(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河南南陽 473061)

馬鞭草(VerbenaofficinalisL.)為馬鞭草科植物馬鞭草的干燥地上部分,馬鞭草作為傳統(tǒng)中藥,收錄于《中國藥典》之中,具有活血散瘀、解毒、利水消腫、退黃、截瘧等功效[1-2],在臨床上廣泛用于治療白喉、瘧疾等癥狀?！吨袊幍洹?015版將馬鞭草中齊墩果酸和熊果酸作為馬鞭草質(zhì)量控制的主要指標(biāo),但是馬鞭草中還存在多種化學(xué)成分如:黃酮類、揮發(fā)油類、環(huán)烯醚萜類、糖類等[3-4]。這些化學(xué)成分也具有顯著的活性作用,故亟需對其理化性質(zhì)及生物活性進(jìn)行研究分析。其中黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物,具有抗炎、抗病毒、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等作用[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鞭草 購于河南省藥材公司,并經(jīng)鑒定為VerbenaOfficinalisL.全草;蘆丁 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司,純度>99%;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH· Sigma);鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、抗壞血酸、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁 均為國產(chǎn)分析純,使用前未進(jìn)一步純化,水為蒸餾水。

JHBE-50S閃式提取器 河南金鼎科技有限公司;Lab Tech UV-BlueStra紫外可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司;BS210S電子分析天平 北京賽多利斯公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁為對照品,精密稱取105 ℃下干燥至恒重的蘆丁0.0200 g,用少量70%的乙醇溶解,定容于100 mL容量瓶中,搖勻,其質(zhì)量濃度為0.2000 g·L-1。分別移取蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、0.4、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL比色管中,加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,充分搖勻,靜置6 min。再加入4%的NaOH溶液4 mL,混勻后用70%的乙醇定容至刻度,搖勻并放置15 min,以試劑空白為對照,用1×1 cm的比色皿在507 nm處測定吸光度[19]。以蘆丁濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:y=11.53x-0.0059,R2=0.9989。表明蘆丁對照品溶液在10.00～60.00 μg/mL范圍內(nèi)濃度和吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.2 馬鞭草中總黃酮的提取及含量的測定 閃式提取馬鞭草中總黃酮的工藝流程:將自然風(fēng)干至恒重的馬鞭草粉碎后過60目篩,準(zhǔn)確稱取2.00 g置于250 mL閃式提取器中進(jìn)行閃式提取,提取液經(jīng)離心后抽濾,將濾液經(jīng)減壓濃縮至無醇味后用70%的乙醇溶液，定容至250 mL容量瓶中。

總黃酮含量的測定:采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH[19]分光光度法。準(zhǔn)確量取樣品溶液2 mL于10 mL比色管中,按照“1.2.1”中所述方法進(jìn)行操作,以試劑空白為對照,用1×1 cm的比色皿在507 nm處測定吸光度,計(jì)算馬鞭草中總黃酮的含量。

總黃酮含量(mg/g)=提取的總黃酮質(zhì)量(mg)/原料質(zhì)量(g)

1.2.3 閃式提取馬鞭草中總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn) 以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)四個(gè)因素為研究對象,以馬鞭草中總黃酮含量為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 乙醇濃度的選擇 準(zhǔn)確稱取6份已粉碎的馬鞭草樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,在固定料液比1∶30 g/mL、閃式提取時(shí)間為2 min、提取1次的條件下進(jìn)行閃式提取?？疾觳煌掖紳舛?30%、40%、50%、60%、70%、80%)對總黃酮含量的影響。

1.2.3.2 料液比的選擇 準(zhǔn)確稱取6份粉碎的馬鞭草樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,在固定乙醇濃度60%、提取時(shí)間為2 min、提取1次的條件下,考察料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶50 g/mL)對總黃酮含量的影響。

1.2.3.3 提取時(shí)間的選擇 準(zhǔn)確稱取6份粉碎的馬鞭草樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,固定料液比為1∶35 g/mL、乙醇濃度為60%、提取1次的條件下,考察提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min)對總黃酮含量的影響。

