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(九仙尊霍山石斛股份有限公司,上海 201199)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseCZ. Tang et S.J. Cheng)是蘭科石斛屬多年生草本植物,又稱“米斛”,其莖入藥,是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中的一種名貴中藥材,產(chǎn)于安徽大別山的霍山及臨近地區(qū)[1]。藥用石斛種類繁多,但功效差別很大,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為霍山石斛是最道地、最為珍貴的石斛品種[2-4]。清代趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》中明確、詳盡地闡釋了霍山石斛:“……系出六安州及穎州府霍山縣,名霍山石斛,最佳。形短只寸許,形如累米,嚼之微有漿、黏齒,有解暑醒脾,止渴利水,益人力氣的功效……”。這充分揭示了六安石斛與霍山石斛一脈相承的密切關(guān)系[5-6]?，F(xiàn)代研究亦表明,霍山石斛植株矮小,長(zhǎng)3～9 cm,莖直立由下向上逐漸變細(xì),呈圓錐狀,形似米粒,花呈淡黃綠色,明顯區(qū)別于鐵皮石斛、細(xì)莖石斛及其它石斛,具有獨(dú)特的地理分布、形態(tài)特征、遺傳結(jié)構(gòu)及藥理活性[7-8]。

目前,香菇多糖、灰樹花多糖、肝素、云芝糖肽及硫酸酯多糖等多糖藥物和保健品,已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究和開發(fā)的熱點(diǎn),被廣泛用于腫瘤、糖尿病、艾滋病、血栓等疾病的治療和防治[9]。現(xiàn)代藥理和化學(xué)成分分析表明,霍山石斛中主要的活性成分是多糖類化合物,具有提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、保肝護(hù)胃及抗白內(nèi)障等作用,其理化及結(jié)構(gòu)特征與藥用活性密切相關(guān)[10-11]。從上個(gè)世紀(jì)五十年代開始,研究者相繼對(duì)霍山石斛多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)解析及功能活性等方面做了大量研究,并取得了一定的成果[12]。本文在查閱收集大量文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,系統(tǒng)整理與歸納霍山石斛多糖的研究現(xiàn)狀,對(duì)多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)特征、生物活性及消化吸收進(jìn)行綜述,并對(duì)相關(guān)專利及產(chǎn)品開發(fā)進(jìn)行分析,為霍山石斛資源開發(fā)利用,保健食品、藥品開發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

1 霍山石斛多糖的提取、分離純化

目前,霍山石斛的研究原料主要包括類原球莖、栽培莖和野生植株3類,在此基礎(chǔ)上對(duì)不同原材料中霍山石斛多糖提取、分離純化工藝及多糖含量變化規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1.1 霍山石斛原材料對(duì)多糖含量的影響

霍山石斛多糖含量與原材料、生長(zhǎng)條件和提取方法等相關(guān),不同器官組織、生長(zhǎng)期、采收時(shí)期及不同種源植株中多糖含量差異顯著[13-15]。在霍山石斛的道地產(chǎn)區(qū),仿野生栽培的霍山石斛,已逐漸替代野生石斛成為藥用霍山石斛的主要來源,實(shí)現(xiàn)了從試管苗或人工誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生實(shí)生苗的大規(guī)模生產(chǎn)[16]。魏剛等[17]比較研究10批栽培的霍山石斛樣品的HPLC指紋圖譜,表明栽培的霍山石斛具有比較穩(wěn)定的HPLC特征圖譜,其質(zhì)量穩(wěn)定,研究還分析了1批野生霍山石斛與栽培霍山石斛特征圖譜,相似度為0.839,主要特征峰基本一致,表明栽培成功可行。金海英等[18]根據(jù)石斛苗的生長(zhǎng)周期,將霍山石斛分為石斛原球莖、石斛小苗、石斛中苗、石斛大苗和石斛馴化苗5個(gè)階段(周期約18個(gè)月),在組培過程中,石斛的多糖含量在相對(duì)較低的水平上穩(wěn)步增長(zhǎng)(4.7%～14%),且霍山石斛在栽培2年后多糖含量達(dá)到最高35.74%(共4年)。而陳程等[19]的研究表明,霍山石斛組培過程中(類原球莖、類原球莖芽、一節(jié)苗、多節(jié)苗和栽培苗)多糖的單糖組成比例上略有差異,但在多糖含量、多糖組分、化學(xué)特性等理化性質(zhì)和免疫活性方面無顯著差異,具有相似的促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的作用,表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。陳乃東等[20]對(duì)1～4年株齡的組培霍山石斛、野生霍山石斛及河南石斛的多糖和乙醇溶出物動(dòng)態(tài)積累規(guī)律進(jìn)行研究,結(jié)果亦表明,以多糖和醇溶出物總量計(jì),組培的霍山石斛以栽培2年采收為宜(合計(jì)4～5年),野生霍山石斛及河南石斛以3年株齡的品質(zhì)最佳。陳乃東等[21]對(duì)組培的霍山石斛和野生的霍山石斛的單糖組成分析表明,兩者均含有6種單糖:木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和核糖,但單糖比例差異顯著。同時(shí),錢明雪[15]研究了霍山石斛(栽培苗)多糖的生化特性與季節(jié)性變化規(guī)律,整體上,多糖含量和粘度呈現(xiàn)出冬季高于夏季的趨勢(shì),1月份多糖含量最高(40.107 g/100 g干重),8月份多糖含量最低(20.093 g/100 g干重);同時(shí),不同季節(jié)的多糖均具有調(diào)節(jié)腸黏膜免疫的活性,從當(dāng)年11月至次年4月的霍山石斛多糖的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性整體上高于采自5～10月霍山石斛的多糖?？傮w上來看,當(dāng)以霍山石斛多糖含量及生化特性為采收標(biāo)準(zhǔn)時(shí),霍山石斛的最佳種植年限為4～5年,最佳的采收時(shí)期為當(dāng)年的11月至翌年的4月。對(duì)不同原料及生長(zhǎng)發(fā)育過程中主要活性成分多糖的變化規(guī)律進(jìn)行研究,有助于后期多糖的分離純化和藥材的合理開發(fā)利用。

