genes on Chromosome of G.hirsutum

2.6 GhSBP基因結(jié)構(gòu)分析

利用在Phytozome數(shù)據(jù)庫中下載的棉花SBP的基因序列和cDNA、CDS序列，構(gòu)建出SBP家族基因結(jié)構(gòu)圖(圖4)。結(jié)果顯示，除了GhSBP37和GhSBP75之外，其他基因序列均含有內(nèi)含子，且內(nèi)含子數(shù)目不等。棉花SBP家族各組成員所含內(nèi)含子數(shù)目差異也較大，最多9個，最少1個。其中含有9個內(nèi)含子的基因成員占整個基因家族的24.10%。

基于棉花SBP蛋白序列構(gòu)建的進化樹，將棉花83個SBP成員分為12個亞族(圖4)，亞族間基因結(jié)構(gòu)差異較大，序列長度長短不一。各亞族內(nèi)部成員的序列長短相似，內(nèi)含子數(shù)目也差別不大。如第1、7、9亞族各成員內(nèi)含子數(shù)目都是1個；第2、3、5亞族各成員內(nèi)含子數(shù)目都是2個；第6亞族(除GhSBP75外)各成員內(nèi)含子數(shù)目都是3個；第10、11、12亞族成員內(nèi)含子數(shù)目則是9個；第8亞族各成員內(nèi)含子數(shù)目為1～3個，GhSBP25和GhSBP55都含有1個內(nèi)含子，而GhSBP50含有3個內(nèi)含子，其余成員都含有2個內(nèi)含子，第4亞族除GhSBP37沒有內(nèi)含子之外，其余成員均含有2個內(nèi)含子。

3 結(jié)論與討論

棉花是世界上最重要的纖維作物之一。陸地棉遺傳標準系TM-1全基因組序列測序工作的完成[10]，為棉花基因功能的研究提供了基礎(chǔ)[11]。本研究通過生物信息學的方法鑒定了棉花SBP家族的成員，通過蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、保守域分析、進化樹構(gòu)建、染色體定位等了解其成員特點,并定性分析了其在棉花各組織中的表達，這些對研究棉花SBP基因家族成員的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

擬南芥與棉花的SBP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，擬南芥SBP家族成員與棉花SBP家族成員部分基因同源性很強。根據(jù)進化樹將SBP轉(zhuǎn)錄因子分為8個亞族，棉花和擬南芥SBP轉(zhuǎn)錄因子在不同亞族中數(shù)量差異較大，推測在棉花和擬南芥分化以后各亞族可能發(fā)生了不同的進化事件。棉花GhSBP基因分布在1—8號染色體和11—13號染色體上，且都成群分布。棉花GhSBP基因家族中，除了GhSBP37和GhSBP75，其余81個基因全部含有內(nèi)含子，各亞族成員所含內(nèi)含子數(shù)目較為穩(wěn)定。

SBP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的C端是核定位信號區(qū)域。本研究在分析SBP保守結(jié)構(gòu)域時發(fā)現(xiàn),棉花SBP蛋白的結(jié)構(gòu)域包含約79個氨基酸殘基并具備2個鋅指結(jié)構(gòu),分別為C3H (C-C-C-H)和C2HC(C-C-H-C)類型。另外,大部分轉(zhuǎn)錄因子在SBP保守結(jié)構(gòu)域的C端都有1個NLS位點。

定性分析結(jié)果表明，有40個GhSBP基因在棉花的分生組織、花、花芽、花藥以及棉纖維中都有廣泛表達。大部分GhSBP基因主要在花藥以及棉纖維中表達，這些基因可能對花器官的形成和纖維發(fā)育過程有著重要影響。還有小部分GhSBP基因(GhSBP7/19/27/30/36/53/57/66/81)在分生組織、莖、花和花芽中都有表達，表明這些基因可能參與調(diào)控分生組織的分化、莖的發(fā)育以及花的形成等過程。第Ⅷ亞族成員GhSBP19/48在莖中均有表達，由此猜測這2個基因與莖的發(fā)育相關(guān)。第Ⅶ亞族成員GhSBP6/35/18/83在花藥與棉纖維中均有表達，推測它們可能對花藥與棉纖維的生長發(fā)育有重要影響。定性分析棉花SBP轉(zhuǎn)錄因子在棉花生長發(fā)育中的作用，對于棉花SBP基因的功能研究具有重要意義，并為研究棉纖維(具有經(jīng)濟價值)的調(diào)控機制提供了一定的理論依據(jù)。

圖4 GhSBP家族系統(tǒng)進化樹與基因結(jié)構(gòu)Fig.4 Phylogenetic tree and gene structure of GhSBP family