王泉宇

【摘要】? ? 根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，雖然已經(jīng)有安全有效的抗病毒藥物與高效的保護(hù)性疫苗，慢性乙型肝炎仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。在目前的治療條件下，完全治愈幾乎不可能，終生治療往往是必須的。近些年來對乙型肝炎病毒生命周期和宿主免疫反應(yīng)的新認(rèn)識，使藥物治療的目標(biāo)靶點進(jìn)一步擴(kuò)展，使乙肝的治療有了更多的可能性。然而，在平衡功效和安全性的同時創(chuàng)造協(xié)同效應(yīng)仍然是一個明顯的挑戰(zhàn)。本篇文章回顧了各種聯(lián)合治療方法，強調(diào)了每種潛在策略的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)?？偟膩碚f，聯(lián)合治療是治療的下一步，是實現(xiàn)有限持續(xù)時間和持久終點治療的關(guān)鍵策略。

【關(guān)鍵詞】? ? 乙肝? ? 藥物治療

一、背景：

乙肝即乙型病毒性肝炎，是由乙型肝炎病毒（HBV）所引起的一種傳染病。臨床表現(xiàn)為乏力、黃疸、消化道癥狀、肝脾腫大、肝區(qū)疼痛、肝掌及蜘蛛痣等，并可能引起并發(fā)癥（慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等），在臨床上是常見的感染性疾病。此病廣泛流行于世界各國，全球約有2.57億人感染乙型肝炎病毒，主要感染者為兒童和青少年。此病為我國危害最大，流行最廣泛的一種傳染病。

HBV是DNA病毒，有雙鏈、環(huán)形、不完全閉合的基因組。該病毒通過與感染者的血液或其它體液接觸傳播。如果HBV在人體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，將會導(dǎo)致肝臟病變，甚至?xí)l(fā)展為肝癌、肝硬化等嚴(yán)重疾病，給患者的身心健康造成極大的傷害。

HBV DNA是cccDNA（共價閉合環(huán)狀的雙鏈DNA），cccDNA作為轉(zhuǎn)錄所有病毒RNA的模板，包括前基因組RNA（pgRNA）因此在病毒生命周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用。cccDNA有兩種來源：傳入的病毒離子和從肝細(xì)胞胞質(zhì)中回收包被的DNA。cccDNA的半衰期較長，因此解釋了為什么HBV感染很難治愈以及為什么HBV可以在清除乙肝表面抗原（HBsAg）多年后，自發(fā)地或在免疫抑制后重新激活。

二、HBV感染的流行情況

全球有2.57億人，占全球人口的3.5%有HBV感染。非洲和西太平洋地區(qū)占感染者的68%。世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，在2015年，全球有將近134萬人死于乙肝。不經(jīng)治療，HBV和丙型肝炎病毒（HCV）感染可導(dǎo)致肝硬化（72萬人死亡）和肝癌（47萬人死亡）。病毒性肝炎的死亡率自2000年以來已上升了22%。在2015年，全球普通人群HBV感染率為3.5%，患病率最高的地區(qū)是非洲（6.1%）和西太平洋地區(qū)（6.2%）。2015年，乙型肝炎導(dǎo)致88.7萬人死亡，大多死于并發(fā)癥（包括肝硬化和肝細(xì)胞癌）。

三、HBV感染

慢性HBV感染過程可以根據(jù)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）濃度、血清中HBV DNA水平和乙型肝炎e抗原（HBeAg）狀態(tài)這三種臨床參數(shù)分為四個階段：第一個階段的特征是存在HBeAg，血清中擁有高水平HBV DNA，但是ALT水平正常。它被稱為“免疫耐受”階段。[1]

在ALT水平升高時，就來到了免疫耐受期之后的“HBeAg陽性免疫活性”階段。經(jīng)過變化的時間間隔，發(fā)生了從HBeAg到乙肝e抗體的血清轉(zhuǎn)換，而且大多數(shù)病人轉(zhuǎn)換到了“非活性載體”階段，在此期間，ALT水平恢復(fù)正常，并且血清HBV DNA水平很低或者不可檢測。在一些患者中，經(jīng)過數(shù)年或者數(shù)十年的治療之后，血清HBV DNA和ALT水平再次升高，這些患者被認(rèn)為進(jìn)入了“HBeAg陰性免疫活性”階段。

有些患者自發(fā)清除了HBsAg，但這種情況很少見，每年只有0.5%-1%的發(fā)生率。大部分清除了HBsAg的患者的血清中檢測不到HBV DNA，但在部分患者的血清中和所有患者的肝臟中都存在HBV DNA。