1.2 霍山石斛多糖的提取

目前,霍山石斛多糖的提取制備多采用水提醇沉、酶法輔助提取、微波和超聲波輔助提取等方法。在傳統(tǒng)水提醇沉工藝中,黃森等[22]利用Box-Behnken法對(duì)霍山石斛類原球莖中活性多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,得到其最佳工藝條件為:提取溫度69.4 ℃,pH5.9,料液比1∶20,提取次數(shù)2次,提取時(shí)間1.57 h,霍山石斛多糖提取率最高,達(dá)到0.1821 g/g。進(jìn)一步研究表明,DEAE-52樹脂脫色效果較佳,脫色率達(dá)到65.47%。張煒玲等[23]采用響應(yīng)面法優(yōu)化霍山石斛多糖的提取工藝,最佳提取工藝條件為:料液比為1∶340 (g/mL),提取時(shí)間3.25 h,沉淀多糖的乙醇濃度86%,在此條件下霍山石斛多糖的提取率達(dá)到38.78%。Xian等[24]利用微波輔助提取霍山石斛多糖工藝,最優(yōu)工藝條件為提取4次,每次40 min,微波功率550 W,多糖得率達(dá)到19.1%,并證實(shí)提取次數(shù)對(duì)多糖得率影響顯著。秦霞等[25]利用超聲波輔助法提取霍山石斛多糖,多糖得率達(dá)到28.02%,其最佳提取條件為料液比1∶10 (g/mL)、提取時(shí)間30 min、超聲功率250 W。劉艷艷等[26]利用超聲波輔助法提取霍山石斛多糖,在此最優(yōu)優(yōu)化條件下多糖平均得率是傳統(tǒng)熱水浸提工藝的1.70倍,同時(shí)超聲波輔助提取工藝所得霍山石斛多糖的還原力和ABTS自由基清除率均優(yōu)于熱水浸提的多糖。魏明等[27]利用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取霍山石斛多糖,最佳提取工藝條件為料液比1∶40 (g/mL)、纖維素酶500 U/g、酶解溫度40 ℃,酶解時(shí)間3 h,超聲波功率為300 W,超聲時(shí)間6 min,此時(shí)多糖提取量達(dá)到0.283 g/g。另外,劉石泉等[28]以疏花石斛為原料對(duì)4種提取工藝(傳統(tǒng)水浸提法、纖維素酶法、超聲輔助法和微波輔助法)進(jìn)行比較,確定纖維素酶法提取多糖得率最高(11.84%),是多糖提取時(shí)的首選方案,而傳統(tǒng)水浸提法(9.75%)宜結(jié)合超聲輔助法(10.78%)和微波輔助法(9.91%)從而提高多糖得率。需要注意的是,酶法提取多糖雖提高提取率且條件也比較溫和,但采用纖維素酶會(huì)降解O-乙酰-β-D-1,4-葡甘露聚糖,在鐵皮石斛、霍山石斛及細(xì)莖石斛中均發(fā)現(xiàn)有此類多糖[29]。同時(shí)采用超聲波和微波輔助提取可顯著的縮短提取時(shí)間,但多糖經(jīng)過超聲或微波處理后其糖鍵可能會(huì)發(fā)生斷裂等不利影響[29]?；羯绞嗵堑奶崛》椒ㄐ枰Y(jié)合多糖的結(jié)構(gòu)特征和生物活性作更進(jìn)一步的綜合分析,從而根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的提取方法。