1.2.3.4 提取次數(shù)的選擇 準(zhǔn)確稱取5份粉碎的棗果皮樣品各2.00 g置于250 mL閃式提取器中,固定料液比為1∶35 g/mL、乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為2 min,考察提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對總黃酮含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 采用Box-Behnken的中心組合原理為依據(jù),以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為自變量,總黃酮的含量為因變量,采用4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design Expert 8.0.6軟件建立數(shù)字回歸模型,確定馬鞭草中總黃酮最佳提取工藝條件,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels tabe of response surface experiment

1.2.5 馬鞭草總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.5.1 馬鞭草總黃酮對DPPH自由基清除率的測定 將馬鞭草濃縮液加無水乙醇配制成濃度分別為5、10、20、40、60、80 μg/mL的樣品溶液。精密移取2 mL樣品溶液于試管中,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL,充分混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,以無水乙醇為空白對照,于517 nm波長處測定其吸光度[20],平行測量3次。以抗壞血酸為陽性對照,精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應(yīng)濃度,按上述方法操作。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

1.2.5.2 馬鞭草總黃酮對羥自由基清除率的測定 采用鄰二氮菲法測定羥自由基的清除率,取5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.5 mL置于10 mL的具塞試管中,加入2 mL 0.75 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS),混勻后加入1 mL 0.75 mmoL/L的FeSO4溶液,充分混勻后加入1 mL不同濃度的供試液,再加入1 mL 1% H2O2溶液,然后加蒸餾水補(bǔ)足到10 mL,混勻,在37 ℃水浴下反應(yīng)1 h,空白組既不加樣品溶液又不加H2O2,對照組加H2O2溶液而不加樣品溶液的吸光度。以于536 nm波長下測定吸光值[21]。以抗壞血酸為陽性對照,精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應(yīng)濃度,按上述方法操作。

羥自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin 8.0及Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度的選擇 圖1表明,當(dāng)乙醇濃度在30%～50%之間,馬鞭草中總黃酮含量隨乙醇濃度的增加而增大;當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大,繼續(xù)增加乙醇濃度時(shí),總黃酮含量下降。原因可能是隨著乙醇濃度增大,黃酮類化合物達(dá)到飽和,由于醇溶性雜質(zhì)“色素”等親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加,與黃酮類化合物競爭同溶劑結(jié)合,從而導(dǎo)致黃酮的提取含量下降[23]。因此本實(shí)驗(yàn)選取乙醇濃度為40%、50%、60%進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on content of total flavonoids

2.1.2 料液比的選擇 馬鞭草中總黃酮的含量隨著料液比的增加而逐漸增加且趨于平緩。原因有可能是:料液比過小,黃酮類化合物溶解不充分;料液比過大,則樣品中一些非黃酮類的化合物溶解度增大,與黃酮類化合物競爭性溶出,從而使其含量趨于平緩,由于提取液體積的增大會(huì)增加蒸發(fā)濃縮的能耗和工耗,為降低成本,因此選擇料液比1∶30、1∶35、1∶40 g/mL三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 料液比對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of the ratio of water to materials on content of total flavonoids

2.1.3 提取時(shí)間的選擇 由圖4可知,在2 min時(shí),總黃酮含量最高,在此之后總黃酮含量隨時(shí)間的延長逐步下降,原因可能是隨著時(shí)間的延長,閃式提取過程中發(fā)熱,有利于總黃酮的溶出,但是黃酮類物質(zhì)在長時(shí)間高溫下會(huì)受到一定程度的破壞,因此提取量出現(xiàn)下降趨勢?？紤]到閃式提取一次提取時(shí)間最長不超過2 min，時(shí)間長于2 min時(shí)，需要連續(xù)多次提取，且在1 min時(shí)的總黃酮含量與2.5 min時(shí)基本上一致，故選擇提取時(shí)間1、1.5、2 min三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 提取時(shí)間對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of extracting time on content of total flavonoids

2.1.4 提取次數(shù)的選擇 由圖4可知,隨著提取次數(shù)的增加,多酚的含量逐漸增大且趨于平緩,但溶劑的消耗量增大,同時(shí)增加蒸發(fā)濃縮的能耗和工耗,為降低成本,考慮到效益諸多方面的因素,故選擇提取次數(shù)為1次、2次、3次三個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 提取次數(shù)對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction times on content of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 采用Box-Behnken的中心組合原理為依據(jù),以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為自變量,總黃酮的含量為因變量,采用4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Design Expert8.0.6軟件建立數(shù)字回歸模型,確定馬鞭草中總黃酮最佳提取工藝條件,結(jié)果見表2。得回歸方程Y=8.13+0.32A+0.46B+0.48C+0.16D+0.39BC-1.15A2-1.06B2-1.18C2-1.13D2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression and variance