四、乙型肝炎病毒治療現(xiàn)狀

慢性乙型肝炎的最終臨床結(jié)果需要檢測：生化（ALT標(biāo)準(zhǔn)化）、病毒學(xué)（抑制血清HBV DNA）、血清學(xué)（HBeAg和/或HBsAg丟失伴或不伴隨血清轉(zhuǎn)化成乙型肝炎e抗體和抗HBs）和組織學(xué)的（肝纖維化病人中炎癥壞死是否會改善）標(biāo)記物。它們被用作臨床結(jié)果：肝硬化、肝失代償、肝癌的評估依據(jù)。

五、藥物治療

最近的重大科學(xué)發(fā)現(xiàn)使人們能夠更好地了解乙肝病毒的生命周期，主要有兩類抗病毒療法被批準(zhǔn)用于治療乙型肝炎：干擾素和NAs。當(dāng)下藥物治療的原理可以分為以下：識別乙肝病毒進(jìn)入的細(xì)胞受體、有關(guān)參與CCCDNA形成的關(guān)鍵核酶及其表觀遺傳學(xué)控制的信息、觀察干擾素（IFN）或核因子JB信號誘導(dǎo)的部分CCCDNA降解，以及乙肝x蛋白（HBX）在HBV轉(zhuǎn)錄中的作用。

5.1阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的抑制劑可根據(jù)其作用方式分類

1.中和抗體靶向結(jié)合HBV S區(qū)抗原環(huán)或前S1區(qū)的N端抗原表位。這些抗體具有高度的特異性，但需要經(jīng)非消化道（不能吃，需要靜脈注射）給藥，大量的抗體對中和循環(huán)的亞病毒包膜顆粒是必要的。

2.附著抑制劑是結(jié)合病毒（例如肝素）或細(xì)胞硫酸肝素蛋白多糖（例如聚賴氨酸）的負(fù)電荷或正電荷藥物。

3. ?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）的底物包括結(jié)合膽鹽（例如?；悄懰猁}、依澤替米貝（降血脂藥））和其他由NTCP運輸?shù)男》肿?對受體高濃度和短半衰期的要求限制了它們的臨床應(yīng)用。

5.1.1核酸（NA）

NA對cccDNA缺乏影響。鏈終止型NAs阻斷了pgRNA對HBV DNA的逆轉(zhuǎn)錄，但對CCCDNA的產(chǎn)生、穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄影響很小。cccDNA和整合病毒基因組的持續(xù)轉(zhuǎn)錄可能解釋了盡管無法檢測到血HBV DNA水平，但在NA治療期間血清HBsAg水平下降相對較小[2]。不幸的是，目前對HBsAg的循環(huán)檢測還不能區(qū)分HBsAg和CCCDNA的轉(zhuǎn)錄和HBV DNA的整合。

5.2靶向cccDNA

5.2.1傷害性抑制

許多研究表明，盡管CCCDNA位于肝細(xì)胞核的保護(hù)區(qū)內(nèi)，但仍有可能以其為靶點。對培養(yǎng)的肝細(xì)胞的研究表明，幾種細(xì)胞因子（IFN-A、淋巴毒素-B受體激動劑、IFN-C和腫瘤壞死因子-A）都可以調(diào)節(jié)導(dǎo)致apobec3a/b脫氨酶上調(diào)的途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)CCCDNA的非肝毒性降解。然而，在這些組織培養(yǎng)研究中只實現(xiàn)了部分降解。DNA裂解酶，包括歸巢內(nèi)切酶或巨核酸酶、鋅指核酸酶、TAL效應(yīng)核酸酶和Crispr相關(guān)（Cas）核酸酶，特別針對CCCDNA，正在實驗?zāi)Ｐ椭羞M(jìn)行探索。

一些研究表明，用Crispr相關(guān)（Cas）核酸酶切割HBV DNA比用apobec介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基更有效。在進(jìn)行臨床試驗之前，需要解決這些基因編輯方法對HBV感染的肝細(xì)胞的有效傳遞，而不會產(chǎn)生非預(yù)期的靶向效應(yīng)。

5.2.2功能性抑制

病毒CCCDNA被組織成染色質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，受表觀遺傳調(diào)控，表觀基因組修飾劑可能阻斷CCCDNA轉(zhuǎn)錄活性和抑制病毒蛋白的表達(dá);但是，如果不是特定的，它們可能對宿主細(xì)胞產(chǎn)生有害影響。一些細(xì)胞因子，如IFN-A已經(jīng)在臨床前模型中證實其通過表觀遺傳修飾降低了CCCDNA轉(zhuǎn)錄。HBX已被證明是通過降解SMC5/6限制因子進(jìn)行CCCDNA轉(zhuǎn)錄和病毒復(fù)制所必需的;因此，HBX可能是一個有吸引力的病毒靶點，不僅沉默CCCDNA轉(zhuǎn)錄，而且沉默其他的一些具有HBX蛋白依賴性的病毒相關(guān)的細(xì)胞相互作用。目前檢測CCCDNA的方法缺乏特異性，需要一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法來檢測CCCDNA或CCCDNA轉(zhuǎn)錄。