1.3 霍山石斛多糖的分離純化

多糖的純度會(huì)影響其生物活性,獲得高純度的多糖是將其應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域不可或缺、至關(guān)重要的一步。如需要確證單一多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)或混合多糖中每一個(gè)多糖的單糖組成及其摩爾比,其純度必須在95%以上,因而多糖的分離純化及純度檢測(cè)顯的非常重要。

霍山石斛多糖的分離純化過程主要包括分離純化(脫色、除蛋白及低聚糖等雜質(zhì))和純度鑒定。黃森[30]對(duì)2種脫蛋白方法和4種脫色方法進(jìn)行比較研究,Sevag法脫蛋白效果(84.73%)優(yōu)于三氯乙酸(TCA)法(82.99%),且Sevag法多糖總量保持較好。同時(shí)比較酒精、H2O2、活性炭和DEAE-纖維素法的脫色效果,其中二乙氨乙基(DEAE)-纖維素法脫色率最高(65.47%),多糖損失率較小(31.73%)。王琳煒等[31]以霍山鐵皮石斛為原料,比較Sevag法、酶法(胰蛋白酶)及酶法-Sevag法對(duì)多糖脫蛋白效果及多糖損失率的影響,結(jié)果表明,酶法-Sevag法聯(lián)用,蛋白脫除率最高(81.58%),且多糖的損失率低(15.63%)。而Sevag法消耗試劑大,多糖損失率較高(32.72%),且酶法蛋白脫除率低(71.88%)。

Zha等[32]最早采用DEAE-纖維素離子交換色譜、Sephacryl S-200、Sephadex G-75和Sephadex G-100等凝膠滲透色譜分離方法,從霍山石斛類原球莖的水溶性多糖中首次分離到一種分子量為22 kDa的均一性多糖HPS-1B23。潘利華等[33]利用DEAE-纖維素離子交換樹脂、Sephacryl S-200從組培霍山石斛莖中分離純化,得到單一多糖組分DHP-W2。Hsieh等[34]利用DEAE-cellulose和Sephacryl S-200從霍山石斛葉和莖的黏液中分離得到一種分子量為9.7×103Da的多糖。蔣玉蘭[35]利用DEAE-52和Sephacryl S-200從霍山石斛中分離得到一個(gè)大分子多糖組分DHP-W4,分子量為1.2×106Da。由上可以看出,霍山石斛多糖的分離純化過程中宜采用DEAE-纖維素法脫色和酶法-Sevag法聯(lián)用去除蛋白質(zhì),而制備霍山石斛均一多糖主要采用離子交換色譜、凝膠滲透色譜等柱層析方法。值得注意的是,柱層析方法耗時(shí)多、產(chǎn)量低,不能滿足工業(yè)化大生產(chǎn),需要更加高效的分離純化方法,其中分級(jí)醇沉、鹽析及超濾等對(duì)霍山石斛多糖的影響有待進(jìn)一步確證。