模型中因素一次項(xiàng)B和C,二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2對馬鞭草總黃酮含量有極顯著的影響(p<0.001),一次項(xiàng)A、交互相BC對馬鞭草總黃酮的含量有高度顯著影響(p<0.01),一次項(xiàng)D對馬鞭草總黃酮的含量有顯著影響(p<0.05),各因素對馬鞭草中總黃酮含量的影響依次為:提取時(shí)間(C)>料液比(B)>乙醇濃度(A)>提取次數(shù)(D)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化 響應(yīng)曲面坡度越陡峭,說明響應(yīng)值對于該因素的改變越敏感,而曲面坡度越平滑,該因素的改變對響應(yīng)值的影響也就越小,各因素交互作用對馬鞭草中總黃酮含量影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖5所示。提取時(shí)間和料液比兩個(gè)因素隨取值的變化,其效應(yīng)曲面線變化比較陡峭,表明這兩個(gè)因素對馬鞭草總黃酮的提取的交互影響作用顯著,乙醇濃度和料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間、乙醇濃度和提取次數(shù)、料液比和提取次數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)對總黃酮含量的交互影響作用不顯著,這與表3中交互項(xiàng)值的分析一致。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of interaction of various factors

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

通過回歸模型得出馬鞭草中總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度51.6%,料液比為1∶36.3 (g/mL),提取時(shí)間為1.51 min,提取次數(shù)為2次,在此條件下,總黃酮的含量為8.280 mg/g,綜合考慮將其最佳工藝條件調(diào)整為乙醇濃度50%,料液比為1∶35 (g/mL),提取時(shí)間為1.5 min,提取次數(shù)為2次,以此條件進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn),測得馬鞭草中總黃酮的含量為(8.282±0.003) mg/g,RSD=0.29%,由此可說明模型和方法的可行性和有效性良好。

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力 不同濃度的馬鞭草總黃酮提取液與VC溶液對DPPH自由基清除能力如圖6所示。從圖6中可以看出,馬鞭草總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而升高,當(dāng)其濃度為60 μg/mL時(shí),清除率達(dá)到74.8%,此后,清除率基本保持不變。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),陽性對照物抗壞血酸在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除能力始終高于馬鞭草總黃酮。

圖6 不同濃度的馬鞭草總黃酮和抗壞血酸對DPPH·的清除率Fig.6 DPPH·scavenging activities of VC and total flavonoids

2.4.2 馬鞭草總黃酮對羥自由基的清除能力 不同濃度的馬鞭草總黃酮提取液與VC溶液對羥自由基清除能力如圖7所示。馬鞭草總黃酮對羥自由基具有一定的抑制能力，但不如VC,當(dāng)馬鞭草總黃酮濃度為60 μg/mL時(shí),清除率為43.2%,此后,隨著濃度的增加,清除率基本保持不變。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),陽性對照物抗壞血酸對DPPH自由基的清除能力始終高于馬鞭草總黃酮。

圖7 不同濃度的馬鞭草總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的清除率Fig.7 ·OH scavenging activities of VC and total flavonoids

圖8 不同濃度的馬鞭草總黃酮和抗壞血酸對自由基的清除率 activities of VC and total flavonoids

3 結(jié)論

通過采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草中總黃酮的閃式提取工藝,以馬鞭草中總黃酮含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到最佳提取工藝條件為:乙醇濃度50%,料液比為1∶35 (g/mL),提取時(shí)間為1.5 min,提取次數(shù)為2次,在此條件下,總黃酮含量達(dá)到(8.282±0.003) mg/g,與模型預(yù)測值8.280 mg/g相近。與該方法可為馬鞭草中總黃酮的研究提供一定的基礎(chǔ)。馬鞭草中總黃酮抗氧化活性試驗(yàn)表明隨著馬鞭草中總黃酮含量的增多,其抗氧化活性在一定范圍內(nèi)不斷增加,為其在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)天然抗氧化劑提供一定的理論依據(jù)。