5.3 IFN基因激動劑

IFN基因的刺激因子是很多胞內(nèi)DNA受體的輔助蛋白，同時它也是細(xì)菌第二信使的識別受體，可以作為天然免疫的潛在藥物靶點。IFN基因激動劑也可以作為治療或預(yù)防的輔助藥物。維甲酸誘導(dǎo)蛋白1不僅可以誘導(dǎo)干擾素和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還可以通過檢測PGRNA的ε結(jié)構(gòu)來抑制HBV的復(fù)制。

sb 9200是二核苷酸sb 9000的口服前藥，被認(rèn)為能夠激活維甲酸誘導(dǎo)蛋白1和核苷酸結(jié)合寡聚化域c。含有蛋白質(zhì)2，導(dǎo)致IFN介導(dǎo)的病毒感染細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)和土撥鼠血清中的肝炎病毒DNA和表面抗原水平下降。

5.4檢查點調(diào)控

慢性乙型肝炎缺乏T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答部分是由于共抑制受體（包括程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4淋巴細(xì)胞激活基因和粘蛋白域）過度表達(dá)而損害T細(xì)胞效應(yīng)器功能所導(dǎo)致的。白細(xì)胞介素10等免疫抑制因子也可能損害T細(xì)胞功能。最近的癌癥治療表明了用抗體阻斷這些共抑制受體的潛力。這種抑制可能逆轉(zhuǎn)乙型肝炎的免疫功能紊亂，這一點在伍德查克的研究和人類的體外研究中得到證實。這種方法的主要關(guān)注點是誘導(dǎo)可能導(dǎo)致致命的器官損傷的不受控制的肝炎爆發(fā)和自身免疫。

5.5治療性疫苗

治療性疫苗接種的目的是刺激或增強宿主免疫反應(yīng)，恢復(fù)免疫控制，從而持續(xù)抑制HBV復(fù)制，最終導(dǎo)致HBsAg丟失。對傳統(tǒng)的疫苗進(jìn)行評估，其效果都比較有限。病毒載量高的患者反應(yīng)性可能較低，肝硬化患者免疫介導(dǎo)的肝炎發(fā)作的風(fēng)險較高。采用NAS預(yù)處理抑制HBV復(fù)制，可增強HBV特異性T細(xì)胞反應(yīng)，預(yù)防耀斑。

5.6抑制HBV進(jìn)入

HBV感染首先通過其大包膜蛋白（HBL）與細(xì)胞硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）的相互作用附著在肝細(xì)胞表面，[3]隨后，HBL前S1區(qū)與NTCP、肝特異性膽鹽轉(zhuǎn)運體和最近確定了HBV的細(xì)胞受體。HBV與其受體的結(jié)合觸發(fā)了一種小窩蛋白-1介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，將病毒內(nèi)化為肝細(xì)胞。[4]HBL與宿主細(xì)胞受體和進(jìn)入因子之間相互作用的特異性破壞將選擇性地抑制HBV感染，并在多組臨床試驗中得到證實。桃葉珊瑚苷B為一種一流的乙肝病毒和丁型肝炎病毒（HDV）進(jìn)入抑制劑，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

除此之外，膽鹽類似物和環(huán)孢菌素A衍生物，也已被證明能結(jié)合NTCP并抑制肝細(xì)胞的HBV和HDV感染。然而，它們的抗病毒作用尚未在體內(nèi)動物模型中得到證實。使用NTCP基質(zhì)類似物抑制HBV/HDV感染的一個主要問題是NTCP生理功能潛在干擾膽汁酸腸肝循環(huán)。有趣的是，由于NTCP中HBV/HDV感染和膽汁酸轉(zhuǎn)運的必需氨基酸殘基重疊，但不完全相同，因此有可能開發(fā)出NTCP靶向藥物，專門抑制HBV和HDV感染，而不損害NTCP轉(zhuǎn)運膽汁酸的功能。[5]

5.7以多功能HBV聚合酶蛋白為靶點抑制HBV DNA復(fù)制

與包含逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）域和核糖核酸酶H（RNase H）域的經(jīng)典逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶不同，HBV聚合酶在其N末端區(qū)域有兩個附加域，一個末端蛋白域（TP）和一個間隔域。獨特的結(jié)構(gòu)特征是HBV聚合酶在病毒DNA復(fù)制中的附加功能。[6]