2 霍山石斛多糖的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征

霍山石斛多糖的分子量分布、單糖組成、空間結(jié)構(gòu)及糖苷鍵的連接方式具有明顯特征,多糖的結(jié)構(gòu)與其功效的表達(dá)有密不可分的聯(lián)系。通過比較發(fā)現(xiàn)(表1),霍山石斛多糖主要由葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)及少量的阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)和木糖(Xyl)組成(以葡萄糖為主,葡萄糖:甘露糖>2∶1),推測(cè)確定霍山石斛多糖主要是一類O-乙酰葡萄甘露聚糖,廣泛存在(1→4)-α-D-Glcp、(1→6)-α-D-Glcp、(1→6)-β-D-Glcp、(1→4)-β-D-Glcp、(1→3,6)-β-Manp、(1→4)-β-Manp、(1→3,6)-α-D-Manp等糖苷鍵連接方式。但其分子量、單糖組成、連接位置及順序存在較大差異,這可能是由霍山石斛生長(zhǎng)環(huán)境、提取純化等的不同引起的。Zha等[32]首次從從霍山石斛中成功分離出HPS-1B23,該多糖為α-吡喃構(gòu)型,平均分子量為2.2×104Da,由葡萄糖、甘露糖、半乳糖按31∶10∶8的摩爾比組成,具有增強(qiáng)免疫力的功效。肖婧婧[37]從霍山石斛類原球莖中分離純化到一大分子均一多糖DHPD2,分子量8.09×106Da,主要由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖組成,其摩爾比為0.896∶0.723∶0.2∶0.072∶0.031∶0.028。Li等[38]從霍山石斛類原球莖的粗多糖中分離純化得到一種相對(duì)分子質(zhì)量為2.32×105Da單一多糖DHP-4A,單糖組成分析表明,DHPD-4A由葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖構(gòu)成,摩爾比為13.8∶3.0∶6.1∶2.1。馮寶軍[39]從霍山石斛中分離純化到一分子量為7.3×104Da的多糖組分DHP-W2,主要由葡萄糖、木糖和半乳糖按1.1∶1.0∶0.5的分子摩爾比以及少量的半乳糖醛酸組成。Tian等[40]采用Sephadex G-100凝膠層析對(duì)霍山石斛中性多糖(DHP1)進(jìn)一步分離純化,得到DHP1A和DHP1B兩種多糖片段,相對(duì)分子質(zhì)量分別為6.7、3.51 kDa。DHP1A主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成,其摩爾比為16∶2.5∶1,DHP1B主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成,其摩爾比為10.55∶1.00∶0.21。這些與文獻(xiàn)報(bào)道[41]的鐵皮石斛多糖結(jié)構(gòu)特征差異顯著,鐵皮石斛多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等單糖組成(甘露糖占主要),廣泛存在(1→4)-β-D-Glcp、(1→4)-α-D-Glcp、(1→6)-α-D-Glcp、(1→4)-β-D-Manp等糖苷鍵連接方式,同時(shí)與香菇多糖(抗腫瘤)、猴頭菌多糖(保肝護(hù)胃)和靈芝多糖(抗腫瘤)以β-1,3、β-1,3,6為主的葡聚糖差異顯著[42-44]。綜合上述研究可以看出,不同種源、品種及提取純化方法得到的霍山石斛多糖的理化性質(zhì)相差較大,目前分離純化到的多糖的分子量主要集中在幾萬,大分子量的均一多糖仍報(bào)道較少,需進(jìn)一步深入研究。

表1 霍山石斛多糖的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征Table 1 Physicochemical properties and structural features of polysaccharides from Dendrobium huoshanense

3 霍山石斛多糖的生物活性

霍山石斛具有廣泛的藥理作用,是一種無毒、安全的保健食品原料?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明:霍山石斛多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、保肝護(hù)胃和抗白內(nèi)障等多種生物活性。

3.1 促進(jìn)細(xì)胞健康

3.1.1 抗腫瘤 霍山石斛多糖可通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)而起到抗腫瘤作用,鮑麗娟等[45]比較了霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛和馬鞭石斛等四種石斛的水提物對(duì)人宮頸癌HelaS3和肝癌HepG2細(xì)胞的體外抑制作用,結(jié)果表明,四種石斛水提物對(duì)HelaS3和HepG2細(xì)胞均有不同程度的細(xì)胞毒性作用,且在所選濃度范圍內(nèi)對(duì)劑量和時(shí)間有依賴性。同時(shí),激光掃描共聚焦顯微觀察HelaS3和HepG2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞正處于凋亡期,從而從形態(tài)學(xué)驗(yàn)證了其抑瘤作用。張丹丹等[46]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)霍山石斛多糖DHP-2處理過的胃癌細(xì)胞SGC-7901形態(tài)發(fā)生固縮,凋亡效果顯著,不僅能明顯下調(diào)原癌基因cmyc的表達(dá),表達(dá)僅為對(duì)照的42.34%。同時(shí),能顯著抑制癌基因野生型p53的表達(dá),其表達(dá)比對(duì)照高1.04倍。到目前為止,關(guān)于霍山石斛的抗腫瘤作用研究還局限于體外活性篩選,因此有必要開展霍山石斛體內(nèi)抗腫瘤作用試驗(yàn),對(duì)其活性進(jìn)行深入的研究,闡明霍山石斛的抗腫瘤作用機(jī)制。

3.1.2 增強(qiáng)免疫力 霍山石斛多糖可通過活化淋巴細(xì)胞、激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷/淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(NK/LAK細(xì)胞)等來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。首先,Zha[32]和Hsieh[34]等證實(shí)了霍山石斛水溶性總多糖具有促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、白介素10(IL-10)等細(xì)胞因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等造血生長(zhǎng)因子的功能,并通過分離純化、結(jié)構(gòu)表征和構(gòu)效關(guān)系的研究表明,石斛多糖發(fā)揮免疫增強(qiáng)活性需要適度的乙?；?。李勝立等[47]通過研究霍山石斛類原球莖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)活性的有效部位及其毒理安全性評(píng)價(jià),認(rèn)為其具有免疫調(diào)節(jié)活性的有效部位為石斛多糖,且該多糖無毒、無致突變作用。陳程等[19]對(duì)不同發(fā)育階段的霍山石斛多糖組分(其單糖組成具有差異)的體外免疫活性實(shí)驗(yàn)表明,其不同發(fā)育階段霍山石斛多糖的免疫活性卻無顯著性差異,具有相似的促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的作用。Li等[38]實(shí)驗(yàn)證實(shí)霍山石斛多糖組分DHP-4A具有免疫活性,可以通過激活p38、ERK、JNK和NF-κB的核易位顯著地刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α、白介素-6(IL-6)和IL-10。可以看出,國(guó)內(nèi)外對(duì)霍山石斛多糖的研究主要側(cè)重于對(duì)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞、體液免疫、細(xì)胞因子誘生等方面,而對(duì)免疫系統(tǒng)中各種細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信息傳遞,受體和它們的控制基因的發(fā)生、分化和表達(dá)過程許多機(jī)制尚未闡明。

3.1.3 抗氧化 目前,普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激與衰老、神經(jīng)病變、糖尿病、心血管疾病和癌癥密切相關(guān),從霍山石斛中分離純化的石斛多糖對(duì)此類疾病的治療有輔助作用。查學(xué)強(qiáng)等[48]比較了霍山石斛和鐵皮石斛多糖的清除自由基的能力,結(jié)果表明霍山石斛多糖具有更強(qiáng)的抗氧化活性能力。Tian等[40]實(shí)驗(yàn)證實(shí)低分子量霍山石斛多糖組分DHP1A(分子量6.70 kDa)也具有抗氧化活性。而郝杰等[49]對(duì)不同分子量霍山石斛多糖的抗氧化效果進(jìn)行研究,結(jié)果表明,不同相對(duì)分子量的多糖,在不同抗氧化體系中,其抗氧化活性差異顯著,大分子量的多糖具有更好的抗氧化活性。已有研究表明霍山石斛多糖均具有較顯著的抗氧化效果,其抗氧化效果的大小與石斛的種類、多糖的純度、分子量的大小等因素相關(guān)。同時(shí),對(duì)于鐵皮石斛,鮑素華等[50]研究認(rèn)為不同相對(duì)分子質(zhì)量鐵皮石斛多糖均有抗氧化活性,且抗氧化能力與其相對(duì)分子質(zhì)量大小有關(guān),在其研究中,鐵皮石斛多糖分子量小于35.3 kDa或大于74.4 kDa的生物活性更高。綜上分析表明,霍山石斛多糖具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基、超氧自由基、H2O2和羥基自由基的能力,并具有顯著的還原力和抑制Fe2+-VC誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化,可以從不同角度改善細(xì)胞健康。

3.2 降血糖及抗白內(nèi)障

糖尿病是一種由于缺乏胰島素、胰島素抵抗引起的代謝疾病,其常伴有視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、神經(jīng)病變、腎病、心血管疾病等并發(fā)癥。Pan[32]和李秀芳等[51]以四氧嘧啶為誘導(dǎo)劑建立糖尿病小鼠模型,比較霍山石斛(DHP)與4種藥典石斛多糖(鐵皮石斛DOP、金釵石斛DNP、流蘇石斛DFP和鼓槌石斛DCP)的降血糖活性差異,研究發(fā)現(xiàn),DHP、DOP、DNP三種多糖可顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)和糖化血清蛋白(GSP),同時(shí)提高血清胰島素(INS)的水平,組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)DHP、DOP、DNP可修復(fù)或減緩胰島的損傷,從而證實(shí)DHP、DOP、DNP具有降血糖的效果,且霍山石斛多糖降血糖作用最為顯著。何苗[52]的研究表明,霍山石斛膠囊可顯著減少糖尿病(DM)大鼠的飲水、飲食及排泄量,有效改善DM大鼠“三多一少”的病癥;可降低DM大鼠的血糖水平和血清甘油三脂、膽固醇和游離脂肪酸水平,調(diào)節(jié)胰島素水平;可修復(fù)胰島B細(xì)胞,改善細(xì)胞形態(tài),增加B細(xì)胞數(shù)量,從而刺激胰島素分泌,有效調(diào)節(jié)血糖水平。同時(shí)羅建平課題組[53-54],使用糖尿病型大鼠白內(nèi)障模型,對(duì)霍山石斛抗白內(nèi)障活性化學(xué)成分進(jìn)行研究,表明霍山石斛多糖可以顯著抑制白內(nèi)障的形成和發(fā)展,進(jìn)一步的藥理實(shí)驗(yàn)表明,霍山石斛多糖可以從下調(diào)一氧化氮合酶基因表達(dá)和上調(diào)谷胱甘肽家族抗氧化酶活性兩方面,協(xié)同抑制晶狀體蛋白的糖基化交聯(lián)變性,從而抑制晶狀體的渾濁進(jìn)程并延緩白內(nèi)障的發(fā)生。因而,霍山石斛多糖是一種良好的糖尿病性白內(nèi)障防治藥物,它能從氧化途徑和蛋白糖基化途徑同時(shí)抑制晶狀體渾濁進(jìn)程。藥用石斛是一類具有明目的傳統(tǒng)中藥材,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載,同時(shí)清睛粉中也含有石斛成分,因而霍山石斛多糖抗白內(nèi)障活性、作用機(jī)理和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有較大的研發(fā)空間。