具體來說，HBV聚合酶在病毒性前體PGRNA的5區(qū)域結(jié)合一個干環(huán)結(jié)構(gòu)ε，以促進(jìn)PGRNA和聚合酶自身被包裝成核衣殼。在核衣殼內(nèi)，聚合酶通過催化位于其TP結(jié)構(gòu)域的酪氨酸羥基殘基與作為模板的dGMP之間形成磷酸二酯連接，啟動病毒DNA負(fù)鏈的合成。啟動反應(yīng)僅在三個核苷酸合成后終止，隨后在dr1序列轉(zhuǎn)移到PGRNA的3端繼續(xù)進(jìn)行。

負(fù)鏈DNA向PGRNA的5端的延伸。PGRNA同時被聚合酶的RNase H結(jié)構(gòu)域降解，但其5端區(qū)域（包括5dr1）除外，后者被轉(zhuǎn)移到負(fù)鏈DNA的dr2區(qū)域以促進(jìn)正鏈DNA的合成。顯然，HBV DNA聚合酶在包裝PGRNA、啟動和延長病毒DNA合成以及降解病毒PGRNA中起著重要作用。經(jīng)細(xì)胞核苷激酶激活后，核苷酸可與天然核苷酸底物競爭，結(jié)合到DNA引物中并拉長DNA鏈，終止病毒DNA合成。

5.8核蛋白殼裝配的抑制

如上所述，HBV DNA復(fù)制發(fā)生在核蛋白殼內(nèi)。因此，抑制核蛋白殼組裝將阻止病毒DNA復(fù)制。有趣的是，一個復(fù)制能力強的核蛋白殼的裝配依賴于細(xì)胞hsp90伴侶復(fù)合物輔助的HBV DNA聚合酶折疊和與PGRNA結(jié)合，從而觸發(fā)120個核心蛋白二聚體的補充，將PGRNA聚合酶復(fù)合物包裝成二十面體核蛋白殼。

因此，抑制hsp90的功能和阻斷或破壞病毒聚合酶、PGRNA和核心蛋白之間的相互作用應(yīng)該能抑制核蛋白殼的裝配，從而抑制HBV感染。

5.9抗病毒和免疫調(diào)節(jié)療法的結(jié)合

為了達(dá)到HBV“治愈”的目的，可能需要聯(lián)合針對HBV生命周期中多個步驟的抗病毒治療，以抑制病毒復(fù)制和病毒抗原產(chǎn)生，并通過免疫調(diào)節(jié)療法恢復(fù)對HBV的免疫應(yīng)答。因為大多數(shù)臨床評價中的抗病毒或免疫調(diào)節(jié)藥物正在進(jìn)入第i期或第ii期試驗，目前還不確定是否需要。

六、討論：

近年來人們對乙型肝炎病毒生命周期和宿主免疫反應(yīng)的有了新認(rèn)識，對于乙肝治療的藥物靶點也隨之增多，多種治療的方式使乙肝治療的可能性隨之提升。同時，由于疫苗的大范圍使用以及民眾衛(wèi)生水平的提升，對乙肝病毒的傳播得到了有效抑制。但中國作為一個乙肝大國，當(dāng)下仍然面臨著嚴(yán)峻的危機。

對于全世界而言，開展的多種治療手段相關(guān)研究雖然仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，但抗病毒和免疫療法的結(jié)合是乙肝治愈的一個大的可能性。

參? 考? 文? 獻(xiàn)

[1] Lok， A.S.， et al.， Hepatitis B cure： From discovery to regulatory approval. J Hepatol， 2017. 67（4）： p. 847-861.

[2] Seto， W.K.， et al.， Reduction of hepatitis B surface antigen levels and hepatitis B surface antigen seroclearance in chronic hepatitis B patients receiving 10 years of nucleoside analogue therapy. Hepatology， 2013. 58（3）： p. 923-31.

[3] Schulze， A.， P. Gripon， and S. Urban， Hepatitis B virus infection initiates with a large surface protein-dependent binding to heparan sulfate proteoglycans. Hepatology， 2007. 46（6）： p. 1759-68.

[4] Macovei， A.， et al.， Hepatitis B virus requires intact caveolin-1 function for productive infection in HepaRG cells. J Virol， 2010. 84（1）： p. 243-53.

[5] Tang， L.， et al.， The current status and future directions of hepatitis B antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov， 2017. 12（1）： p. 5-15.

[6] Seeger， C. and W.S. Mason， Molecular biology of hepatitis B virus infection. Virology， 2015. 479-480： p. 672-86.