3.3 保護(hù)肝臟

目前,酒精性肝損傷已成為僅次于肝炎病毒導(dǎo)致肝損傷的第二大病因,對(duì)酒精性肝損傷的防治直接關(guān)系到人類的健康安全。孟海濤等[55]以亞急性酒精性肝損傷小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行研究,明確多糖是霍山石斛抗小鼠亞急性酒精性肝損傷的功能因子。其中,水提粗多糖各個(gè)劑量組均可顯著改善肝臟組織損傷和脂肪變性,降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,提高血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量,增強(qiáng)肝組織乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,降低肝組織谷胱甘肽(GSH)損耗,抑制肝組織丙二醛(MDA)含量增加。在不同提取物中,霍山石斛水提醇溶物抗亞急性酒精性肝損傷的活性最差,水提物、醇沉物、冷凍干燥物均具有一定的肝損傷保護(hù)活性。王鳳華等[56]證實(shí)霍山石斛水提取物可降低酒精對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用,其作用機(jī)制可能是通過介導(dǎo)NF-κB/p65和p38 MAPK發(fā)揮抗氧化、抗炎作用來實(shí)現(xiàn)的。錢明雪等[57]分析了6種石斛多糖(霍山石斛、鐵皮石斛、流蘇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛和細(xì)莖石斛)對(duì)亞急性酒精性肝損傷的干預(yù)效果,結(jié)果表明,6種石斛多糖的酒精性肝損傷保護(hù)活性存在差異,霍山石斛對(duì)緩解酒精性肝損傷的效果最好,其中DHP、DOP、DFP能夠抑制小鼠肝組織P4502E1 mRNA的表達(dá),DHP和DOP對(duì)小鼠肝組織TNF-α、IL-1 mRNA表達(dá)的具有更強(qiáng)的抑制作用。田長(zhǎng)城等[58]用四氯化碳(CCl4)構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型,評(píng)價(jià)霍山石斛不同多糖成分的保肝作用。結(jié)果表明,DHP1多糖組分可以有效增強(qiáng)小鼠肝組織對(duì)CCl4毒性的抵抗,降低CCl4誘導(dǎo)的血清中谷丙酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的升高,抑制肝組織中丙二醛(MDA)的過量表達(dá),同時(shí)對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性呈現(xiàn)恢復(fù)作用,表現(xiàn)出良好的預(yù)防肝損傷作用。進(jìn)一步分析表明,DHP1A的攝入可以有效降低CCl4肝損傷中各項(xiàng)生化指標(biāo)的升高,同時(shí),降低丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的產(chǎn)生。DHP1A進(jìn)一步調(diào)節(jié)小鼠肝臟內(nèi)各種炎性分子的表達(dá),如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL)-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-11、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-2和CD68。此外,DHP1A還能夠干擾CCl4誘導(dǎo)的核因子(NF)-kB的激活,從而緩解小鼠的肝損傷[59]?？梢钥闯龌羯绞嗵悄軌蛴行г鰪?qiáng)對(duì)酒精性肝損傷、化學(xué)性肝損傷的抵抗能力,是一種潛在的保肝成分,同時(shí)其發(fā)揮作用的機(jī)制與抗氧化損傷和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)有關(guān),而活性多糖的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)理有待更深入研究。

3.4 其他功能活性

霍山石斛多糖除了具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保護(hù)肝臟及抗白內(nèi)障等功能活性外,文獻(xiàn)報(bào)道霍山石斛多糖還具有降血脂、抗糖基化和抗疲勞等作用。例如,張靜等[60]研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛膠囊能夠調(diào)節(jié)血脂代謝異常,增強(qiáng)抗氧化能力,具有防治脂肪肝和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。肖婧婧[37]的研究表明,霍山石斛多糖DHPD1和DHPD2,具有抗蛋白質(zhì)非酶糖基化的活性,能夠抑制糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的形成,它與糖尿病慢性并發(fā)癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。夏云建等[61]研究表明,霍山石斛多糖具有抗疲勞的作用,能夠顯著延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間,降低運(yùn)動(dòng)后小鼠的乳酸累積,降低血清尿素氮和丙二醛水平,增加運(yùn)動(dòng)后小鼠的肝糖原儲(chǔ)備值。Wu等[62]研究表明,霍山石斛多糖抑制IL-5、IL-13、IFN-γ和TGF-β1等細(xì)胞因子的分泌、改善過敏性皮膚炎患者的體征和癥狀。霍山石斛的藥理研究在近十年來取得一定的進(jìn)展,尤其針對(duì)多糖的研究,取得了可喜的成果,但目前研究?jī)H局限于初步的活性篩選和藥效驗(yàn)證,對(duì)作用機(jī)制研究涉及不深,更少見臨床的規(guī)范研究。

4 霍山石斛多糖消化、代謝研究進(jìn)展

隨著藥代動(dòng)力學(xué)和腸吸收方法的不斷發(fā)展和創(chuàng)新,多糖的吸收研究也取得了突破性進(jìn)展。消化和酵解作為吸收的關(guān)鍵步驟,是使食品變成能被機(jī)體吸收的物質(zhì),進(jìn)而在機(jī)體發(fā)揮其相應(yīng)功能的過程,因此,對(duì)物質(zhì)消化行為的研究成為了國(guó)際研究的熱點(diǎn)。多糖作為大分子糖類,一般認(rèn)為它難以在胃腸道中被人體消化和吸收,常被用作藥物的保護(hù)涂層[63]。多糖的主要代謝途徑是:通過腸道微生物在結(jié)腸處發(fā)生酵解作用,產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸,如乙酸、丙酸和丁酸[64]。目前,關(guān)于石斛多糖的消化吸收研究還很少,李凡[65]和Xie[66]等研究表明,霍山石斛多糖(DHP-2A,分子量1.78×106Da)經(jīng)口服作用進(jìn)入胃腸道后發(fā)生降解作用,生成一個(gè)可以在胃腸道中穩(wěn)定存在的霍山石斛多糖片段(分子量1.17×104Da)?；羯绞嗵?DHP-2A)在胃腸道中降解的研究表明,霍山石斛多糖(DHP-2A)在體外胃液中發(fā)生降解生成一個(gè)穩(wěn)定存在的片段且其保留時(shí)間與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,但其在體外唾液、腸液中很穩(wěn)定,說明霍山石斛多糖(DHP-2A)降解的部位是小鼠的胃,最終可以通過吸收作用進(jìn)入血液。張冠亞[67]對(duì)鐵皮石斛多糖體外模擬胃腸道消化的研究表明,唾液不能改變多糖的分子量和還原糖含量,在模擬胃中和模擬腸道中,多糖的分子量降低,從(314.51±6.09) kDa分別減小到(244.79±2.99) kDa和(229.91±1.59) kDa,同時(shí)還原糖含量增加,反應(yīng)后的消化液經(jīng)過透析并沒有檢測(cè)到單糖的產(chǎn)生,表明消化過程中沒有單糖的產(chǎn)生,同時(shí)多糖的整體結(jié)構(gòu)并沒有受到破壞,胃和小腸并不能消化多糖。最終發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖的糖苷鍵連接被人體腸道菌群破壞,促進(jìn)結(jié)腸發(fā)育、改善腸道功能和加速腸道蠕動(dòng)。可以看出,關(guān)于不同石斛多糖在胃腸道吸收機(jī)制存在一定差異,有待進(jìn)一步深入研究,為后續(xù)多糖在體內(nèi)發(fā)揮功效提供理論基礎(chǔ)。

5 霍山石斛產(chǎn)品開發(fā)

5.1 霍山石斛保健食品開發(fā)利用現(xiàn)狀

目前,《中國(guó)藥典》收錄的胃安膠囊、陰虛胃痛顆粒,是以石斛為主藥,以胃腸道疾病為主治的中成藥,同時(shí)收錄的石斛夜光丸,具有滋陰補(bǔ)腎,清肝明目的功效[2]。而脈絡(luò)寧注射液、清睛粉等均含有石斛成分。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的國(guó)內(nèi)保健品目錄和進(jìn)口保健品目錄,目前有5種石斛(霍山石斛、鐵皮石斛、金釵石斛、銅皮石斛、細(xì)莖石斛)被開發(fā)成保健食品,它們分別是霍山石斛(3種劑型,2個(gè)品牌)、鐵皮石斛(10種劑型,43個(gè)品牌)和金釵石斛(4種劑型,5個(gè)品牌),其余均為一個(gè)產(chǎn)品。其中,以霍山石斛為主要原料的保健食品的具體情況為:九仙尊霍山石斛股份有限公司開發(fā)的霍山石斛清養(yǎng)顆粒(國(guó)食健字G20130623)、清養(yǎng)浸膏(國(guó)食健字G20140033);安徽永生堂藥業(yè)有限責(zé)任公司開發(fā)的科苑R霍山石斛膠囊(衛(wèi)食健字(2001)第0012號(hào))?？梢钥闯?霍山石斛為原料開發(fā)出的保健品劑型種類和保健功能遠(yuǎn)低于鐵皮石斛,不能滿足客戶對(duì)不同劑型和功能的需求,因此在霍山石斛類產(chǎn)品的深度開發(fā)和綜合利用方面還有待加強(qiáng)。

5.2 產(chǎn)品安全性和功能評(píng)價(jià)

目前,霍山石斛類產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,霍山石斛類原球莖多糖無毒,無致突變作用;霍山石斛莖(人工栽培),無急性毒性、亞急性毒性和致突變作用,在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi),霍山石斛屬安全性保健食品原料。張煒玲等[68]將200只健康雌性小鼠分為5個(gè)試驗(yàn)組,每組分空白對(duì)照、低、中和高(0.5、1.0、3.0 g/(kg·bw))4個(gè)劑量組的劑量連續(xù)灌胃給藥30 d,完成復(fù)方霍山石斛浸膏增強(qiáng)免疫力的研究,不同劑量組均可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化作用,可促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)和血清溶血素水平,增強(qiáng)小鼠的單核-腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、碳廓清能力和NK細(xì)胞的活性。吳文華等[69]參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》要求,分別對(duì)不同劑量組的小鼠進(jìn)行細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性測(cè)定。結(jié)果表明,復(fù)方霍山石斛含片具有增強(qiáng)免疫力的作用,其細(xì)胞免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能為陽性,體液免疫功能和NK細(xì)胞活性為陰性。與此同時(shí)陳鋒等[70]研究表明,該復(fù)方霍山石斛含片具有清咽功能。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[71-73],霍山石斛可以深度開發(fā)石斛多糖方面的保健品或藥品,具備抗氧化、輔助降血糖、清咽潤(rùn)喉和保護(hù)肝臟等功效。

6 結(jié)論與展望

近些年來,針對(duì)霍山石斛多糖活性的研究已成為研究熱點(diǎn),近50年來霍山石斛在組織快繁、化學(xué)成分和藥理活性等研究方面取得了很大的進(jìn)展,為規(guī)?；乱吧耘嗵峁┝己玫募夹g(shù)保障,從而在根本上改善因野生霍山石斛資源瀕臨滅絕導(dǎo)致材料缺乏、成本昂貴等研發(fā)和加工問題。值得注意的是,目前分離純化的霍山石斛均一多糖,基本上來源于霍山石斛懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系及圓球莖,而對(duì)于霍山石斛原藥材中多糖的研究,目前尚停留在提取及含量測(cè)定階段,很少有關(guān)于霍山石斛原藥材的多糖分離、鑒定等報(bào)道。目前,Zha[32]研究表明,霍山石斛類原球莖總多糖的組分和生物活性均與野生霍山石斛相當(dāng),主要組分和主要活性組分均為HPS-1。而陳乃東等[21]對(duì)霍山石斛、銅皮石斛多糖的研究表明,試管苗途徑植株的多糖從單糖種類到含量,與野生植株明顯不同,試管苗時(shí)期內(nèi)生真菌的缺失可能是重要原因。王娣等[74]研究表明,內(nèi)生菌SH-01對(duì)霍山石斛試管苗的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用,但對(duì)主要有效成分石斛多糖和生物堿的積累并沒有影響。因此,針對(duì)從原藥材中分離純化活性多糖工作有待進(jìn)一步加強(qiáng),明確不同原材料對(duì)多糖特性的影響。

當(dāng)前,霍山石斛的綜合利用主要集中在中藥保健品,如霍山石斛楓斗、石斛顆粒、石斛浸膏等,但其開發(fā)深度遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需求,應(yīng)加強(qiáng)深度開發(fā),以滿足不同人群對(duì)霍山石斛產(chǎn)品的養(yǎng)生保健需求。然而,大多數(shù)保健食品只停留在霍山石斛整體功能上,其中的天然活性物質(zhì)的開發(fā)利用的深度和廣度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,基本還多處于提取和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析上,同時(shí)多糖進(jìn)入體內(nèi)的變化過程及發(fā)揮作用的機(jī)制,及更多的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)也需進(jìn)一步開展。因此,未來的研究應(yīng)注重四方面工作:一是加強(qiáng)霍山石斛原藥材多糖的分離純化,用均一多糖進(jìn)行藥理活性和作用機(jī)理研究;二是加強(qiáng)霍山石斛多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究,并在一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)層次上開展藥用石斛多糖的構(gòu)效關(guān)系研究,為后期深入開發(fā)霍山石斛類中成藥做準(zhǔn)備;三是霍山石斛多糖的體內(nèi)消化穩(wěn)定性研究,探索其在胃腸道中的降解和吸收機(jī)制;四是進(jìn)一步完善霍山石斛產(chǎn)品的安全性和毒理學(xué)評(píng)價(jià)。